使用结合EphB4的人源化抗体的癌症治疗的制作方法

专利名称：使用结合EphB4的人源化抗体的癌症治疗的制作方法
使用结合EphB4的人源化抗体的癌症治疗相关申请本申请要求2007年8月13日提交的美国临时申请号60/964，496的优先权的权 益，其全部教导以其全文引用合并入本文。
背景技术：
血管生成，新血管从预先存在的脉管系统的上皮发展，是宿主内实体瘤的生长、进 展和转移中至关重要的过程。在生理学上正常的血管生成期间，血管内皮与其周围间质组 分的自分泌、旁分泌和双重分泌(amphicrine)相互作用在空间和时间上受到紧密调节。此 外，促血管生成(proangiogenic)和抑制血管生成(angiostatic)细胞因子和生长因子的 水平和活性保持平衡。相反地，活跃的肿瘤生长所必需的病理性血管生成是持续和持久的， 代表了正常血管生成系统的失调。实体瘤和造血组织肿瘤类型特别地与高水平的异常血管 生成相关。通常认为，肿瘤的发展由连续并且相关的步骤组成，所述步骤导致具有攻击性生 长潜能的自主克隆(autonomous clone)的产生。这些步骤包括持续生长和无限的自我更 新。肿瘤中的细胞群体的特征通常在于生长信号的自足(self-sufficiency)、降低的对生 长抑制信号的敏感性以及对细胞凋亡的抗性。起始异常生长的遗传或细胞遗传事件通过阻 止细胞凋亡来支持细胞维持在延长的“稳定”状态。发明概述本申请除其他以外提供了结合EphB4的细胞外结构域的抗体，例如其修饰抗体或 抗原结合片段。修饰抗EphB4抗体或其抗原结合片段与它们的未修饰的亲本抗体相比较在 给定的物种例如人中免疫原性更低。抗体和抗原结合片段用于治疗性治疗以影响EphB4功 能，从而抑制血管生成和肿瘤生长。在一个实施方案中，本申请提供了结合EphB4的细胞外结构域的解除免疫的 (deimmunized)抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，其中各可变区与 结合EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，在构架区中具有2至20个氨基酸置换。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段具有一个或更多个来自结 合EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体的互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，互补 决定区(⑶R)中存在1至5个置换。在一个实施方案中，一个或更多个置换，与非人或亲本抗体相比较，减少了解除免 疫的抗体或其抗原结合片段中的T细胞表位的数目。在一个实施方案中，一个或更多个置 换，与非人或亲本抗体相比较，减少了解除免疫的抗体或其抗原结合片段中的B细胞表位 的数目。在一个实施方案中，一个或更多个置换，与非人或亲本抗体相比较，在解除免疫的 抗体或其抗原结合片段中导入了一个或更多个调节T细胞表位。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的重链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有20个或更少的氨基酸置换。在另一 个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的重链可变区，与结合EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有19个或更少，18个或更少，17个或更少，16个或更 少，15个或更少，14个或更少，13个或更少，12个或更少，11个或更少，10个或更少，9个或 更少，8个或更少，7个或更少的氨基酸置换。在一个实施方案中，重链可变区，与非人或亲 本抗体相比较，具有至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8 个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个氨基酸置换。在一个实施方案中，与结合EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，解 除免疫的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有20个或更少的氨基酸置换。在另一个 实施方案中，与结合EphB4的细胞外结构的非人或亲本抗体相比较，解除免疫的抗体或其 抗原结合片段的重链可变区具19个或更少、18个或更少、17个或更少、16个或更少、15个 或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个 或更少、7个或更少的氨基酸置换。在一个实施方案中、与非人或亲本抗体相比较，轻链可变 区具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、 至少10个、至少11个、至少12个、至少13个氨基酸置换。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段以与小鼠单克隆抗体 #131 (ATCC保藏号PTA-6214)相似或更大的结合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段中的置换导致抗体或抗原 结合片段的构架区和与所述构架区同源的人种系基因序列之间的序列同一性的增加。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制培养的内皮细胞形成 管。在另一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段在体内抑制组织的血管化 作用(vascularization)。在另一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段减少 小鼠中人肿瘤异种移植物(xenograft)的生长。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体 或其抗原结合片段抑制植入动物的角膜中的组织的血管化作用或植入动物的基质组织栓 (Matrigel tissue plug)的血管化作用。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结 合片段促进细胞凋亡。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的效应子功能被改变。在 另一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的效应子功能得到增强。在另一个 实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的效应子功能被减弱。在一些实施方案中， 解除免疫的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区。在一些实施方案中，除去Fc区域中的 N-糖基化。在一些实施方案中，Fc区域在N-糖基化识别序列中包含突变，从而抗体或多肽 的Fc区域未被N-糖基化。在一些实施方案中，将Fc区域PEG化。在一些实施方案中，重 链恒定区是包含下列残基的人重链IgGh恒定区位点330和331上的丝氨酸。在一些实 施方案中，重链恒定区是包含下列突变的人重链IgG4 位点233上的脯氨酸、位点234上的 缬氨酸和位点235上的丙氨酸。这些氨基酸位点基于Kabat编号。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制EphB4的二聚化或 多聚化。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制肝配蛋白B2刺激的 EphB4的自磷酸化作用。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段刺激EphB4 激酶的活性。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段结合EphB4的第一纤连蛋 白样结构域。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段结合EphB4的第二纤连蛋白样结构域。在一个实施方案中，将解除免疫的抗体或其抗原结合片段缀合至细胞毒性剂。在 一个实施方案中，细胞毒性剂选自放射性试剂、植物、真菌或细菌来源的分子例如皂草素、 生物蛋白质、长春碱、4-去乙酰长春花碱、长春新碱、异长春碱和长春地辛(vindesine)。在 某些实施方案中，将抗体或其抗原结合片段通过稳定的连接体缀合至细胞毒性剂，其在癌 细胞内释放细胞毒素剂。在一个实施方案中，与结合细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，抗体或抗原 结合片段的可变区具有2至20个氨基酸置换，其中所述非人或亲本抗体还在解除免疫的抗 体或其抗原结合片段中提供一个或更多个CDR。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其 抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中与结合EphB4的细胞外结构域的非人或 亲本抗体相比较，各可变区具有2至20个氨基酸置换，并且解除免疫的抗体或其抗原结合 片段具有一个或更多个来自所述非人或亲本抗体的互补决定区(CDR)。在另外的实施方案 中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段在人受试者中比所述非人或亲本抗体的免疫原性更 低。在一个实施方案中，非人或亲本抗体是小鼠单克隆#47或小鼠单克隆#131 ；ATCC
保藏指定编号分别为_和PTA-6214。在另外的实施方案中，重链可变区中的一个
或更多个置换在选自位点5、12、40、66、75和83 (根据Kabat编号系统)的氨基酸位点上发 生。在另外的实施方案中，重链可变区中的一个或更多个置换选自位点5上的缬氨酸、位点 12上的赖氨酸、位点40上的丙氨酸、位点66上的精氨酸、位点75上的苏氨酸和位点83上 的精氨酸，所述位点根据Kabat编号系统。在另外的实施方案中，轻链可变区中的一个或更 多个置换在选自根据Kabat编号系统的位点45、74和100的氨基酸位点上发生。在另一个 实施方案中，轻链可变区中一个或更多个置换选自根据Kabat编号系统的位点45上的赖氨 酸、位点74上的苏氨酸和位点100上的谷氨酰胺。在一个实施方案中，重链可变区包含a)选自SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO 4,SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :10 的 SEQ ID NO :13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:12 禾口 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d) 选自 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 10 氨基酸 113 至 123 的 FR4。在一个实施方案中，轻链可变区包含a)选自SEQ ID NO :6、SEQ IDN0:15和SEQ ID NO 16 的氨基酸 1 至 23 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :15 禾口 SEQ ID NO :18 的氨基酸；35 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、 SEQ ID NO 8,SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 17 的氨基酸 57 至 88 的 FR3 ；和 d)选自 SEQID NO 6 和 SEQ ID NO 15 的氨基酸 98-107 的 FR4。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含含有 SEQ ID NO 19 的 CDRl、含有 SEQ ID NO :20 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO :21 的 CDR3 ；并且其中 轻链包含含有SEQ ID NO 22的CDRl、含有SEQ ID NO :23的CDR2和含有SEQ ID NO 24的 CDR3。在另外的实施方案，解除免疫的抗体或其抗原结合片段在人受试者中比小鼠单克隆 抗体#47的免疫原性更低。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段以为小鼠单克隆抗体#47对EphB4的细胞外结构域的结合的结合亲和力的至少80%、至少90% 或至少100%的结合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制EphB4与肝配蛋白 B2的细胞外部分的结合。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制 EphB4的二聚化或多聚化。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制肝 配蛋白B2刺激的EphB4的自磷酸化作用。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原 结合片段刺激EphB4激酶的活性。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片 段结合EphB4的第一纤连蛋白样结构域。在另外的实施方案中，其结合EphB4的第二纤连 蛋白样结构域。在另外的实施方案中，将解除免疫的抗体或其抗原结合片段缀合至细胞毒性 剂。在另外的实施方案中，细胞毒素剂选自放射性试剂、植物、真菌或细菌来源的分子 例如皂草素、生物蛋白质、长春碱、4-去乙酰长春花碱、长春新碱、异长春碱和长春地辛 (vindesine)。在某些实施方案中，将抗体或其抗原结合片段通过稳定的连接体缀合至细胞 毒性剂，所述连接体在癌细胞内释放细胞毒性剂。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制培养的内皮细胞形 成管。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段在体内抑制组织的血管化 作用。在另一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段减少小鼠中人肿瘤异种移 植物的生长。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制植入动物的角 膜中的组织的血管化作用或植入动物的基质组织栓的血管化作用。在另外的实施方案中， 解除免疫的抗体或其抗原结合片段促进细胞凋亡。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的效应子功能被改变。在 另一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段效应子功能得到增强。在另一个实 施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段效应子功能被减弱。在一些实施方案中，解除 免疫的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区。在一些实施方案中，除去Fc区域中的N-糖基化。在另外的实施方案中，抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含a)选自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO =USEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3, SEQ IDNO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由选自 SEQ IDNO 1 的氨基酸113-123组成的FR4 ；并且轻链可变区包含a)由SEQ IDNO 6的氨基酸1至23组 成的 FRl，b)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9 的氨基酸 35 至 49 的 FR2 ； c)选自 SEQ ID NO 6,SEQ IDNO 7 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸 57-88 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 6的氨基酸98至107组成的FR4。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段的重链可变区包括选自a)SEQ ID NO Kb) SEQ ID N0:2、c)SEQ ID N0:3、d)SEQ ID NO :4 和 e) SEQ ID NO :5 的氨基酸序列。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含选自a)SEQ ID NO :6, b) SEQ ID N0:7、c)SEQ ID NO :8 和 d) SEQ ID NO :9 的氨基酸序列。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段的重链可变区包含选自a)SEQ ID N0:l、b)SEQ ID N0:2、c)SEQ ID NO,3, d) SEQ ID NO :4 和 e) SEQ ID NO :5 的氨基酸序列；
14并且抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含选自a)SEQ ID NO :6,b) SEQ ID N0:7、c)SEQ ID NO 8和d) SEQ ID NO :9的氨基酸序列。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO 3的氨 基酸序列，并且轻链可变区包含选自a)SEQ ID N0:7和b)SEQ ID NO :8的氨基酸序列。在另外的实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，并且轻链可变 区包含选自:a) SEQ ID N0:7和b)SEQ ID NO :8的氨基酸序列。在另外的实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，并且轻链可变 区包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段的重链可变区包含含有SEQ ID N0:25的 CDRl、含有SEQ ID NO 26的CDR2以及含有SEQ IDNO 27的CDR3 ；并且轻链可变区包含含 有 SEQ ID NO 28 的 CDRl，含有 SEQ ID NO 丨9 的 CDR2，和含有 SEQ ID NO :30 的 CDR3。在另 外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段在人受试者中比小鼠单克隆抗体#131 的免疫原性更低。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段以为小鼠单克隆抗体 # 131对EphB4的细胞外结构域的结合的结合亲和力的至少80%、至少90%或至少100%的 结合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制EphB4与肝配蛋白 B2的细胞外部分的结合。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制 EphB4的二聚化或多聚化。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制肝 配蛋白B2刺激的EphB4的自磷酸化作用。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原 结合片段刺激EphB4激酶的活性。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片 段结合EphB4的第一纤连蛋白样结构域。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原 结合片段结合EphB4的第二纤连蛋白样结构域。在另外的实施方案中，将解除免疫的抗体或其抗原结合片段缀合至细胞毒性剂。 在另外的实施方案中，细胞毒性剂选自放射放射线的化合物、植物、真菌或细菌来源的分子 例如皂草素、生物蛋白质、长春碱、4-去乙酰长春花碱、长春新碱、异长春碱和长春地辛。在 某些实施方案中，将抗体或其抗原结合片段通过稳定的连接体缀合至细胞毒素剂，所述连 接体在癌细胞内释放细胞毒性剂。在另外的实施方案中，抗体或抗原结合片段抑制培养的内皮细胞形成管。在另外 的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段在体内抑制组织的血管化作用。在另外 的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段减少小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。 在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制植入动物的角膜中的组织的 血管化作用或植入动物的基质组织栓的血管化作用。在另外的实施方案中，解除免疫的抗 体或其抗原结合片段促进细胞凋亡。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的效应子功能被改变。在 另一个实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的效应子功能得到增强。在另一个 实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的效应子功能被减弱。在一些实施方案中， 解除免疫的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区。在一些实施方案中，除去Fc区域中的 N-糖基化。
在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含a) 选自 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FR1，b)选自 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2，c)选自 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；禾口 d)选自 SEQ ID NO 10的氨基酸113至123的FR4 ；并且其中轻链可变区包含a)选自SEQ ID N0:15和SEQ ID NO 16的氨基酸1至23的FRl，b)选自SEQ ID NO 15和SEQID NO 18的氨基酸；35至49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO 15 和 SEQ IDNO 17 的氨基酸 57 至 88 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 15的氨基酸98至107组成的FR4。在另外的实施方案中，重链可变区包含选自a)SEQ ID N0:10、b)SEQ ID NO :11, c) SEQ ID NO : 12、d) SEQ ID NO :13 和 e) SEQ IDNO : 14 的氨基酸序列。在另外的实施方案中，轻链可变区包含选自a)SEQ ID N0:15、b)SEQ ID NO :16, c) SEQ ID NO 17 和 d) SEQ ID NO :18 的氨基酸序列。在另外的实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO 13的氨基酸序列，并且轻链可 变区包含选自a)SEQ ID NO :17和b) SEQ ID N0:18的氨基酸序列。在另外的实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列，并且轻链可 变区包含选自a)SEQ ID N0:17和b)SEQ ID NO :18的氨基酸序列。在另外的实施方案中， 重链可变区包含SEQ ID N0:14的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID N0:18的氨基 酸序列。在一个实施方案中，以与亲本或非人抗体相同或更大的亲和力结合EphB4的细胞 外结构域的解除免疫的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。解除免疫的 抗体或抗原结合片段具有一个或更多个下列特征a)各可变区整个来源于一个或更多个 人抗体；b)各可变区，与亲本或非人抗体相比较，具有减少的T细胞表位数目；和c)各可变 区，与亲本或非人抗体相比较，具有减少的B细胞表位数目。在一个实施方案中，各可变区 是来自一个或更多个人抗体的区段的组合物。在一个实施方案中，人抗体区段在长度上为 2至35个氨基酸。在一个实施方案中，人抗体区段不包含完整的⑶R或单个的构架区。在 另外的实施方案中，一个或更多个下列残基存在于重链可变区中位点5上的缬氨酸、位点 12上的赖氨酸、位点40上的丙氨酸、位点66上的精氨酸、位点75上的苏氨酸以及位点83 上的精氨酸，所述位点根据Kabat编号系统。在另外的实施方案中，一个或更多个下列残基 存在于轻链可变区中位点45上的赖氨酸、位点74上的苏氨酸和位点100上的谷氨酰胺， 所述位点根据Kabat编号系统。在另外的实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO 25的⑶Rl、含有SEQ ID NO 26的⑶R2和含有SEQ ID NO 27的⑶R3 ；并且轻链可变区包含含有SEQ ID NO 28的 ⑶R1、含有SEQ ID NO 29的⑶R2和含有SEQ ID NO 30的⑶R3。在另外的实施方案中， 重链可变区包含a)选自SEQ ID NO 10、SEQ ID NO :11和SEQ ID NO 13的氨基酸1至30 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 10的氨基酸113至123组成的FR4 ；并且轻链可变区包含a)选自SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 的氨基酸 1 至 23 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO 15 和 SEQID NO 18 的氨 基酸35至49的FR2 ；c)选自SEQ ID NO 15和SEQ IDNO 17的氨基酸57至88的FR3 ；和d)由SEQ ID NO 15的氨基酸98至107组成的FR4。在另一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO 19的⑶Rl、含有SEQ ID NO :20的CDR2和含有SEQ ID NO :21的CDR3 ；并且其中轻链包含含有SEQ ID NO :22的 ⑶R1、含有SEQ ID NO 23的⑶R2和含有SEQ ID N0J4的⑶R3。在另外的实施方案中，重 链可变区包含a)选自SEQ ID NO =USEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的氨基酸1至30的FRl， b)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和d)由SEQ IDNO 1的氨基酸113至123组成的FR4 ；并且轻链可变区包含a)由SEQ IDNO 6 的氨基酸 1 至 23 组成的 FR 1，b)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9的氨基酸35至49的FR2 ；c)选自SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 7和SEQ ID NO 8的氨基酸 57至88的FR3 ；和d)由SEQ ID NO 6的氨基酸98至107组成的FR4。在一个实施方案中，结合EphB4的细胞外结构域的解除免疫的抗体或其抗原结合 片段具有比从具有ATCC保藏号PTA-6214的杂交瘤获得的#131抗体的免疫原性更低并且 以与获自杂交瘤的抗体相同的或更大的亲和力结合所述结构域。在另外的实施方案中， 解除免疫的抗体或抗原结合片段的重链可变区包含含有SEQ ID NO 25的⑶Rl、含有SEQ IDNO 26的CDR2和含有SEQ ID NO 27的CDR3 ；并且轻链可变区包含含有SEQ ID NO 28的 CDR1、含有SEQ ID NO :29的CDR2以及含有SEQID NO :30的CDR3。在另外的实施方案中， 重链可变区包含a)选自SEQID NO :10、SEQ ID NO :11和SEQ ID NO 13的氨基酸1至30 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 10的氨基酸113至123组成的FR4 ；并且轻链可变区包含a)选自SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 的氨基酸 1 至 23 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO: 15 禾口 SEQ ID NO: 18 的氨 基酸35至49的FR2 ；c)由选自SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 17的氨基酸57至88组成的 FR3 ；和d)由SEQ ID NO 15的氨基酸98至107组成的FR4。在一个实施方案中，结合EphB4的细胞外结构域的解除免疫的抗体或其抗原结合 片段具有低于获自具有ATCC保藏号—的杂交瘤的#47抗体的免疫原性并且以与获自 杂交瘤的抗体相同或更大的亲和力结合所述结构域。在另外的实施方案中，解除免疫的抗 体或抗原结合片段的重链可变区包含含有SEQ ID NO 19的⑶Rl、含有SEQ ID NO :20的 CDR2和含有SEQ ID NO :21的CDR3 ；并且轻链包含含有SEQ IDNO 22的CDRl、含有SEQ ID NO 23的⑶R2和含有SEQ ID NO 24的⑶R3。在另外的实施方案中，重链可变区包含a)选 自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)选自 SEQ IDNO 1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO 1的氨基酸113至123组成的FR4 ；并且轻链可变区包含a)由SEQ ID NO 6的氨基 酸 1 至 23 组成的 FRl，b)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9 的氨基酸；35 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸 57 至 88 的 FR3 ； 和d)由SEQ ID NO 6的氨基酸98至107组成的FR4。在一个实施方案中，结合EphB4的细胞外结构域的解除免疫的抗体或抗原结合片 段具有重链可变区，所述重链可变区具有下列位点5上的缬氨酸、位点12上的赖氨酸、位点40上的丙氨酸、位点66上的精氨酸、位点75上的苏氨酸和位点83上的精氨酸中的一个 或更多个，所述位点根据根据Kabat编号系统。在另外的实施方案中，解除免疫的抗体或抗 原结合片段具有轻链可变区，所述轻链可变区具有下列位点45上的赖氨酸、位点74上的 苏氨酸以及位点100上的谷氨酰胺中的一个或更多个，所述位点根据Kabat编号系统。在一个实施方案中，提供了降低受试者中肿瘤的生长速度的方法。在另外的实施 方案中，方法包括对受试者施用治疗有效量的本文中公开的解除免疫的抗体或其抗原结合 片段。在一个实施方案中，受试者是人受试者。在一个实施方案中，肿瘤包括与可供比较的 组织的非癌性细胞相比较，表达更高EphB水平的细胞。在一个实施方案中，申请提供了促进细胞凋亡，从而治疗患有癌症的受试者的方 法。在另外的实施方案中，方法包括对受试者施用治疗有效量的本文中公开的解除免疫的 抗体或其抗原结合片段的方法。在一个实施方案中，受试者是人受试者。在一个实施方案 中，癌症包括与可供比较的组织的非癌性细胞相比，以更高的水平表达EphB4的癌细胞。 癌症可以是转移癌。在另外的实施方案中，癌症选自结肠癌、乳腺癌、间皮癌、前列腺癌、鳞 状上皮细胞癌(squamous cell carcinoma)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、卵巢癌和白血 病。在一个实施方案中，癌症是血管生成依赖性癌症或不依赖于血管生成的癌症。在一个 实施方案中，可将抗体或抗原结合片段与一种或更多种额外的抗癌化学治疗剂共施用，所 述化学治疗剂以累加或协同的方式与抗体或抗原结合片段一起抑制癌细胞。在某些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，包括 (a)鉴定受试者中具有多种表达EphB4和/或肝配蛋白B2的癌细胞的肿瘤；和(b)对受试 者施用结合EphB4蛋白的细胞外结构域的抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中，提供了抑制受试者中血管生成的方法。在另外的实施方案中， 方法包括对有此需要的受试者施用有效量的本文中公开的抗体。在一个实施方案中，受试 者是人受试者。在另外的实施方案中，受试者被诊断为黄斑变性。在一个实施方案中，方法可包括将细胞与足以抑制血管生成的量的解除免疫的抗 体或抗原结合片段接触。在某些方面，本公开内容提供了用于治疗患有血管生成相关疾病的受试者 的方法，其包括对受试者施用结合EphB4蛋白的细胞外结构域的解除免疫的抗体或 抗原结合片段。可用药学上可接受的载体配制抗体或抗原结合片段。血管生成相关 疾病或不期望的血管生成相关过程可选自血管生成依赖性癌症、良性肿瘤、炎性病症 (inflammatory disorder)、慢性关节风湿病和银屑病、眼部新生血管性疾病(ocular angiogenicdisease) > Osler—ffebber 综合|iE、j[>|j/L血管新生(myocardial angiogenesis) > 斑块新生血管形成(plaque neovascularization)、毛细血管扩张、血友病关节 (hemophiliac joint)、血管纤维瘤、创伤肉芽形成(woundgranulation)、创伤愈合、毛细血 管扩张银屑病硬皮症(telangiectasiapsoriasis scleroderma)、脓性肉芽肿、冠状动脉侧 枝(cororany collateral)、肢端缺血血管再生(ischemic limb angiogenesis)、发红、关 节炎、糖尿病新生血管化(diabetic neovascularization)、骨折、血管生成和造血作用。可 将抗体或抗原结合片段与至少一种额外的血管生成抑制剂共施用，所述血管生成抑制剂 以累加或协同的方式与抗体或抗原结合片段一起抑制血管生成。在治疗方法的另外的实施方案中，全身性施用解除免疫的抗体或其抗原结合片段。在另外的实施方案中，局部施用解除免疫的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，提供了包含本文中公开的解除免疫的抗体或其抗原结合片段 的药物组合物。在另外的实施方案中，组合物还可包含任何药学上可接受的载体或赋形剂。在一个实施方案中，提供了本文中公开的解除免疫的抗体或其抗原结合片段在制 造用于治疗癌症的药剂中的用途。在另外的实施方案中，癌症选自结肠癌、乳腺癌、间皮癌、 前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、卡波西肉瘤、卵巢癌和白血病。在另外的实施方案中，提供了本 文中公开的人源化抗体或其抗原结合片段在制造用于抑制血管生成的药剂中的用途。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段可抑制EphB4的活性。可设 计抗体使之抑制肝配蛋白B2与EphB4之间的相互作用。拮抗剂抗体通常影响Eph和/或 肝配蛋白的信号转导。例如，抗体可抑制EphB4的成簇(clustering)或磷酸化。在一个实 施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段还可增加EphB4的活性。激动剂抗体例如可上 调EphB4的信号转导。在某些方面，公开内容提供了抑制细胞中通过肝配蛋白B2/EphB4途径的信号转 导。方法可包括将细胞与有效量的结合EphB4蛋白的细胞外结构域并且抑制EphB4的活性 的抗体或抗原结合片段接触。在某些实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段可以是多克隆抗体、单克隆 抗体或抗体片段、重组抗体、双价抗体(diabody)、嵌合的或嵌合型抗体或抗体片段、人源化 抗体或抗体片段、完全人抗体或抗体片段、CDR移植抗体或抗体片段、单链抗体、Fv、Fd、Fab、 Fab，或F(ab，)2,以及合成或半合成抗体。在某些实施方案中，解除免疫的抗体或抗体片段以对于EphB4蛋白的细胞外结 构域至少大约lxl(^M、至少大约lxl(T4M、至少大约1χ1(Γ5Μ、至少大约lxl(T6M、至少大约 1χ1(Γ7Μ、至少大约1χ1(Γ8Μ、至少大约1χ1(Γ9Μ、至少大约ΙχΙΟ,Μ、至少大约IxKT11M或至少 大约IxlO-12M的解离常数(Kd)结合EphB4蛋白的细胞外结构域。在某些方面，可将本文中公开的解除免疫的抗体或抗体片段与额外的功能性部 分例如赋予期望的药物代谢动力学特性的标记物或部分共价连接(或与其稳定缔合)。 示例性标记物包括适合于通过选自荧光检测方法、正电子发射断层扫描术(positron emission tomographydetection method)和核磁共振检测法的方法检测的标记物。标记物 可以例如选自荧光标记物、放射性标记物和具有独特的核磁共振特征的标记物。可将部分 例如聚乙二醇(PEG)部分附着至抗体或其抗原结合部分以增加血清半衰期。在某些实施方案中，解除免疫的抗体或抗体片段包括改变的恒定区，其中所述抗 体或抗原结合片段展示与具有天然恒定区的抗Eph4B抗体相比，减弱的效应子功能。在某 些实施方案中，减弱的效应子功能包括一个或更多个下列类型的特征与具有天然恒定区 的抗Eph4B抗体相比较，减弱的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-cbpendenT-ce 11-mediated cytotoxicity) (ADCC)和减弱的补体依赖细胞毒性(CDC)。在某些实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段包括改变的恒定区，其中 所述抗体或抗原结合片段展示相对于具有天然恒定区的抗Eph4B抗体，增强的效应子功 能。在某些实施方案中，增加的效应子功能包括一个或更多个下列类型的特征与具有天然 恒定区的抗Eph4B抗体相比较，增强的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和增强的补 体依赖细胞毒性(⑶C)。
在某些实施方案中，解除免疫的抗体或其抗原结合片段具有抗癌活性。在某些实 施方案中，抗癌活性可抑制肿瘤生长、抑制癌细胞增殖、抑制癌细胞迁移、抑制癌细胞的转 移、抑制血管生成或引起肿瘤细胞死亡。在一个实施方案中，本申请提供了包含用于检测前列腺癌的本申请的抗体的诊断 组合物。在一个实施方案中，本公开内容提供了结合位于EphB4的细胞外部分的表位的 解除免疫的抗体或其抗原结合片段。解除免疫的抗体或其抗原结合片段可与位于

图1的 EphB4序列的氨基酸16至198的表位结合。例如，表位可位于EphB4的结合肝配蛋白B2 的球状结构域(图1的氨基酸四至197)内。解除免疫的抗体或其抗原结合片段可抑制 EphB4与肝配蛋白B2的细胞外部分的结合。解除免疫的抗体或其抗原结合片段可结合位于 图1的EphB4序列的氨基酸327至427或似8至537内的表位。例如，解除免疫的抗体或 其抗原结合片段可结合EphB4的第一纤连蛋白样结构域(图1的氨基酸3M至429)或第 二纤连蛋白样结构域(图1的氨基酸434至426)。在其他实施方案中，对人施用抗体或抗原结合片段在临床上是可接受的。在其他实施方案中，提供了包含编码本文中提供的解除免疫的抗体或其抗原结合 片段的核苷酸序列的多核苷酸。在其他实施方案中，提供了在严格杂交条件下与编码本文 中公开的解除免疫的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸杂交的多核苷酸。在其他实施方案中，提供了包含一个或更多个编码本文中公开的解除免疫的抗体 或其抗原结合片段的核苷酸序列的载体。在其他实施方案中，提供了包含表达本文中公开的解除免疫的抗体或其抗原结合 片段的载体的分离的细胞。本申请涉及任何上述方面和实施方案的组合。附图概述图1显示EphB4前体蛋白的氨基酸序列。(Genbank登录号NP_004435和SEQ ID NO 53)图2A-2D显示比较来自亲本小鼠单克隆抗体和解除免疫的变体的可变区的氨基 酸比对。图2A描述了与5个解除免疫的变体比对的小鼠单克隆抗体#47的重链可变区(SEQ ID NO 49)；图2B描述了与4个解除免疫的变体比对的#47的轻链可变区(SEQ ID NO 50)； 图2C描述了与5个解除免疫的变体比对的小鼠单克隆抗体#131的重链可变区(SEQID NO 51)；图2D描述了与4个解除免疫的变体比对的#131的轻链可变区(SEQ ID NO :5 。阴 影标示的残基表示与亲本小鼠单克隆抗体不同的氨基酸。图3A描述了将嵌合型#47抗体的结合与4个解除免疫的#47变异抗体的结合相比 较的细胞外EphB4夹心ELISA的结果。数字表示可变区的序列。例如“3/7”表示具有SEQ ID NO :3的重链可变区和EQ ID NO 7的轻链可变区的抗体。图显示其中在ELISA中达 到50%的结合的各抗体的浓度。图4A描述了将嵌合型#131抗体的结合与4个解除免疫的#131变异抗体的结合 相比较的细胞外EphB4夹心ELISA的结果。图4B显示在于ELISA中达到50%结合的情况 下各抗体的浓度。图5显示用10mg/ml的抗体处理的载有来自细胞的裂解物的SDS凝胶的western印迹(泳道1 无抗体处理，脉道2 小鼠单克隆抗体#131，泳道3 嵌合型抗体 #131，泳道4 示例性解除免疫的#131抗体，泳道5 小鼠单克隆抗体#47，泳道6 嵌合型抗 体#47，泳道7 和示例性解除免疫的#47抗体，泳道8表示分子标记，分子量以Kda表示)。 印迹用抗EphB4 —抗进行探测。图6A和6B描述了体内鳞状上皮细胞癌异种移植物测定的结果。肿瘤体积在Y轴 上以mm3表示，X轴相应于在处理开始后的天数。将利用小鼠单克隆抗体#47和#131的处 理与示例性解除免疫的抗体和对照处理相比较。发明详述I.定义“受试者”是指脊椎动物，例如，哺乳动物或人。虽然本发明的抗体或抗原结合片段 主要牵涉人受试者的治疗，但它们还可在兽医目的上用于其他哺乳动物受试者例如狗和猫 的治疗。如本文中所使用的，术语“抗体”(免疫球蛋白)包括但不限于单克隆抗体(包括 全长单克隆抗体)、多克隆抗体、从至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异 性抗体)、人抗体、人源化抗体、cameIised抗体、嵌合型抗体、单链Fvs (scFv)、单链抗体、单 结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab' )2片段、展示期望的生物活性的抗体片段、二硫 键连接的Fvs (sdFv)、胞内抗体(intrabody)和任何上述抗体的表位结合片段或抗原结合 片段。抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学上有活性的片段，即含有抗原 结合部位的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型G^i^n，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA* IgY)、 种类(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亚类。术语“抗原结合片段”是指保持与抗原结合的抗体的任何部分。抗体的示例性抗 原结合片段是重链和/或轻链CDR或重链和/或轻链可变区。术语“免疫原性”是指抗体或抗原结合片段，当对受者施用时，引发免疫应答(体 液或细胞)的能力，包括例如HAMA应答。当来自受试者的T细胞对施用的抗体作出免疫应 答时引起HAMA应答。然后T细胞招募B细胞，从而产生特异性“抗-抗体”抗体。术语“T细胞表位”是指以合理的效率结合MHC II类分子或能够通过在MHC II类 上呈递来刺激T细胞的特定肽序列。术语“B细胞表位”是指被B细胞识别的肽序列。通常，此类序列是溶剂可及的。术语免疫解除(deimmunization)是减少化合物对给定的物种的免疫原性的方 法。解除免疫的抗体是在给定的物种中比相应的亲本或非人抗体的免疫原性更低的抗体。如本文中所用的，术语肝配蛋白(Ephrin)和Eph用于分别指配体和受体。它们 可来自多种动物的任一种(例如，哺乳动物/非哺乳动物、脊椎动物/无脊椎动物，包括 人)。该领域中的命名法已发生快速变化，本文中使用的命名法是作为Eph命名委员会(Eph NomenclatureCommittee)工作的结果提出的，可在eph-nomenclature. com上于万维网上 访问其以及之前使用的名称。II.概述Eph家族受体是与Eph相关的受体蛋白质-酪氨酸激酶的家族，受体因其在产生促 红细胞生成素的人肝细胞癌细胞系中表达而得名。基于它们的细胞外结构域序列与它们优 先结合肝配蛋白-A蛋白或肝配蛋白-B蛋白的能力的相关性，它们被分为两个亚类。优选与肝配蛋白-A蛋白相互作用的受体是EphA受体，优先与肝配蛋白-B蛋白相互作用的宏观 世界体是EphB受体。Eph受体具有由结合配体的球状结构域组成的细胞外结构域、富含半胱氨酸的区 域，接着一对III型纤连蛋白重复。细胞质结构域由含有两个保守酪氨酸残基的近膜区域、 蛋白质酪氨酸激酶结构域、不育α-基序(SAM)和PDZ-结构域结合基序组成。EphB4对于 膜结合配体肝配蛋白B2是特异性的(Sakano，S.等人1996 ；BrambiIla R.等人19卯)。肝 配蛋白B2属于具有跨膜结构域和细胞质区域(具有5个保守酪氨酸残基)和PDZ结构域 的Eph配体的种类。Eph受体通过成簇的膜附着的肝配蛋白的结合来激活(Davis S等人， 1994)，这表明表达受体的细胞与表达配体的细胞之间的接触是Eph的激活所必需的。在配体结合后，Eph受体二聚化并且自磷酸化近膜酪氨酸残基以获得完全激活 (Kalo MS等人，1999，Birms KS, 2000) 0除了通过Eph受体的正向信号转导外，还可发生通 过肝配蛋白B的反向信号转导。肝配蛋白的Eph衔接(engagement)导致保守的细胞内酪氨 酸的快速磷酸化(Bruckner K，1997)和稍微较慢的PDZ结合蛋白的招募(Palmer A 2002)。EphB4前体蛋白描述于图1中。图1的EphB4序列的氨基酸16至198相应于结合 肝配蛋白B2的球状结构域(GD)。氨基酸239-321相应于富含半胱氨酸的结构域并且氨基 酸324-4 和434-5 分别相应于EphB4的第一纤连蛋白样结构域(FNDl)和第二纤连蛋 白样结构域(FND2)。几个研究已显示Eph/肝配蛋白的高表达与增加的肿瘤生长、肿瘤发生能力和转 移的潜能相关(Easty DJ, 1999 ；Kiyokawa E, 1994 ；Tang XX, 1999 ；Vogt T, 1998 ；Liu W, 2002 ；Stephenson SA, 2001 ；Steube KG 1999 ；Berclaz G，1996)。申请 10/949，720 证明 EphB4抗体在异种移植头颈癌肿瘤类型中引起细胞凋亡、减少血管生成和抑制肿瘤生长。本公开内容提供了可用于治疗癌症以及血管生成相关病症和不期望的血管生成 相关过程的解除免疫的抗体和抗原结合片段。解除免疫的抗体和抗原结合片段可用于在体外和体内抑制EphB4的功能。本公开 内容提供了例如通过抑制EphB4与EphB2相互作用用作受体拮抗剂的抗体。本公开内容还 提供了用作激动剂并且激活EphB4激酶的活性(通常通过估计EphB4的磷酸化状态来评 估的)的抗体和其抗原结合部分。令人惊讶地，此类抗体还在基于细胞的测定和体内测定 中抑制EphB4的功能。因此，此类抗体和抗原结合片段可用于在体外和体内抑制EphB4功 能，以及用于治疗与不期望的血管生成相关的癌症或病症。虽然不希望受任何特定机制的 限定，但预期刺激EphB4激酶活性的抗体也影响从膜上除去EphB4，从而降低总的EphB4水 平。III.抗体抗体是由脊椎动物中称为B细胞的淋巴细胞响应抗原引起的刺激而产生的蛋白 质。抗体(或更确切地免疫球蛋白(Ig))分子的基本结构单位由4条多肽链组成，其组合 在一起形成大写字母“Y”的形状。4条链中的2条是相同的轻(L)链，2条是相同的重(H) 链。存在5种不同类型(同种型)的重链，其将抗体分成5类，g卩IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。 此外，存在命名为κ和λ的两种不同的同种型的轻链。每一类重链可与任一类轻链组合。 重链和轻链各自包含参与抗原识别的可变区(分别地，VH和VL)和恒定(C)区。抗原结合 部位由6个高变区(或确切地互补决定区(CDR))组成。来自重链的3个CDR和来自轻链的3个CDR分别位于各链上的4个相对保守的反向平行的β折叠片(其被称为构架区) (FR1、FR2、FR3和FR4)之间。按惯例，已使用编号系统指示VH和VL链的构成部分的位置。 Kabat定义基于序列变异，Chothia定义基于结构环区域的定位。本文中使用Kabat定义进 行编号。在某些方面，本发明提供了抗EphB4的解除免疫的抗体和抗原结合片段。在一些 实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段结合EphB4的细胞外结构域。应理解，抗体可
和F(ab' )2、单克隆和多克隆抗体、基因工程抗体(包括嵌合型 抗体、单链抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、完全人抗体和人工选择的抗体)以及使用噬菌 体展示或备选技术产生的合成抗体或半合成抗体。在本申请的一个实施方案中，抗体片段是截断的链(在羧基末端截断的)。在某些 实施方案中，这些截断的链具有一个或更多个免疫球蛋白活性(例如，补体结合活性)。截 断的链的实例包括但不限于Fab片段(VL、VH、CL和CHl结构域组成)；Fd片段(由VH和 CHl结构域组成)；Fv片段(由抗体的单链的VL和VH组成)；dab片段(由VH结构域组 成)；分离的⑶R区域；(Fab' )2片段，二价体片段(包含由铰链区上的二硫键连接的两个 Fab片段)。截断的链可通过其各自在本领域内是已知的常规生物化学技术例如酶切割或 重组DNA技术产生。此类多肽片段可利用本领域内熟知的方法通过蛋白水解切割完整的抗 体来产生，或使用定向诱变在载体中期望的位置上例如在CHl之后插入终止密码子以产生 Fab片段或在铰链区之后插入终止密码子以产生(Fab' )2片段来产生。单链抗体可通过 用编码连接VL和VH蛋白质片段的肽连接体的DNA连接VL-和VH-编码区来产生。本申请还提供了抗EphB4抗体的片段，其可包含完整抗体的部分，例如，完整抗体 的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段；双价抗体； 线性抗体(Zapata等人.，Protein Eng. 1995 ； 8(10) :1057-1062)；单链抗体分子；以及从 抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶降解产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有 单个抗原结合部位，和残留的“Fe”片段，其名称反映其容易结晶的能力。抗体的胃蛋白酶 片段产生具有抗原结合部位并且仍然能够交联抗原的F(ab’)2片段。“Fv”通常是指含有完整抗原识别和结合部位的最小抗体片段。该区域由以紧密 的非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体组成。在该构型中，各可变区的3个 CDR相互作用以界二聚体的表面上的抗原结合部位。CDR共同地赋予抗体抗原结合 特异性。然而，甚至单个可变区(或含有3个特异于抗原的CDR的Fv的一半)也具有识别 和结合抗原的能力，虽然以可能以比完整结合部位更低的亲和力结合。因此，在某些实施方案中，本申请中公开的抗体可包含1、2、3、4、5、6或更多个识 别EphB4的细胞外结构域的⑶R。Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CHl)。Fab’片段与 Fab片段相异在于重链CHl结构域的羧基端上少数残基的添加，包括一个或更多个来自抗 体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基 的Fab，的名称(designation)。F (ab，)2抗体片段最初产生为成对的在其间具有铰链半胱 氨酸的Fab’片段。抗体片段的其他化学偶联也是知的。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包 含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在某些实施方案中，Fv多肽还在Vh和\结构域之间包含使得scFv形成用于抗原结合的期望的结构的多肽连接体。 关于 scFv 的综述，参见 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore, eds. (Springer-Verlag :New York,1994), pp.269-315。SMIP是一类经基因工程改造而包含靶结合区和效应结构域(effector domain) (CH2和CH3结构域)的单链肽。参见例如，美国专利申请公开案20050238646。靶结合区 可来源于抗体例如本申请的抗EphB4抗体的可变区或CDR。备选地，靶结合区来源于结合 EphB4的蛋白质。术语“双价抗体”是指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，所述片段包含连接至 相同多肽链(Vh-VJ中的轻链可变区的重链可变区(Vh)。通过使用太短而不能允许 相同链上的两个结构域之间配对的连接体，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，从 而产生两个抗原结合部位。在例如EP 404，097 ；WO 93/11161 ；和Hollinger等人·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444-6448 (1993)中更全面地描述了双价抗体。众所周知，具有Fc区域的抗体对分子(或病原体)的结合帮助分子(或病原 体)的加工和清除。抗体的Fc部分被由免疫效应细胞表达的特化受体(specialized receptors)识别。IgGl和IgG3抗体的Fc部分被存在于吞噬细胞例如巨噬细胞和中 性粒细胞的表面上的Fc受体识别，所述吞噬细胞从而能够结合并且吞噬包被有此类 同种型的抗体的分子或病原体(Janeway等人.，Immunobiology第5版，第147页， GarlandPublishing(New York，2001))。本发明的抗EphB4抗体包括具有所有类型的恒定区的抗体，包括IgM、IgG、IgD、 IgA和IgE，和任何同种型，包括IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。抗体的轻链可以是κ 轻链或λ轻链。在某些实施方案中，包含来源于不同物种的部分的单链抗体和嵌合型抗体、人源 化抗体或灵长源化(CDR-移植)抗体以及嵌合型或CDR移植单链抗体也作为抗体的抗原 结合片段包括在本公开内容中。此类抗体的不同部分可通过常规技术化学地连接在一起， 或可使用基因工程技术制备为连续蛋白质。例如，可表达编码嵌合型或人源化单链的核酸 来产生连续蛋白质。参见，例如，美国专利4，816，567和6，331，415 ；美国专利4，816，397 ； 欧洲专利O, 120，694 ；WO 86/01533 ；欧洲专利O, 194，276Β1 ；美国专利5，225，539 ；和欧洲 专利 0，239，400Β1。也参见，Newman 等人，BioiTechnology, 10 1455-1460 (1992)，关于灵 长源化抗体。参见，例如，Ladner等人，美国专利4，946，778 ；和Bird等人，Science, 242 423-426 (1988))，关于单链抗体。在某些方面，本申请提供了具有对于EphB4或EphB4的部分的结合特异性的抗体 和抗原结合片段。在一些方面，抗体和抗原结合片段结合一个或更多个EphB4的特定结构 域。例如，抗体或抗原结合片段结合EphB4的一个或更多个细胞外结构域(例如球状结构 域、富含半胱氨酸的结构域以及第一纤连蛋白3型结构域以及第二纤连蛋白3型结构域)。 在一些方面，免疫球蛋白可以以至少大约1 X 10_6，1 X 10_7、1 X 10_8、1 X 10_9M或更小的解离 常数(Kd)结合EphB4。在某些实施方案中，本文中公开的抗体和抗原结合片段对于EphB4 是特异性的，对Eph或肝配蛋白家族的其他成员具有最低限度的结合。在某些实施方案中，本申请提供了 EphB4拮抗剂抗体。如本文中所述的，术语“拮 抗剂抗体”是指可抑制EphB4的一个或更多个功能例如结合活性(例如，配体结合)和信号转导活性(例如，EphB4的成簇或磷酸化、细胞应答的刺激例如细胞迁移或细胞增殖的刺 激)的抗体。例如，拮抗剂抗体可抑制(减少或防止)EphB4受体与天然配体(例如，肝配 蛋白B2或其片段)的相互作用。在一些实施方案中，抗EphB4的拮抗剂抗体可抑制EphB4 介导的功能，包括内皮细胞迁移、细胞增殖、血管生成和/或肿瘤生长。在某些实施方案中， 拮抗剂抗体结合EphB4的细胞外结构域。在其他实施方案中，抗体或抗原结合片段是EphB4拮抗剂。在一些实施方案中，抗 体或抗原结合片段激活或增强EphB4激酶的活性，甚至不依赖于肝配蛋白B2。在一些情况 下，此类抗体可用于刺激EphB4。然而，申请者指出在大多数基于细胞的测定和体内测定中， 此类抗体令人惊讶地表现如拮抗剂抗体一样。此类抗体似乎结合纤连蛋白III型结构域， 特别地图1的氨基酸327至427的区域。在一些实施方案中，结合EphB4的纤连蛋白III型 结构域的抗体或抗原结合片段可抑制由EphB4介导的功能，包括内皮细胞迁移、细胞增殖、 血管发生和/或肿瘤生长。在某些实施方案中，包含来源于不同物种的部分的单链抗体和嵌合型抗体、人源 化抗体或灵长源化(CDR-移植)抗体以及嵌合型或CDR移植单链抗体也作为抗体的抗原结 合部分包括在本公开内容中。此外，还可产生抗体的抗原结合片段，包括嵌合型抗体、人源化抗体、灵长源化抗 体或单链抗体的片段。受试抗体的抗原结合片段保持它们所源自的全长抗体的至少一种结 合功能和/或调节功能。某些抗原结合片段保持抑制EphB4的一个或更多个功能特征例如 结合活性、信号转导活性和/或细胞应答的刺激的能力。例如，在一个实施方案中，EphB4 抗体的抗原结合片段可抑制EphB4与一种或更多种其配体(例如肝配蛋白B2)的相互作用 和/或可抑制一种或更多种受体介导的功能例如细胞迁移、细胞增殖、血管生成和/或肿瘤 生长。在一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段是小鼠抗体。在一个方面，重链和轻 链可变区各自包含2至20个氨基酸置换。在一个方面，置换包括用至少一个相应的人氨基 酸置换至少一个小鼠氨基酸。在一个方面，基于鉴定与小鼠可变区同源的人种系基因来选 择人氨基酸。在一个方面，就小鼠可变区的4个构架区中的每一个独立地鉴定同源人种系 基因。如本文中所使用的，术语“人源化抗体和抗原结合片段”是指包含不同来源的抗体 的部分的抗体或抗原结合片段，其中至少一个部分是人来源的部分。因此，一个实施方案涉 及具有对于EphB4 (例如，人EphB4)的结合特异性的解除免疫的抗体，所述抗体包含非人来 源(例如，啮齿动物)的抗原结合区和至少一部分人来源的抗体(例如，人构架区、人恒定 区或其部分)。例如，解除免疫的抗体可包含通过常规技术(例如，合成)化学地连接在一 起的或使用基因工程技术制备为连续多肽(例如，可表达编码嵌合型抗体的蛋白质部分的 DNA以产生连续多肽链)的来源于具有需要的特异性的非人来源例如小鼠的抗体和来源于 人来源的抗体序列的部分(例如，嵌合型抗体)。在某些实施方案中，构架区来源于最接近的人种系构架区。在某些实施方案中，抗 体或抗原结合片段包含来自最接近的人种系基因的FR1、FR2、FR3和FR4区域。在某些实施 方案中，各构架区独立地选自与特定构架区最接近的人种系基因。在某些实施方案中，用来 自非人或亲本抗体的相应残基置换影响构架区中抗原结合亲和力的残基。
在一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段包含一个或更多个含有非人来源 的CDR(例如，一个或更多个来源于非人来源的抗体的CDR)和来源于人来源例如种系抗体 基因的轻链和/或重链的构架区的抗体链(例如，具有或不具有构架区变化的CDR移植抗 体)。在一个实施方案中，解除免疫的抗体可与鼠单克隆抗体竞争对EphB4多肽的结合。嵌 合型或CDR移植单链抗体还可包括在术语人源化抗体内。在一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段包含含有非人来源的CDR(例如，一 个或更多个来源于非人来源的抗体的CDR)和非人来源的构架区的抗体链。在一个实施方 案中，用至少一个来自相应的人构架区的氨基酸置换非人构架区。在一个实施方案中，人氨 基酸残基对非人残基的置换减少了抗体在人受试者中的免疫原性。在一个实施方案中，提供了结合EphB4的细胞外结构域的解除免疫的抗体或其抗 原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中与结合EphB4的细胞外结构域的非人 或亲本抗体相比较，各可变区具有2至20个氨基酸置换。可变区包括其间散布4个构架区 的3个⑶R区。在一个方面，置换存在于构架区中。在一个实施方案中，将非人或亲本抗体与人种系抗体基因的数据库例如来自V BASE的数据库相比较，鉴定高度同源的单个的构架区。可使用这样的程序如SwissPdb， WAM(ffeb Antibody Modelling)和AbM产生非人或亲本抗体可变区的结构模型。可用来自 人种系基因的相应的残基置换残基，例如在与CDR或抗原相互作用中不起作用或对抗原结 合亲和力没有贡献的残基。在一个实施方案中，将非人或亲本抗体的可变区氨基酸序列中的单个的构架区而 非整个构架与人抗体集合中相应的序列相比较。选择具有最高度同源性的人构架置换非人 或亲本抗体的原始构架。该技术，称为“framework patching”，详细地描述于美国专利申请 案US2005/0033(^8中，其通过引用合并入本文。在一个实施方案中，将称为“构架改组(framework shuffl ing) ”的具有来自 非人或亲本抗体的CDR可变区的重组文库按读框融合至单个的人种系构架库(pool) (Dall' Acqua等人，Methods，36 :43 ^)05))。然后筛选文库以鉴定编码人源化抗体的克 隆，所述人源化抗体以与非人或亲本抗体相比较相似的或更大的结合亲和力结合EphB4的 细胞外结构域。在一个实施方案中，分析非人或亲本抗体以鉴定潜在的T细胞表位。可使用预测 MCH II类结合基序的肽缝合软件(ρ印tide threadingsoftware)鉴定T细胞表位。计算机 结合预测算法包括iTope 、Tepitope, SYFPEITHI和MHCpred。在一个实施方案中，平行地 就潜在的T细胞表位分析同源单个的人构架区。可不管在非人或亲本可变区和人种系基因 中鉴定的表位。然后就可能的置换标记只在非人或亲本可变区中鉴定的表位。在一个实施方案中，分析非人或亲本抗体以鉴定潜在的B细胞表位。可通过鉴定 非人或亲本抗体构架区中为至少部分溶剂可及的并且与相应的同源人抗体构架残基不同 的残基来识别潜在的B细胞表位。在一个实施方案中，通过用相应的人残基置换溶剂可及 的非人或亲本抗体构架区残基来消除潜在的B细胞表位。在一个实施方案中，被导入解除免疫的抗体的置换包括氨基酸置换、缺失或插入。 在一个实施方案中，各置换导致来自同源人种系基因或来自人可变区共有序列的相应氨基 酸对一个氨基酸的置换。在一个实施方案中，通过用来自同源人种系基因或来自人可变区共有序列的相应的氨基酸置换2至20个氨基酸来除去非人或亲本抗体或抗原结合片段的 免疫原性。在一个实施方案中，置换可除去一个或更多个T细胞或B细胞表位。在另一个 实施方案中，置换可导入调节T细胞表位。在一个实施方案中，解除免疫的非人或亲本抗体 或抗原结合片段，当对人受试者施用时，显示高于非人或亲本抗体或抗原结合片段的降低 的免疫原性应答。在一个实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段的重链和轻链可变区整个来 源于一个或更多个人抗体，如W02006/08246中所描述的。在一个实施方案中，可变区由来 自一个或更多个人抗体的氨基酸序列的区段组成。在一个实施方案中，人区段在长度上为2 或更多个氨基酸。在一个实施方案中，人区段在长度上为100个或更少的氨基酸。在另外 的实施方案中，人区段在长度上为50个或更少，40个或更少或30个或更少的氨基酸。在一个实施方案中，各可变区，与亲本或非人抗体相比较，具有减少的T细胞表位
数目。在一个实施方案中，各可变区，与亲本或非人抗体相比较，具有减少的B细胞表位数 目。在一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段包含小鼠单克隆抗体#47的CDR区。 在US2005/0M9736中已描述和表征了小鼠单克隆抗体#47，其以其全文通过引用合并入本 文。小鼠单克隆抗体#47的重链的CDR区定义为SEQ ID NO 19 (CDRl)、SEQ ID NO :20(CDR2) 和SEQ IDNO 21 (CDR3)。小鼠单克隆抗体#47的轻链的CDR区定义为SEQ IDNO 22 (CDRl)、 SEQ ID N0:23(CDR2)和SEQ ID NO :24 (CDR3)。在一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片 段包含小鼠单克隆抗体#47的一个或更多个构架区(FR1-FR4)。在一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段在人受试者中比小鼠单克隆抗体 #47的免疫原性更低(或更确切地，引起减少的HAMA应答)。测定免疫原性的测定法完全 在本领域技术人员的知识范围之内。可进行确定免疫应答的本领域公认的方法以在特定受 试者中或在临床试验期间监控HAMA应答。可在所述治疗的开始时和在整个施用过程中对 施用了解除免疫的抗体的受试者进行免疫原性评估。例如通过使用本领域技术人员已知的 方法(包括表面等离子体共振技术(BIAC0RE)和/或固相ELISA分析)检测来自受试者的 血清样品中抗解除免疫的治疗剂的抗体来测量HAMA应答。备选地，设计用于测量T细胞活 化事件的体外测定也可显示免疫原性。例如，一个测定是T细胞增殖测定。在该测定中，就 响应抗体或抗体片段的增殖筛选来自在世界上代表大于80%的HLA-DR等位基因的供体的 PBMC0在一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段以为小鼠单克隆抗体#47的结合亲 和力的至少80%或至少90%的亲和力结合EphB4的细胞外结构域。在另一个实施方案中， 解除免疫的抗体或抗原结合片段以为小鼠单克隆抗体#47的结合亲和力的至少100%或更 合适地更大的结合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。结合亲和力的测定完全在本领域技术人员的知识范围之内。本领域公认的方法包 括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫沉淀(RIP)测定和BIAcore生物传感器测定。实施 例2更详细地描述了使用夹心ELISA进行的结合亲和力的测定。在另一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含 定义为 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQID NO 4 或 SEQ ID NO 5 的氨基酸 序列，所述轻链包含定义为SEQ IDNO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链是SEQ ID NO: 3并且轻链是SEQ ID NO :7。在一个实 施方案中，重链是SEQ ID NO :3并且轻链是SEQ ID NO :8。在一个实施方案中，重链是SEQ ID NO :4并且轻链是SEQ ID NO :7。在一个实施方案中，重链是SEQ ID NO :4并且轻链是 SEQ ID NO :8。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段结合EphB4的细胞外结 构域。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段对人受试者的免疫原性低于小 鼠单克隆抗体#47。在一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段包含小鼠单克隆抗体#131的CDR 区。已在US2005/0M9736(其以其全文通过引用合并入本文)中描述和表征了小鼠单克隆 抗体#131。小鼠单克隆抗体#131的重链的CDR区定义为SEQ ID NO 25 (CDRl)、SEQ ID NO: 26 (CDR2)和SEQID NO 27 (CDR3)。小鼠单克隆抗体#131的轻链的CDR区定义为SEQ IDNO 28(CDR1)、SEQ ID N0:29(CDR2)和 SEQ ID N0:30(CDR3)。在一个方面，解除免疫的抗体或 抗原结合片段包含小鼠单克隆抗体#131的一个或更多个构架区(FR1-FR4)。在一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段以为小鼠单克隆抗体#131的结合 亲和力的至少80%或至少90%的结合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。在另一个实施 方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段以为小鼠单克隆抗体#131的结合亲和力的至少 100%或更合适地更大的结合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。在一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段在人受试者中比小鼠单克隆抗体 #131的免疫原性更低(或更确切地，引起减少的HAMA应答)。在另一个方面，解除免疫的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链含有 定义为 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO 14 的 氨基酸序列，所述轻链含有定义为SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:17或SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链是SEQ ID NO 13并且轻链是SEQ IDNO 17。 在一个实施方案中，重链是SEQ ID NO: 13并且轻链是SEQ IDNO 18。在一个实施方案中， 重链是SEQ ID NO :14并且轻链是SEQ IDNO 17。在一个实施方案中，重链是SEQ ID NO 14 并且轻链是SEQ IDNO :18。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段结合EphB4 的细胞外结构域。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段对人受试者的免疫 原性比小鼠单克隆抗体#131的更低。在一些实施方案中，解除免疫的抗体抑制培养的内皮细胞形成管。抑制可通过本 领域技术人员已知的任何方法(包括下列方法)来确定。将基质胶(60 μ 1的10mg/ml ； Collaborative Lab, Cat. No. 35423)置于冰冷的96孔板的各个孔中。让板在室温下静置 15分钟，然后在37°C下温育30分钟以使基质胶聚合。同时，以2xl05个细胞/ml的浓度 在EGM-2(Clonetic，Cat. No. CC3162)中制备人脐静脉内皮细胞。在相同的培养基中以h 期望的浓度(5个浓度水平)制备解除免疫的抗体或抗原结合片段。将细胞(500 μ 1)和h 抗体(500 μ 1)混合，将200 μ 1该悬浮液以一式两份置于聚合的基质胶上。在对小时的温 育后，对于每一个浓度，使用Bioquant Image Analysis系统拍摄一式三份图象。与未处理 的对照相比较，通过测量形成的束的长度和接点(junction)的数目来估量蛋白质相加作 用(Protein addition effect) (IC50)。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段在体内抑制组织的血管化作 用。抑制可通过本领域技术人员已知的任何方法(包括下列方法)来确定。可在小鼠中将体内血管生成测定为血管从皮下组织至含有解除免疫的抗体或抗原结合片段的基质胶栓内 的生长。基质胶在体温下快速形成固体凝胶，从而捕获因子以使能够缓慢释放至周围组织 和延长对周围组织的暴露。将在4°C以液体形式存在的基质胶(8. 13mg/ml，0.5ml)与内皮 细胞生长添加剂(Endothelial Cell Growth Supplement) (ECGS)、解除免疫的抗体+ECGS 或基质胶+单独的载体(含有0. 25% BSA的PBQ混合。将基质胶(0. 5ml)沿着腹膜中间 线(peritoneal mid line)注射入雌性nu/nu小鼠(6周龄)的腹部皮下组织内。在第6 天，处死小鼠，回收栓，然后进行处理以进行组织学分析。通常除去覆盖在上面的皮肤，通过 保留用于支持的腹膜衬里切取凝胶，将其固定在10%的PBS中的缓冲福尔马林中，然后包 埋在石蜡中。切取3μπι的切片，用H&E或Masson' s三色染色法进行染色，在光学显微镜 下进行检查。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段减少人肿瘤异种移植物在小 鼠中的生长。肿瘤生长的抑制可通过本领域技术人员已知的任何方法(包括实施例中描述 的方法)来确定。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段抑制植入动物的角膜的组织 的血管化作用。抑制可通过本领域技术人员已知的任何方法来确定，所述方法包括按照 由Kenyon等人，1996所述的方法进行的小鼠角膜微囊袋测定法(corneal micropocket assay)。(参见美国申请2005/0M9736，其通过引用合并入本文)。在一些实施方案中，解除免疫的抗体或抗原结合片段促进细胞凋亡。可使用不同 方法包括 TUNEL 染色和 Cell Death Detection ELISAplus 试剂盒(Roche, Piscataway, NJ)来检查细胞凋亡。在某些方面，本申请提供了杂交瘤细胞系以及由这些杂交瘤细胞系产生的单克隆 抗体。公开的细胞系具有除了用于产生单克隆抗体外的用途。例如，可将细胞系与其他细 胞(例如合适的药物标记的人骨髓瘤、小鼠骨髓瘤、人-小鼠异源骨髓瘤(heteromyeloma) 或人淋巴样干细胞)融合以产生另外的杂交瘤，从而提供编码单克隆抗体的基因的转移。 此外，细胞系可用作编码抗EphB4免疫球蛋白链的核酸的来源，可分离和表达所述核酸(例 如，在使用任何适当的技术(参见例如，Cabi 1 Iy等人，美国专利4，816，567 ；Winter,美国专 利5，225，539)转移至其他细胞后)。例如，可分离(例如，通过PCR)包含重排的抗EphB4 轻链或重链的克隆或可从从细胞系分离的mRNA制备cDNA文库，以及可分离编码抗EphB4 免疫球蛋白链的cDNA克隆。因此，可获得编码抗体的重链和/或轻链或其部分的核酸，并 且按照重组DNA技术将其用于在多种宿主细胞中或在体外翻译系统中产生特定的免疫球 蛋白、免疫球蛋白链或其变体(例如，人源化免疫球蛋白)。例如，可将编码变体例如人源化 免疫球蛋白或免疫球蛋白链的核酸包括cDNA或其衍生物置于合适的原核或真核载体(例 如，表达载体)中，然后通过适当的方法(例如，转化、转染、电穿孔、感染)导入合适的宿主 细胞中，以使核酸与一个或更多个表达控制元件有效连接(例如，在载体中或整合入宿主 细胞的基因组)。为了抗体的产生，可在适合于表达的条件下(例如，在诱导剂、补充有适 当的盐、生长因子、抗生素、营养补充剂等的合适的培养基存在的情况下)维持宿主细胞， 由此产生编码的多肽。如果期望，可回收和/或分离(例如，从宿主细胞或培养基)回收编 码的蛋白质。应当理解，产生的方法包括在转基因动物的宿主细胞中的表达(参见例如，WO 92/03918，GenPharm hternational，于 1992 年 3 月出版的)。
本抗体和抗原结合片段可用于在体内直接杀死或除去癌细胞。直接杀死包括对需 要此种治疗的受试者施用抗体(任选地将其融合至细胞毒性药物)。在一些实施方案中，癌 症包括以比可供比较的组织的非癌性细胞高的水平表达EphB4的癌细胞。因为抗体识别癌 细胞上的EphB4，因此破坏抗体所结合的任何此类细胞。在单独使用抗体杀死或消除癌细 胞的情况下，此类杀死或消除可通过起始内源宿主免疫功能例如⑶C和/或ADCC来完成。 用于确定抗体是否以该方式杀死细胞的测定在本领域技术人员的能力范围(purview)之 内。因此，在一个实施方案中，本公开内容的抗体可用于递送多种细胞毒性化合物。可 将任何细胞毒性化合物融合至本抗体。可通过化学或遗传学方法(例如，通过以单个融合 分子的形式表达)实现该融合。细胞毒性化合物可以是生物学的例如多肽或小分子。如本 领域技术人员将理解的，对于小分子，使用化学融合，而对于生物化合物，可使用化学或遗 传学融合。细胞毒性化合物的非限定性实例包括治疗性药物、发射放射线的化合物、植物、真 菌或细菌来源的分子、生物蛋白质和其混合物。细胞毒性药物可以是在细胞内起作用的细 胞毒性药物例如短程辐射发射源(short-range radiation emitter)，包括例如短程高能 α发射源。酶促活性毒素和其片段以白喉毒素A片段、白喉毒素的非结合活性片段、外毒 素A(来自铜绿假单胞菌O^seudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、 蒴莲根毒素A链、α-sacrin、某些油桐蛋白质、某些石竹素蛋白质、美洲商陆蛋白质(PAP， PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂(Morodica charantia inhibitor)、泻果素、巴豆毒素、石碱 草抑制剂(Saponaria officinalis inhibitor)、白树毒素、米托胼(mitogillin)、局限曲 菌素、酚霉素和依诺霉素。用于制备免疫毒素的酶促活性多肽的方法描述于W084/03508和 W085/03508中，其通过引用合并入本文。某些细胞毒性部分来源于例如阿霉素、苯丁酸氮 芥、柔红霉素、氨甲蝶呤、新制癌菌素(neocarzinostatin)和钼。用于将抗体与细胞毒性剂缀合的方法之前已进行了描述，并且在本领域技术人员 的能力范围之内。在某些实施方案中，还将抗体或抗原结合片段附着至能够被检测的标记物(例 如，标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子)。活性部分可以是放射性 试剂例如放射性重金属例如铁螯合物、钆或锰的放射性螯合物、氧、铁、碳或镓的正电子发 射体(positronemitter),43K,5￥e,57Co,67Cu,67Ga,68Ga, 1231 , 1251 , 131 1 , 132I ^ 99Tc 等。附着至 这样的部分的结合剂可用作显像剂并且以对于在哺乳动物例如人中的诊断用途上是有效 的剂施用，然后检测显像剂的定位和累积。显像剂的定位和累积可通过放射性闪烁显像术、 核磁共振成像、计算机断层摄影术(computed tomography)或正电子发射断层摄影术来检 测。可使用利用抗EphB4的抗体或其他结合多肽的免疫闪烁成像术来检测和/或诊断癌症 和脉管系统。例如，用“锝、111铟、125碘标记的抗EphB4标记的单克隆抗体可有效地用于这 样的成像。如对于本领域技术人员将是显然的，待施用的放射性同位素的量取决于放射性 同位素。本领域技术人员可基于给定的用作活性部分的放射性核素的比放射性和能量容易 地配制待施用的显像剂的量。通常，施用0. 1-100毫居里/剂量的显像剂或1-10毫居里/ 剂量的显像剂或2-5毫居里/剂量的显像剂。因此，公开的组合物用作显像剂，其包含缀 合至放射性部分的靶向性部分，所述放射性部分包含0. 1-100毫居里，在一些实施方案中1-10毫居里，在一些实施方案中2-5毫居里，在一些实施方案中1-5毫居里。本申请还提供了包含编码解除免疫的抗EphB4抗体或其片段的核苷酸序列的多 核苷酸。由于遗传密码子的简并性，因此多种核酸序列可编码每一种抗体氨基酸序列。本 申请还提供了在严格或更低的严格性杂交条件(例如，如本文中所定义的)下与编码结合 hEphB4的解除免疫的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。严格杂交条件包括但不限于在大约45°C下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤 膜结合的DNA杂交，然后在大约50-65°C下在0. 2XSSC/0. 1% SDS中进行一次或更多次清 洗，高度严格杂交条件是例如在大约45°C下在6X SSC中与滤膜结合的DNA杂交，然后在 大约60°C下在0. IX SSC/0. 2% SDS中进行一次或更多次清洗，或本领域技术人员已知的 任何其他严格杂交条件(参见，例如，Ausubel, F. M.等人.，eds. 1989Current Protocols in Molecular Biology,第 1 卷，Green PublishingAssociates, Inc.a 禾口 John Wiley and Sons, Inc.，NY,在第 6. 3. 1 至 6. 3. 6 和 2. 10. 3 页)。可通过本领域内已知的任何方法获得多核苷酸，以及确定多核苷酸的核苷酸 序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则可从化学合成的寡核苷酸(例如，如 Kutmeier等人，Biokchniques 17:242(1994)中所描述的)装配编码抗体的多核苷酸，简 而言之，这包括合成含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，将此类寡核苷酸退火和 连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。在一个实施方案中，所使用的密码子包含通常用 于人或小鼠的密码子(参见，例如，Nakamura, Y.，Nucleic AcidsRes. 28 :292(2000)) 编码抗体的多核苷酸还可从来自适当来源的核酸产生。如果包含编码特定抗体的 核酸的克隆是不可获得的，但抗体分子的序列是已知的，则编码免疫球蛋白的核酸可通过 化学方法合成，或通过PCR扩增(使用可与序列的3'和5'末端杂交的合成引物)或使用 寡核苷酸探针(所述探针是用以鉴定例如来自cDNA文库的编码抗体的cDNA克隆的特异于 特定基因序列的寡核苷酸探针)通过克隆从适当的来源(例如，从任何表达抗体的组织或 细胞例如选择用于表达抗体的杂交瘤细胞产生的抗体cDNA文库或cDNA文库，或从所述组 织或细胞分离的核酸，优选polyA+RNA)获得。然后使用本领域内熟知的任何方法将通过 PCR产生的扩增核酸克隆入可复制的克隆性载体。本申请明还提供了编码本文中描述的抗体的重链和轻链构架区和CDR的多核苷 酸序列以及用于它们在哺乳动物细胞中有效表达的表达载体。IV.具有改变的效应子功能的抗Eph4B抗体具有基因工程改造的或变异的恒定区或Fc区的抗体可用于调节效应子功能例 如，抗原依赖细胞毒性(ADCC)和补体依赖细胞毒性(CDC)。具有经基因工程改造的或变异 的恒定区或Fc区的此类抗体在例如其中Eph4B在正常组织中表达的情况下是有用的；在这 些情况下不具有效应子功能的解除免疫的抗体和抗原结合片段可引起期望的治疗反应而 不损伤正常组织。在另一个实施方案中，给抗体或抗原结合片段提供增强的效应子功能，从 而其可用于直接的细胞杀伤。因此，本公开内容的某些方面和方法涉及具有改变的效应子功能的抗Eph4B抗 体，所述抗体包含一个或更多个氨基酸置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，这样的 变异的抗Eph4B抗体展示减弱的效应子功能或无效应子功能。具有减弱的效应子功能的抗Eph4B抗体可通过在抗体的某些区域的氨基酸序列中导入其他类型的变化来产生。此类氨基酸序列变化包括但不限于由Bluestone等人描述 的 Ala-Ala 突变。(参见 WO 94/28027 和 WO 98/47531 ；也参见 Xu 等人.2000Cell Immunol 200;16-26)。因此，在某些实施方案中，在恒定区内具有突变(包括Ala-Ala突变)的抗 Eph4B抗体可用于减弱或消除效应子功能。根据此类实施方案，抗Eph4B抗体的恒定区包 含位点234上的至丙氨酸的突变或位点235上的至丙氨酸的突变。此外，恒定区可包含双突 变位点234上的至丙氨酸的突变和位点235上的至丙氨酸的突变。在一个实施方案中，抗 Eph4B抗体包含IgG4构架区，其中Ala-Ala突变将描述位点234上从苯丙氨酸至丙氨酸的 突变和/或位点235上从亮氨酸至丙氨酸的突变。在另一个实施方案中，抗Eph4B抗体可 包含IgGl构架区，其中Ala-Ala突变将描述位点234上从亮氨酸至丙氨酸的突变和/或位 点235上从亮氨酸至丙氨酸的突变。抗-抗Eph4B抗体可备选地或额外地具有其他突变， 包括CH2结构域中的点突变K322A (Hezareh等人.2001J Virol. 75 :12161-8)。在恒定区 中具有所述突变的抗体还可以是封闭或非封闭抗体。铰链区中的变化也可影响效应子功能。例如，铰链区的缺失可减少对于Fc受体的 亲和力和可减弱补体激活(Klein等人.1981Proc NatlAcad Sci U S Α. 78 :524-528)。因 而本公开内容还涉及在铰链区中具有改变的抗体。在特定的实施方案中，可修饰抗Eph4B抗体以增强或抑制补体依赖细胞毒性 (⑶C)。可通过在抗体的Fc区域导入一个或更多个氨基酸置换、插入或缺失来获得经调 节的⑶C活性(参见，例如，美国专利6，194，551)。备选地或额外地，可在Fc区域导入 半胱氨酸残基，从而允许在该区域中形成链间二硫键。所产生的同型二聚体抗体可具有 提高的或减弱的内化(internalization)能力和/或增强的或减弱的补体介导的细胞杀 伤。参见 Caron 等人·，J. Exp Med. 176 :1191-1195(1992)和 Shopes, B. J. Immunol. 148 2918-2922(1992), W099/51642, Duncan&ffinterNature 322:738-40(1988)；美国专利 5, 648, 260 ；美国专利 5，624，821 ；和 W094/29351。还可使用 Wolff 等人.Cancer Research 53 :2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体 抗体。备选地，可对具有双重Fc区域的抗体进行基因工程，其从而可具有增强的补体溶血 和 ADCC 能力。参见，Stevenson 等人 Anti-CancerDrug Design 3 :219-230(1989).调节抗体的效应子功能的另一个可能的方法包括糖基化的改变。该主题最近已由 Raju进行了综述，他概述和提及了人IgG上发现的低聚糖对它们的效应子功能的程度的重 要性(Raju,TS. BioProcess InternationalApril 2003. 44—53)。根据 Wright 禾口 Morrison， 人IgG低聚糖的微观不均一性可影响生物学功能例如CDC和ADCC、与不同Fc受体的结合 以及与 Clq 蛋白的结合(Wright A. Morrison SL. TIBTECH 1997，15 J6-32)。已充分证 明，取决于产生性细胞和细胞培养条件，抗体的糖基化模式可以不同(Raju，TS. BioProcess International April 2003. 44-5 。此类差异可导致效应子功能和药物代谢动力学的变 化(Israel 等人.Immunology. 1996 ；89 (4) :573-578 ；Newkirk 等人.P. Clin. Exp. 1996 ； 106(2) :259-64)。效应子功能的差异可能与IgG结合效应细胞上的Fc γ受体(Fe y R)的 能力相关。Siields，等人，已显示在氨基酸序列中具有变异的IgG (其具有提高的与Fc γ R 的结合)可展示高至100%的增强的使用人效应细胞产生的ADCC(Shields等人.J Biol Chem. 2001276(9) =6591-604)。虽然此类变体包含未在结合界面上发现的氨基酸的变化，但 糖组分的性质以及其结构模式也可促成观察到的差异。此外，IgG的低聚糖组分中岩藻糖的存在或不存在可提高结合和 ADCC (Shields 等人.J Biol Chem. 2002 ；277 (30) :26733-40)。 缺乏连接至Asn297的岩藻糖基化的碳水化合物的IgG展示正常的与Fc y受体的受体结合。 相反地，与Fc γ RIIA受体的结合提高了 50%并且伴随增强的ADCC，特别地在更低的抗体浓度上。由Shinkawa，等人进行的工作显示，在大鼠杂交瘤中产生的抗人IL-5受体的 抗体，当与中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中产生的抗体相比较时，显示50%以上的更高的 ADCC (Shinkawa 等人.J Biol Chem. 2003278 (5) :；3466_7；3)。单糖组成和低聚糖特征显示大 鼠杂交瘤产生的IgG具有比CHO产生的蛋白质更低的岩藻糖含量。作者得出IgGl的岩藻 糖基化的缺乏在ADCC活性的增强中具有至关重要的作用。Umana,等人采用不同的方法，他们改变chCE7 (嵌合型IgGl抗成神经细胞瘤抗体) 的糖基化模式(Umana等人.Nat Biotechnol. 1999Feb ；17(2) :176-80)。通过使用四环素， 它们调节对牵涉于ADCC活性的低聚糖的糖基转移酶(&mll)的活性。亲本抗体的ADCC活 性勉强高于本底水平。在不同四环素水平上产生的chCE7的ADCC活性的测量显示对于最大 的chCE7的体外ADCC活性的&1TIH表达的最佳范围。该活性与恒定区相关的对切的复合低 聚糖的水平相关。最近最优化的变体展示充分的ADCC活性。类似地，feight和Morrison 在具有糖基化缺陷的CHO细胞系中产生抗体(1994J Exp Med 180 :1087-1096)并且显示在 该细胞系中产生的抗体不能进行补体介导的细胞裂解。因此所知的影响效应子功能的改 变包括糖基化模式的修饰或糖基化残基的数目的改变，本公开内容涉及Eph4B抗体，在所 述抗体中使糖基化改变以增强或减弱效应子功能，包括ADCC和⑶C。改变的糖基化包括糖 基化残基的数目的减少或增加以及糖基化残基的模式或位置的改变。仍然存在用于改变抗体的效应子功能的其他方法。例如，抗体产生性细胞可以是 高突变的，从而产生在整个抗体分子中具有随机改变的核苷酸和多肽残基的抗体(参见WO 2005/01173 。高突变宿主细胞包括在DNA错配修复上具有缺陷的细胞。以该方式产生的 抗体可具有较小的抗原性和/或具有有益的药物代谢动力学特性。此外，可就特征例如增 强的或减弱的效应子功能选择此类抗体。还应理解，效应子功能可根据抗体的结合亲和力变化而变化。例如，与具 有相对低的亲和力的抗体相比较，具有高亲和力的抗体可在激活补体系统中更有效 (Marzocchi-Machado 等人· 1999Immunol Invest 28 :89-101) 因此，可改变抗体以使对于 其抗原的结合亲和力减小(例如，通过使用方法例如一个或更多个氨基酸残基的置换、添 加或缺失改变抗体的可变区)。具有减少的亲和力的抗Eph4B抗体可展示减弱的效应子功 能，包括例如减弱的ADCC和/或⑶C。V.产生抗体的方法结合EphB4的细胞外结构域的解除免疫的抗体或抗原结合片段可通过本领域技 术人员已知的许多不同方法来产生。在一个实例中，使非人抗EphB4抗体解除免疫以增加 T或B细胞表位的数目或引入调节T细胞表位。可修饰起始非人或亲本抗EphB4抗体；例 如，其可以是嵌合型抗体、人源化抗体或灵长源化抗体的任何形式。备选地，在不进行人源 化或灵长源化化(primatization)步骤的情况下，解除起始非人或亲本抗EphB4抗体的免 疫原性。非人EphB4抗体
抗EphB4抗体对于本领域技术人员来说是已知的，包括例如美国专利5，635，177 以及美国申请2006/0134118和2005/0M9736中描述的抗体。这些文献中的每一篇合并入本文。产生新型抗EphB4抗体的方法对于本领域技术人员来说也是已知的。例如，用于 产生特异性结合EphB4多肽的单克隆抗体的方法可包括对小鼠施用一定量的包含有效地 刺激可检测的免疫应答的EphB4多肽的免疫原性组合物，从小鼠获得抗体产生性细胞，将 抗体产生性细胞与骨髓瘤细胞融合以获得抗体产生性杂交瘤，以及检测抗体产生性杂交瘤 以鉴定产生特异性结合EphB4多肽的单克隆抗体的杂交瘤。当获得后，在细胞培养中，任选 地在其中杂交瘤来源的细胞产生特异性结合EphB4多肽的单克隆抗体的条件下繁殖杂交 瘤。可从细胞培养物中纯化单克隆抗体。此外，用于筛选抗体以鉴定期望的抗体的技术可影响获得的抗体的性质。用于检 测抗体抗原相互作用以鉴定特别期望的抗体的多种不同技术是可获得的。此类技术包括 ELISA、表面等离子体共振结合测定(surface plasmon resonance binding assay)(例如， Biacore 结合测定，Bia-core AB,Uppsala, Sweden)、夹心测定(例如，IGEN International, Inc.，Gaithersburg，Maryland的顺磁珠粒系统)、western印迹、免疫沉淀测定和免疫组织 化学。可使用产生或分离具有需要的特异性的抗体的其他合适的方法，包括例如从 文库中选择重组抗体的方法或依赖于能够产生完全的人抗体库的转基因动物(例如， 小鼠)的免疫的方法。参见，例如，Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 2551-2555(1993) Jakobovits 等人，Nature，362 :255-258(1993) ；Lonberg 等人，美国专利 5，545，806 ；Surani 等人，美国专利 5，545，807。可以以许多方法对抗体进行基因工程。可将它们制备为单链抗体(包括小型免 疫药物制剂(small modular immuno pharmaceutical)或 SMIPs )、Fab 和 F(ab，)2 片段 等。抗体可以是人源化抗体、嵌合型抗体、解除免疫的抗体或完全人抗体。许多出版物列出 了许多类型的抗体以及对此类抗体进行基因工程的方法。例如，参见美国专利6，355，245, 6，180，370,5, 693，762,6, 407，213,6, 548，640,5, 565，332,5, 225，539,6, 103，889 和 5，260, 203。本申请提供了能够结合EphB4受体或其部分的抗原结合片段，包括但不限于Fv、 Fab.Fab'和F(ab' )2片段。此类片段可通过酶促切割或通过重组技术来产生。例如，木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可分别产生Fab或F(ab' ) 2片段。还可使用其中已在天然终止 位点上游导入了一个或更多个终止密码子的抗体基因以多种截断的形式产生抗体。例如， 可设计编码F(ab' ) 2重链部分的嵌合基因以包括编码重链的CHl结构域和铰链区的DNA 序列。嵌合型抗体还可通过本领域内已知的重组DNA技术产生。例如，用限制性酶降 解编码鼠(或其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因以除去编码鼠Fc的区域， 然后用编码人Fc恒定区的基因的等价部分替代(参见Robinson等人，国际专利公开 案PCT/US86/02269 ；Akira,等人，欧洲专利申请184，187 ；Taniguchi, M.，欧洲专利申请 171,496 ；Morrison 等人，欧洲专利申请 173，494 ；Neuberger 等人，国际申请 W086/01533 ； Cabilly等人，美国专禾Ij 4,816, 567 ；Cabilly等人，欧洲专利申请125,023 ；Better等人· (1988Science 240 :1041-1043) ；Liu 等人· (1987)PNAS 84 :3439-3443 ；Liu 等人， 1987，J.Immunol. 139 :3521-3526 ；Sun 等人· (1987)PNAS 84 :214-218 ；Nishimura 等人， 1987，Cane. Res. 47 :999-1005 ；Wood 等人· (1985) Nature 314 :446-449 ；和 Shaw 等人， 1988，J. NatlCancer Inst. 80 :1553-1559)。用于人源化抗体的方法已在本领域内进行了描述。在一些实施方案中，人源化抗 体，除了非人CDR外，具有一个或更多个导入的来自为非人来源的氨基酸残基。可基本上 按照 Winter 和同事的方法(Jones 等人.，Nature，321 :522-525(1986) ；Riechmann 等人， Nature, 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen 等人，Science, 239 1534-1536 (1988))，通过用高 变区序列替代人抗体的相应序列来进行人源化。因此，此类“人源化的”抗体是其中用来自 非人物种的相应序列替代绝明显少于完整人可变区的嵌合型抗体(美国专利4，816，567)。 实际上，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能地一些构架区残基被来自啮齿类动 物抗体中的类似位点取代的人抗体。属于Queen等人的美国专利5，693，761公开了对用于人源化抗体的Winter的改 进，该专利基于将亲合力的丢失归因于人源化构架区中结构基序中的问题的前提，所述人 源化构架区中的结构基序，由于立体化学或其他化学不相容性，干扰CDR折叠入小鼠抗体 中发现的能结合构象(binding-capable conformation)。为了解决该问题，Queen教导使用 在线性肽序列上与待人源化的小鼠抗体的构架序列紧密同源的人构架序列。因此，Queen 的方法集中在比较物种之间的构架序列上。通常，将所有可获得的人可变区序列与特定的 小鼠序列相比较，并且计算相应的构架残基之间的百分比同一性。选择具有最高百分比的 人可变区来提供用于人源化方案的构架序列。Queen还教导来自对于在能结合构象中支持 ⑶R是至关重要的小鼠构架的某些氨基酸残基保留在人源化构架中是非常重要的。根据分 子模型估量可能的临界状态(criticality)。保留的候选残基通常是在线性序列上与CDR 邻接或在物理上在任何CDR残基的6埃距离内的残基。在其他方法中，一旦获得低亲合力人源化结构，通过将单个残基回复至小鼠序列， 然后如由Riechmarm等人，(1988)所述，测定抗原结合来经验地确定特定构架氨基酸残基 的重要性。用于鉴定构架序列中重要的氨基酸的另一个示例性方法由属于Carter等人的 美国专利5，821，337和由属于Adair等人的美国专利5，859，205公开。这些参考文献公开 了构架中特定Kabat残基的位置，所述位置，在人源化抗体中可能需要用相应的小鼠氨基 酸来置换以保持亲合力。人源化抗体的另一种方法，称为“构架改组”，依赖于用按读框融合入单个的人种 系构架库的非人CDR可变区产生组合文库(Dair Acqua等人，Methods，36 :43(2005))。然 后筛选文库以鉴定编码保持良好结合的人源化抗体的克隆。用于产生人源化抗体的的人可变区(轻链和重链的)的选择对于减少抗原性是 非常重要的。根据所谓的“最适”方法，针对整个已知的人可变结构域序列文库筛选啮齿类 动物抗体的可变区的序列。然后将与啮齿类动物的序列最接近的人序列接受为用于人源 化抗体的人构架区(framwork 区)(Sims 等人.，J. Immunol.，151 :2296(1993) ；Chothia 等 人.，J. Mol. Biol. ,196 :901 (1987))。另一个方法使用来源于具有特定亚群的轻链或重链 可变区的所有人抗体的共有序列的特定构架区。相同的构架可用于几种不同的人源化抗体 (Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :4285 (1992) ；Presta 等人，J. Immunol. , 151 2623(1993))ο用于替代入人可变区的非人残基的选择可受许多因素影响。这些因素包括例如氨 基酸在特定位点中的稀有性、与CDR或抗原相互作用的概率以及参与轻链和重链可变结构 域界面之间的界面的概率。(参见，例如美国专利5，693，761、6，632，927和6，639，055)。分 析这些因素的一个方法是通过使用非人和人源化序列的三维模型。三维免疫球蛋白模型 通常是可获得的并且对于本领域技术人员来说是很熟悉的。图解说明和展示选择的候选免 疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的观察允许分析 残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合其 抗原的能力的残基。这样，可选择非人残基并且用其替代人可变区残基以获得期望的抗体 特征，例如增加的对靶抗原的亲和力。免疫解除解除抗EphB4抗体或抗原结合片段的免疫以使其对给定的物种无免疫原性或免 疫原性更小。免疫解除可通过对抗EphB4抗体进行结构改变来实现。在一个实施方案中， 抗EphBr是小鼠单克隆抗体。可使用本领域技术人员已知的任何免疫解除技术。在WO 00/34317(其公开内容以其全文通过引用合并入本文)中描述了例如用于使抗体解除免疫 的一个合适的技术。概括地说，本文中描述的一般方法中的典型方案包括下列步骤。1.确定抗体或其部分的氨基酸序列；2.通过任何方法确定抗体的氨基酸序列中的潜在T细胞表位，包括肽与MHC分子 的结合的确定、肽HLA复合物与来自接受治疗性蛋白的物种的T细胞受体的结合的确定， 使用转基因动物，用接受治疗性蛋白的物种的HLA分子检测抗体或其部分，或检测用来自 接受治疗性蛋白的特种的免疫系统细胞重建的此类转基因动物；3.通过基因工程或用于产生修饰抗体的其他方法，改变抗体以除去一个或更多个 潜在T细胞表位，从而产生这样的用于检测的改变的抗体。在一个实施方案中，可就MHC II类结合基序的存在分析抗体或抗原结合片段的 可变区的序列。例如，可以使用MHC结合基序的数据库，例如通过在sitewehil. wehi. edu. au上搜索万维网上的“基序”数据库来进行比较。备选地，可使用计算机缝合方法例如由 Altuvia等人.(J. Mol. Biol. 249244-250 (1995))设计的方法鉴定AHC II类结合肽，从而就 它们与MHC II类蛋白的结合能检测来自可变区序列的连续重叠的肽。计算机结合预测算 法包括i^Tope 、!1印itope、SYFPEITHI和MHCpred。为了帮助鉴定MHC II类结合肽，可寻找 与成功呈递的肽例如两亲性和Rothbard基序相关的相关序列特征和组织蛋白酶B和其他 加工酶的切割位点。在已鉴定了潜在的第二物种(例如人)T细胞表位后，然后通过改变一个或更多个 氨基酸(当需要时)以消除T细胞表位来消除这些表位。通常，这将包括T细胞表位本身 中一个或更多个氨基酸的改变。这可包括改变在蛋白质一级结构上与表位相邻的氨基酸或 改变在一级结构上不相邻但在分子的二级结构上邻近的氨基酸。预期的常见改变将是氨基 酸置换，但可能在某些情况下氨基酸添加或缺失也将是适当的。所有改变可通过重组DNA 技术来实现，这样可以例如利用已良好建立的方法通过从重组宿主表达来制备终分子，但 也可使用蛋白质化学或任何其他进行分子改变的方法。实际上，已公认，当使用MHC结合基序的数据库进行比较时，甚至可在人种系可变区的构架序列中鉴定潜在的人T细胞表位。由于人通常不引发抗它们自已的抗体的免疫应 答，因此人对于这些表位是耐受的或这些潜在表位不能被人APC呈递，因为它们不能被恰 当地加工。因此，种系可变区序列中代表的这样的潜在T细胞表位实际上可保留在解除免 疫的抗体中。为了在从治疗性抗体序列消除潜在的T细胞表位的过程中使额外T细胞表位的 产生降至最少，可通过置换特定的氨基酸来消除T细胞表位，这导致T细胞表位中非人或 亲本抗体(通常小鼠)的氨基酸至在位点上相应于人种系氨基酸的位点上的氨基酸的转 变。Tomlinson, I. A.等人· (1992) J. Mol. Biol. 227 :776-798 ；Cook, G. P.等人· (1995) Immunol. Today 第 16 卷(5) :237-242 ；Chothia, D.等人· (1992) J. Mol. Bio. 227 :799-817 中公开了人种系序列。V BASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由 Tomlinson, I. A.等人· MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK 汇编)。在一个方法中，鉴定与非人或亲本序列同源的人种系序列。备选地，可鉴定与非人 或亲本序列的各构架区(FR1-FR4)同源的人种系序列。在一个方法中，平行地就MHC II类 结合肽分析非人或亲本序列以及同源人种系序列。可鉴定其中MHC II类结合特征谱在非 人或亲本序列与人种系序列之间相异的区域。可就至相应的人氨基酸的转变选择非人或亲 本序列的这些区域中的氨基酸。当除去鉴定的T细胞表位后，可再次分析解除免疫的序列以确保未产生新的T细 胞表位并且，如果产生，可如上所述使表位缺失；或通过将非人或亲本氨基酸转变成相应的 人氨基酸来改变之前至相应的人种系氨基酸的转变，直至所有T细胞表位被消除。并非所有计算机鉴定的T细胞表位都需要去除。本领域技术人员将认识到特定表 位的“强度”或更确切地潜在免疫原性的意义。各种计算机方法产生潜在表位的评分。本 领域技术人员将认识到只有高评分表位才需要除去。本领域技术人员也将认识到在除去潜 在表位与保持原始非人可变区序列之间存在平衡，所述平衡可影响抗原结合。因此，一个策 略是将置换相继地导入非人或亲本抗体，然后就抗原结合和免疫原性对其进行检测。关于治疗性抗体的⑶R，一个或更多个潜在的T细胞表位与⑶R重叠或落入其中是 很普遍的，因此表位的除去需要改变CDR中的残基。为了消除T细胞针对此类表位的应答 的诱导，可能期望消除这些表位(虽然这可能减小所得抗体的结合亲和力)，从而可能需要 就所得的抗原结合的任何改变检测CDR的任何潜在改变。在一个实施方案中，改变解除免疫的抗体的序列以除去一个或更多个B细胞 表位。为了 除去人 B 细胞表位，可利用 Padlan (Padlan E. A. , MolecularImmunology 28489-498(1991)和 EP-A-0519596)的“镶饰(veneering) ” 或“表面重建”方法。在镶饰 非人抗原结合部位中存在两个一般步骤。开始时，将目的抗体分子的可变区的构架区与可 获得的人可变区数据库的相应构架区序列相比较。然后将最同源的人可变区逐个残基地与 相应的非人氨基酸相比较。使用本领域内熟知的重组技术用存在于人部分的残基置换非人 构架区中与人对应物(counterpart)不同的残基。使用至少部分暴露(溶剂可及的)的部 分进行残基转换，并且在可对可变区结构域的三级结构具有重大影响的氨基酸残基例如脯 氨酸、甘氨酸和带电荷的氨基酸的置换中要特别小心。外部残基的置换通常对内部结构域 或对结构域间接触具有极小的影响或没有影响。(参见，例如，美国专利6，797，492)。通过这种方式，从而设计所得的“镶饰的”非人抗原结合部位以使之保留非人CDR残基、十分邻近CDR的残基、鉴定为隐蔽或基本上隐蔽(溶剂不可及的)的残基、据信参与 重链和轻链结构域之间非共价(例如，静电和疏水)接触的残基以及来自构架区的保守结 构区的据信影响⑶R环的“经典(canonical)”三级结构的残基。然后将这些设计标准用于 制备将非人抗原结合部位的重链和轻链的CDR组合入存在人类中(human-appearing)的构 架区的重组核苷酸序列，所述序列可用于转染哺乳动物细胞以表达展示非人抗体分子的抗 原特异性的重组人抗体。在一个实施方案中，将调节T细胞表位导入抗体或抗原结合片段。 W006/082406(其通过引用合并入本文)描述了产生抗体的方法，在所述方法中，修饰抗体 的可变区以导入调控T细胞表位，所述表位反过来刺激CD4+CD25+T细胞并且诱导抑制性 细胞因子的分泌，从而减少免疫原性(参见，例如，Praliken BJ，等人.Proc Natl Acad Sci USA 94 :3284-3289(1997)。抗体或抗原结合片段的构建一般说来，使用遗传工程技术中所使用的公认的操作来实现本文中公开的抗体的 构建。例如，用于分离DNA、制备和选择用于表达DNA的载体、纯化和分析核酸的技术，用于 制备重组载体DNA(例如PCR)、用限制性内切酶切割DNA、连接DNA、通过稳定或瞬时方法将 DNA(包括载体DNA)导入宿主细胞、在选择或非选择培养基中培养宿主细胞以选择和维持 表达DNA的细胞的方法在本领域内通常是已知的。可使用合成和/或重组核酸制备编码期望的解除免疫的链的基因(例如，cDNA)来 产生此类解除免疫的免疫球蛋白。例如，可使用PCR诱变方法改变编码解除免疫的链的DNA 序列例如来自之前人源化的可变区的DNA模板来构建编码解除免疫的可变区的核酸(例 如，DNA)序列(参见，例如 Kamman，M.，等人，Nucl. Acids Res.，17 :5404 (1989)) ；Sato, K., 等人，Cancer Research, 53 :851-856 (1993) ；Daugherty, B. L.等人，Nucleic Acids Res., 19(9) :2471-2476(1991)；和 Lewis，A. P.和 J. S. Crowe，Gene，101 :297-302 (1991))。通过 使用此类或其他合适的方法，还可容易地产生变体。在一个实施方案中，可诱变克隆的可 变区，然后可选择(例如，从噬菌体文库；参见，例如，Krebber等人，美国专利5，514，548 ； Hoogenboom等人，WO 93/06213，1993年4月1日出版的))编码具有期望的特异性的变体 的序列。几个可能的载体系统可获得用于在哺乳动物细胞中表达克隆的重链和轻链基 因。一类载体依赖于期望的基因序列至宿主基细胞基因组中的整合。通过同时导入药 物抗性基因例如大肠杆菌(E. coli)gpt (Mulligan，R. C.和 Berg，P.，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 78 :2072 (1981))或 Tn5neo (Southern, P. J.禾口 Berg，P.，J. Mol. App 1. Genet.， 1 :327(1982))选择具有稳定地整合的DNA的细胞。可将选择标记基因连接至待表达的DNA 序列或通过共转染将其导入相同的细胞(Wigler,M.等人，Cell，16:77(1979))。第二类载 体利用赋予染色体外质粒自主复制能力的DNA元件。此类载体来源于动物病毒例如牛乳 头瘤病毒(bovine papillomavirus) (Sarver, N.等人· , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 79 7147(1982))、多瘤病毒(Deans, R. J.等人· , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,81 :1292(1984)) 或 SV40 病毒(Lusky, Μ. and Botchan, Μ.，Nature, 293 :79 (1981))。因为免疫球蛋白cDNA只由代表编码抗体的成熟mRNA的序列组成，因此需要调控 基因的转录和RNA的加工的额外的基因表达元件来分析免疫球蛋白mRNA。这些元件可包括剪接信号、转录启动子，包括诱导型启动子增强子和终止信号。整合此类元件的cDNA表达 载体包括由 Okayama, H.和 Berg, P.，Mol. Cell Biol.，3 :280(1983) ；C印ko，C. L.等人·， Cell,37 :1053(1984)；和 Kaufman，R. J. , Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA, 82 :689(1985)描述的载体。任选地可将可变序列融合至人恒定区，例如，人IgGl或κ恒定区。可将重组解除 免疫的抗体或抗原结合片段转染入用于表达的合适的宿主细胞例如NSO或CHO细胞以产生 完全重组抗体。VI.诊断应用抗体和抗原结合片段用于多种应用，包括研究、诊断和治疗性应用。例如，它们可 用于分离和/或纯化受体或其部分，以及用于研究受体结构(例如，构象)和功能。在某些方面，公开的不同抗体可用于检测和测量EphB4受体例如在内皮细胞(例 如，静脉内皮细胞)或在用EphB4受体基因转染的细胞上的表达。因此，它们还用于应用例 如用于诊断或研究目的细胞分选和成像(例如，流式细胞术和荧光激活细胞分选术)。在某些实施方案中，可就诊断目的标记或不标记抗体或抗原结合片段。通常，诊断 测定使得必需检测由于抗体与EphB4的结合而引起的复合物的形成。可直接标记抗体。可 使用多种标记物，包括但不限于放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂和 配体(例如，生物素、半抗原)。许多合适的免疫测定法对于本领域技术人员来说是已知的 (参见，例如，美国专利3，817，827,3, 850，752,3, 901，654和4，098，876)。当未标记时，抗 体可用于测定，例如凝集试验。还可将未标记的抗体与另一种(一种或更多种)可用于检 测抗体的适当的试剂例如与一抗(例如，对于未标记的免疫球蛋白是特异性的抗独特型抗 体或其他抗体)反应的标记抗体(例如，二抗)或其他适当的试剂(例如，标记A蛋白)一 起使用。在一个实施方案中，抗体和抗体片段可用于酶免疫测定，其中将受试抗体或二抗 缀合至酶。当将包含EphB4蛋白的生物样品与受试抗体组合时，在抗体与EphB4蛋白之间发 生结合。在一个实施方案中，将包含表达EphB4蛋白的细胞(例如，内皮细胞)的样品与受 试抗体组合时，在抗体与具有含有被抗体识别的表位的EphB4蛋白的细胞之间发生结合。 可将此类结合细胞与未结合的试剂分离，并且可以例如通过将样品与酶的底物(所述底物 当通过酶作用时产生颜色或其他可检测变化)接触来确定与细胞特异性结合的抗体-酶缀 合物的存在。在另一个实施方案中，可以不标记受试抗体，以及可加入识别受试抗体的第二 标记抗体。在某些方面，还可制备用于检测EphB4蛋白在生物样品中的存在的试剂盒。此类 试剂盒将包括结合EphB4蛋白或所述受体的部分的抗体以及一种或更多种适用于检测抗 体与EphB4或其部分之间的复合物的存在的辅助试剂(ancillary reagent)可以以冻干的 形式单独地或与另外的特异于其他表位的抗体组合来提供公开的抗体组合物。可将可以是 标记的或未标记的抗体与辅助成分(adjunct ingredient)(例如，缓冲液，例如Tris、磷酸 盐和碳酸盐、稳定剂、赋形剂、杀生物剂(biocide)和/或惰性蛋白质例如牛血清白蛋白) 一起包括在试剂盒中。例如，可将抗体与辅助成分以冻干的混合物形式提供，或可分开提供 辅助成分以待用户组合。通常这些辅助材料将以低于大约5%的基于活性抗体的量的重量 存在，通常将以至少大约0. 001 %的基于抗体浓度的重量的总量存在。在使用能够结合单克隆抗体的二抗的情况下，可以将这样的抗体例如在分开的小瓶或容器中提供于试剂盒中。 通常标记第二抗体(如果存在的话)，并且可以以与上文所述的抗体制剂类似的方式配制其。类似地，抗体或抗原结合片段可用于检测和/或定量EphB4或受体的部分在细胞 中的表达的方法，其中将包含细胞或其级分(例如，膜级分)的组合物与抗体接触，所述抗 体在适合于抗体与EphB4或受体的部分结合的条件下与EphB4或受体的部分结合，并且监 控抗体结合。指示抗体与EphB4或其部分之间的复合物的形成的抗体的检测表示受体的存 在。可通过标准方法例如工作实施例中描述的方法测定抗体与细胞的结合。方法可用于检 测EphB4在来自个体的细胞上的表达。任选地，可以例如通过流式细胞术估计内皮细胞表 面上EphB4的定量表达，并且可使染色强度与疾病易感性、进展或风险发生关系。抗体或抗原结合片段还可用于检测哺乳动物对某些疾病的易感性的方法。为了 举例说明，方法可用于检测哺乳动物对其进展基于细胞上存在的EphB4的量和/或哺乳动 物中EphB4阳性细胞的数目的疾病的易感性。在一个实施方案中，本申请提供了检测哺乳 动物对肿瘤的易感性的方法。在该实施方案中，将待检测的样品与抗体接触，所述抗体在适 合于所述抗体与EphB4或其部分结合的条件下与其结合，其中样品包含在正常个体中表达 EphB4的细胞。检测抗体的结合和/或结合的量，所述结合和/或结合的量显示个体对肿瘤 的易感性，其中更高的受体水平与增加的个体对肿瘤的易感性相关。本申请者和其他小组 已发现EphB4的表达与肿瘤生长和进展相关。还可将公开的抗体用于进一步阐明EphB4表 达与个体中血管生成相关疾病的进展的相关性。IIV.治疗应用在某些实施方案中，本申请提供了抑制血管生成的方法和治疗血管生成相关疾病 的方法。在一些实施方案中，本申请提供了用于促进细胞凋亡的方法。在其他实施方案中， 本申请提供了抑制或减少肿瘤生长的方法和治疗患有癌症的个体的方法。这些方法包括对 个体施用治疗有效量的上文所述的解除免疫的抗体或抗原结合片段。此类方法的目标特别 是针对动物，更特别地针对人的治疗性和预防性治疗。在一个实施方案中，当对人受试者施 用时，用于本方法的抗体或抗原结合片段比小鼠单克隆抗体#47的免疫原性更低。在另一 个实施方案中，用于本方法的抗体或抗原结合片段，当对人受试者施用时，比小鼠单克隆抗 体#131的免疫原性更低。本申请还提供了用于治疗血管生成相关疾病的药物组合物。在一些实施方案中， 药物组合物包含本文中描述的抗体或抗原结合片段和可接受的药物载体。本申请提供了促进细胞凋亡的方法，其包括将细胞与有效量的解除免疫的抗体或 抗原结合片段接触。在一些实施方案中，细胞是内皮细胞。本申请提供了抑制血管生成的方法，其包括将内皮细胞与有效量的解除免疫的抗 体或抗原结合片段接触。在某些实施方案中，所述血管生成由癌细胞诱导。可将抗体或抗 原结合片段在体外、离体地或在体内(例如，在受试者中)与内皮细胞接触。在另一个实施 方案中，抗体抑制癌细胞的血管生成例如至少10%、至少25%、至少50%、至少75%或至少 90%。可通过本领域内已知的基于体外细胞的测定例如内皮细胞管形成测定或本领域内已 知的体内动物模型测定来检查血管生成的抑制。如本文中所述，血管生成相关疾病包括但不限于血管生成依赖性癌症，包括例如实体瘤、血液传播瘤(blood born tumor)例如白血病，和瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤、听 神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和脓性肉芽肿；炎性病症例如免疫和非免疫炎症；慢性关节风湿 病和银屑病；眼新生血管性疾病(ocular angiogenic disease)例如糖尿病性视网膜病、 早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生 症(retrolental fibroplasia)、发红；Osier-Webber综合征；心肌血管新生、斑块新生血 管形成、毛细血管扩张、血友病关节、血管纤维瘤；和创伤肉芽形成和创伤愈合、毛细血管扩 张银屑病硬皮症、脓性肉芽肿、冠状动脉侧枝、肢端缺血血管再生、角膜疾病、发红、关节炎、 糖尿病新生血管化、骨折、血管生成和造血作用。应理解，公开的方法和组合物还用于治疗任何不依赖于血管生成的癌症(肿瘤)。 如本文中所使用的，术语“不依赖于血管生成的癌症”是指其中肿瘤组织中不存在或存在极 少的新生血管形成的癌症(肿瘤)。特别地，公开的抗体治疗剂用于治疗或预防癌症(肿瘤)，包括但不限于结肠癌、 乳腺癌、间皮瘤、前列腺癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck) (HNSCC)、卡波西肉瘤、卵巢癌和白血病。本申请提供了抑制受试者中癌细胞的生长的方法，包括将有效量的解除免疫的抗 体或抗原结合片段施用入受试者。调节可减少或防止所述受试者的癌细胞的生长例如至 少10 %、至少25 %、至少50 %、至少75 %或至少90 %。作为结果，在癌细胞是实体瘤的情况 下，调节可减少实体瘤的大小至少10%、至少25%、至少50%、至少75%或至少90%。癌细胞增殖的抑制可通过基于细胞的测定例如溴脱氧尿苷(BRDU)掺入(Hoshino 等人，Int. J. Cancer 38,369(1986) ；Campana 等人，J. Immunol. Meth. 107 :79(1988))； [3H]-胸苷掺入(Chen，J.，0ncogenel3 :1395-403(1996) Jeoung, J.，J. Biol. Chem. 270 18367-73(1995)；染料阿尔玛蓝(可从 Biosource hternational 获得)(Voytik-Harbin 等人，In VitroCell Dev Biol Anim 34 =239-46(1998))来测量。通过在软琼脂中进行的 集落形成，例如通过计数在软琼脂上面形成的癌细胞集落的数目(参见实施例和Sambrook 等人，Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989)来估量癌细胞的非停泊性生长 (anchorage independent growth)。受试者中癌细胞生长的抑制可通过监控受试者中例如动物模型或人受试者中 癌细胞生长来估量。一个示例性监控方法是肿瘤发生能力的测定。在一个实例中，异种 移植物包含来自预先存在的肿瘤或来自肿瘤细胞系的人细胞。肿瘤异种移植物测定在 本领域内是已知的并且在本文中进行了描述(参见，例如，Ogawa等人，Oncogene 19: 6043-6052(2000))。在另一个实施方案中，使用中空纤维测定法监控肿瘤发生能力，该方法 描述于美国专利5，698，413，其以其全文通过引用合并入本文。通过将在调节剂处理的条件下的癌细胞增殖、非停泊性生长或癌细胞生长与在阴 性对照条件(通常在调节剂处理不存在的情况下)下的相比较来计算抑制百分比。例如，在 癌细胞或癌细胞集落(集落形成测定)的数目或PRDU或[3H]-胸苷掺入是A (在调节剂处 理的条件下)和C(在阴性对照条件下)的情况下，抑制百分比可以是(C-A)/C乘以100%。在此类方法的某些实施方案中，可将一种或更多种抗体治疗剂一起(同时)或在 不同的时间(相继)施用。此外，可将抗体治疗剂与另一种类型的用于治疗癌症或抑制血 管发生的化合物一起施用。
在某些实施方案中，可单独使用公开的受试方法。备选地，可将受试方法与用于治 疗或预防增殖病症(例如，肿瘤)的其他常规抗癌疗法结合使用。例如，此类方法可用于预 防性癌症预防、癌症复发和手术后的转移的预防，以及用作其他常规癌症疗法的辅助疗法。 本申请承认可通过使用抗体或抗原结合片段增强常规癌症疗法(例如，化学疗法、放射疗 法、光线疗法、免疫疗法和手术)的功效。已显示许多常规化合物具有抗肿瘤活性。此类化合物已在化学治疗中用作缩小实 体瘤、防止转移和进一步生长或减少白血病或骨髓恶性肿瘤中恶性细胞的数目的药剂。虽 然化学疗法在治疗各种类型的恶性肿瘤中是有效的，但许多抗肿瘤化合物诱导不期望的副 作用。已显示，当组合两种或更多种不同治疗时，治疗可协同作用并且可使减少每一种治疗 的剂量，从而减小由各化合物在更高剂量上产生的有害副作用。在其他情况下，难以治疗的 恶性肿瘤可对两种或更多种不同治疗的组合作出反应。当将本文中公开的抗体或抗原结合片段与另一种常规抗肿瘤剂同时或相继地组 合施用时，此类抗体或抗原结合片段可增强抗肿瘤剂的治疗效果或克服对该抗肿瘤剂的细 胞抗性。这使得能够减少抗肿瘤剂的剂量，从而减小不期望的副作用，或恢复抗肿瘤剂在抗 性细胞中的功效。可用于组合抗肿瘤疗法的药物化合物包括(只用于举例说明)氨鲁米特、安丫 啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、beg、比卡鲁胺、博来霉素、乙基酰胺、白消安、喜树碱、卡培他滨、 卡钼(carboplatin)、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺钼、克拉屈滨、氯膦酸盐、秋水仙素、环磷酰 胺、去乙酰环丙氯地孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、双烯雌酚、己烯雌酚、 多烯紫杉醇、阿霉素、表柔比星、雌二醇、磷雌氮芥、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉 滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、吉西他滨、金雀异黄酮、戈舍瑞林、羟基脲、伊 达比星、异磷酰胺、伊马替尼、干扰素、依立替康、伊立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、醋酸亮 丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、安宫黄体酮、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨 蝶呤、丝裂霉素C、米托坦、盐酸米托蒽醌、尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利钼、紫杉醇、 氨羟二磷酸二钠、喷司他丁、普卡霉素、吓菲尔钠、甲基苄胼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链脲佐 菌素、苏拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、塞替派、二氯二茂钛、拓扑替 康、曲妥珠单抗、维甲酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。此类化学治疗抗肿瘤化合物可根据它们的作用机制分类为例如下列类型抗代 谢产物/抗癌剂例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脱氧核苷、卡培他滨、吉西他滨和 阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和 2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物例如长春花生物碱(长 春碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管干扰剂(microtubule disruptor)例如紫杉烷(紫杉醇、 多烯紫杉醇、长春新碱、长春碱、诺考达唑、埃博霉素和诺维本、印idipodophyllotoxins (依 托泊苷、替尼泊苷)，DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶、蒽环类药、博来霉素、白消安、喜树碱、 卡钼、苯丁酸氮芥、顺钼、环磷酰胺、环磷酰胺、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、 六甲基三聚氰胺奥沙利钼、异环磷酰胺、美法仑、merchlorehtamine、丝裂霉素C、盐酸米 托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、盐酸甲基苄胼、泰素、泰素帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰 胺和依托泊苷(VP16))；抗生素例如放线菌素(放线菌素D)、柔红霉素、阿霉素(阿霉素 (adriamycin))、依达比星、蒽环类药、盐酸米托蒽醌、博莱霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素C ；酶(全身性引起L-天冬酰胺代谢并且剥夺不具有合成它们自身的天冬酰胺的能 力的细胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂例如氮芥(双氯乙 基甲胺(mechlorethamine)、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥、乙撑亚胺和甲基三聚 氰胺(六甲密胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀BCNU)和类似物，链 脲佐菌素、trazenes-dacarbazinine (DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物例如叶酸类似 物(氨甲蝶呤)；钼配位络合物(顺钼、卡钼、甲基苄胼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激 素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、 阿那曲唑)；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐(synthetich印arin salt)和凝血酶的其他抑制 剂)；纤维蛋白溶解剂(例如组织纤维蛋白溶酶原激活物、溶栓霉和尿激酶、阿司匹林、双嘧 达莫、氯苄噻唑啶、氯吡格雷、阿昔单抗；抑制迁移剂(antimigratory agent)；抑制分泌剂 (antisecretory agent) (breveldin)，免疫抑制剂(环孢霉素A、他克莫司(Π(-506)、西罗 莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯；抗血管生成化合物(ΤΝΡ-470，染料木黄酮)和生长 因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管 紧张素体阻断剂(angiotensin receptor blocker)；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体 (曲妥单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂 (阿霉素(adriamycin)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、放线菌素、去羟桅子苷、表柔比星、依 托泊苷、依达比星和盐酸米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康、皮质激素(可的松、地塞米松、氢 化可的松、甲基强的松龙、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体机 能障碍诱导剂和半胱天冬酶(caspase)激活物；和染色质干扰剂(chromatin disrupter)。在某些实施方案中，可用于组合抗血管生成疗法的药物化合物包括(1) “血管 生成分子”例如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的释放抑制剂；( 血管生成分子的中 和剂例如抗^bFGF抗体；和(3)内皮细胞对血管生成刺激物的应答的抑制剂，包括胶原 酶抑制剂、基底膜周转抑制剂(basement membrane turnover inhibitor)、血管生成抑制 甾醇(Angiostatic steroids)、真菌来源的血管生成抑制剂、血小板因子4、血小板反应蛋 白(thrombospondin)、关节炎药物例如D-青霉胺和硫代硫酸金(gold thiomalate)、维生 素D3类似物、α干扰素等。关于另外提及的血管生成的抑制剂，参见，Blood等人，Bioch. Biophys. Acta.，1032 :89-118 (1990)，Moses 等人，Science, 248 :1408-1410(1990)，Ingber 等人，Lab. Invest. ,59 :44-51 (1988)，和美国专利 5, 092, 885,5, 112, 946,5, 192，744、 5，202，352和6573256。此外，存在可用于抑制血管生成的多种化合物例如阻断VEGF介导 的血管生成途径的肽或试剂、内皮他丁蛋白或衍生物、血管他丁的赖氨酸结合片段、黑色素 或促黑色素化合物、血纤蛋白溶酶原(例如，血纤蛋白溶酶原的Kringles 1_3)、肌钙蛋白 亚基、玻连蛋白αν β 3的拮抗剂、来源于Saposin B的肽、抗生素或类似物(例如，四环素 或新霉素)、含有地诺孕素的组合物、含有偶联至肽的MetAP-2抑制性核心的化合物、化合 物EM-138、查耳酮(chalcone)和其类似物以及二肽酶抑制剂(naaladase inhibitor)。参 见，例如，美国专利 6，395，718,6, 462，075,6, 465，431,6, 475，784,6, 482，802,6, 482，810、 6，500，431,6，500，924,6，518，298,6，521，439,6，525，019,6，538，103,6，544，758, 6，544，947,6, 548，477,6, 559，126 和 6，569，845。取决于组合疗法的性质，在施用其他疗法的同时和/或之后，可继续施用EphB4解 除免疫的抗体或抗原结合片段。可以以单个剂量或更多个剂量进行EphB4解除免疫的抗体或抗原结合片段的施用。在一些情况下，在常规疗法之前至少7天开始EphB4解除免疫的 抗体或抗原结合片段的施用，然而在其他情况下，在即将施用常规疗法之前或同时开始施用。VIII.施用和配制的模式在某些实施方案中，用药学可接受的载体配制EphB4解除免疫的抗体或抗原结合 片段。可单独或作为药物制剂(组合物)的成分施用此类抗体或抗原结合片段。可以以用 于人或兽医药剂的任何常规方法配制用于施用的抗体或抗原结合片段。湿润剂、乳化剂和 润滑剂例如硫酸月桂酯钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣衣料、甜味剂、调味剂和芳 香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。EphB4解除免疫的抗体或抗原结合片段的制剂包括适合于口服/经鼻、局部、胃肠 外、直肠和/或阴道内施用的制剂。制剂可以常规地以单位剂型的形式存在，以及可通过药 学领域内熟知的任何方法来制备。可与载体材料组合以产生单个剂型的活性成分的量可视 治疗的宿主，特别地施用模式而变化。可与载体材料组合以产生单个剂型的活性成分的量 通常是产生治疗效果的化合物的量。在某些实施方案中，制备此类制剂或组合物的方法包括将另一种类型的抗肿瘤或 抗血管生成治疗剂和载体以及任选地，一种或更多种辅助成分组合。一般而言，可用液体载 体或固体载体粉末或两者制备制剂，然后如果需要，为产物塑形。用于口服施用的制剂可以以胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用有味道的基 质，通常蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶(tragacanth))、粉剂、粒剂的形式存在或以水性或非水 性液体中的溶液或悬浮液的形式存在，或以水包油或油包水液体乳剂的形式存在，或以酏 剂或糖浆剂的形式存在，或以锭剂(使用惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)和/ 或口腔洗剂等的形式存在，各自包含预先确定量的EphB4解除免疫的抗体或抗原结合片段 作为活性成分。在用于口服施用的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、锭剂、粉剂、粒剂等)中，可将 一种或更多种EphB4解除免疫的抗体或抗原结合片段与一种或更多种药学上可接受的载 体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或任何下列物质混合(1)充填剂或增充剂例如淀粉、乳 糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯 吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；⑶湿润剂例如甘油；⑷崩解剂例如琼脂、碳酸钙、马 铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；( 溶液阻滞剂例如石蜡；(6)吸收促进 剂(absorption accelerator)例如季胺类化合物；(7)湿润剂例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油 酯；(8)吸收剂例如高岭土和膨润土粘土； (9)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体 聚乙二醇、月桂基硫酸钠(sodium lauryl sulfate)和其混合物；和(10)着色剂。在胶囊 剂、片剂和丸剂的情况下，药学上可接受的组合物还可包含缓冲剂。相似类型的固体组合 物还可用作软填充胶囊和硬填充胶囊的填充剂，所述胶囊使用这样的赋形剂如乳糖或奶糖 (milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等。用于口服施用的液体剂型包括药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬液、糖浆剂 和酏剂。除了活性成分以外，液体剂型可包含本领域内常用的惰性稀释剂例如水或其他溶 剂、增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、 1，3_ 丁烯醇、油(特别地棉籽油、落花生油、玉米油、胚油、橄体油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和去水山梨糖醇的脂肪酸酯和其混合物。除了惰性稀释剂外，口服 组合物还可包含佐剂例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味料、着色剂、香味剂和防腐 剂。除了活性化合物以外，悬浮液可包含悬浮剂例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山 梨醇(polyoxyethylene sorbitol)和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和黄芪胶和其混合物。特别地，可对皮肤或对粘膜例如子宫颈和阴道上的粘膜局部施用公开的方法。这 为在诱导副作用的可能性最小的情况下直接递送至肿瘤提供了最大的可能性。局部制剂还 可包含已知作为有效的皮肤或角质层穿透促进剂的许多试剂中的一种或更多种试剂。此类 试剂的实例是2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲乙酰胺、二甲基酰胺、丙二醇、甲醇 或异丙醇、二甲基亚砜和氮酮(azone)。还可包含另外的试剂以配制化妆上可接受的制剂。 此类试剂的实例是脂肪、蜡、油、染料、香料(fragrance)、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。还 可包含角质层分离剂例如本领域内已知的角质层分离剂。实例是水杨酸和硫磺。用于局部或经皮肤施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶 液、patches和吸入剂。将EphB4解除免疫的抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体， 以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或喷射剂在无菌条件下混合。除了受试多肽试剂外， 软膏、糊剂、乳膏和凝胶还可包含赋形剂例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、 纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。粉剂和喷雾剂可包含，除了受试多肽治疗剂外，赋形剂例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧 化铝、硅酸钙和聚酰胺或此类物质的混合物。喷雾剂可额外地包含常规喷射剂例如氯氟烃 和挥发性未取代烃例如丁烷和丙烷。适合于胃肠外施用的药物组合物可包含一种或更多种EphB4解除免疫的抗体和 抗原结合片段与一种或更多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮 液或乳剂或可在即将使用前可重建成无菌注射液或悬浮液的无菌粉剂组合，其可包含抗氧 化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与期望的受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。可用于 公开的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙 二醇、聚乙二醇等)和其适当的混合物、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。 可以例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需颗粒大小以通过 使用表面活性剂来保持适当的流动性。此类组合物还可包含佐剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种 抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、山梨酸酚(phenol sorbic acid)等来确 保免受微生物的作用。还可期望在组合物中包含等渗剂例如糖、氯化钙等。此外，可注射药 物形式的延长的吸收可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生。通过在生物可降解的聚合物例如聚乳酸-乙醇酸交酯 (polylactide-polyglycolide)中形成一种或更多种EphB4解除免疫的抗体和抗原结合片 段的微囊化基质来制备可注射depot形式。取决于药物对聚合物的比例以及使用的特定聚 合物的性质，可控制药物释放的速度。其他生物可降解的聚合物的实例包括多正酯类和聚 酐。还可通过将药物俘获在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备Depot可注射制 剂。
用于阴道内或直肠施用的制剂可以以栓剂的形式存在，其可通过将一种或更多种 公开的化合物与一种或更多种合适的无刺激性赋形剂或载体(包含例如可可脂、聚乙二 醇、栓剂蜡(suppository wax)或水杨酸酯)混合来制备，并且其在室温下是固体，但在体 温下是液体，从而将在直肠或鞘膜腔熔化，并且释放活性化合物。适合使用的药物组合物包括其中以有效地实现它们的期望的目的的量包含一种 或更多种EphB4解除免疫的抗体和抗原结合片段的组合物。更特别地，治疗有效量是指有 效地预防、减轻或改善疾病的症状或延长正在治疗的受试者的存活时间的抗体的量。特别 地根据本文中提供的详细公开内容，治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之 内。治疗有效量可通过使用体外和体内方法来确定。
实施例实施例1 解除免疫的抗体的产生如美国申请2005/0M9736中所述制备小鼠单克隆抗体#47和#131。简而言之，在 小鼠中产生抗EphB4的细胞外结构域(EOT)的抗EphB4单克隆抗体。将EphB4的E⑶克隆 入pGEX-4T-l以产生GST-融合ECD (GST-ECD)。通过亲和层析纯化在BL21大肠杆菌中表达 为GST融合蛋白的EphB4E⑶，并且用凝血酶切割GST结构域。通过标准方案产生单克隆抗 体并且通过A蛋白层析从杂交瘤上清液纯化所述抗体。使用用EphB4稳定地转染的293细 胞的全细胞裂解物，通过Western印迹再次确认抗体的灵敏性和特异性。在序列表中提供 了 #47和#131的序列。使用Swiss Pdb产生鼠序列的结构模型以鉴定参与抗原结合亲和力的氨基酸。只 鉴定 Kabat 和 Chothia CDR。然后在芯片上分析鼠序列以鉴定MHC II类结合表位。平行地，就各单个的鼠构架 区鉴定最接近的人种系抗体。通过在鼠序列中进行置换消除潜在表位。从同源人种系基因 获得置换的残基。产生一系列变体，通常4或5个，以检测各种置换对抗原结合亲和力的影 响。使用标准方法从重叠的寡核苷酸合成变异的可变区。然后克隆可变区并且表达为 人IgGl/κ抗体。独立地产生#47和#131的重链和轻链变体的所有组合。将组合瞬时转 染入CHO-Kl细胞，收获细胞和上清液以检测活性。表1描述了用于亲本和解除免疫的可变区的SEQ ID NO。列出了解除免疫的变体 的重(H)链和轻(K)链可变区(V)的蛋白质和核苷酸序列。还列出了小鼠单克隆#47和 #131(m47,ml31)抗体的可变区以及重(H)链和轻⑷链的单个CDR的蛋白质序列。图2A-D 还描述了小鼠单克隆亲本抗体对解除免疫的变体的可变区的比对。表 1.
权利要求
1.结合EphB4的细胞外结构域的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变 区和轻链可变区，其中各可变区在构架区中具有2至20个氨基酸置换。
2.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中构架区中的2至20个置换是 与结合EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较的。
3.利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其具有与小鼠单克隆抗体#131， ATCC#PTA-6214相似或更大的结合亲和力。
4.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中一个或更多个所述置换，与 非人或亲本抗体相比较，减少解除免疫的抗体或其抗原结合片段中的T细胞表位的数目。
5.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中一个或更多个所述置换，与 非人或亲本抗体相比较，减少解除免疫的抗体或其抗原结合片段中的B细胞表位的数目。
6.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中一个或更多个所述置换，与 非人或亲本抗体相比较，在解除免疫的抗体或其抗原结合片段中导入调节T细胞表位。
7.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中一个或更多个置换增加抗体 或抗原结合片段的构架区与与所述构架区同源的人种系基因序列之间的序列同一性。
8.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中1至5个氨基酸存在于互补 决定区(CDR)。
9.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有多至18个氨基酸置换。
10.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有多至17个氨基酸置换。
11.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有至少5个氨基酸置换。
12.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有至少7个氨基酸置换。
13.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有至少9个氨基酸置换。
14.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有多至18个氨基酸置换。
15.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有多至16个或更少的氨基酸置换。
16.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有多至14个或更少的氨基酸置换。
17.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有至少3个氨基酸置换。
18.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有至少5个氨基酸置换。
19.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区，与结合 EphB4的细胞外结构域的非人或亲本抗体相比较，具有至少7个氨基酸置换。
20.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原结合片段抑制培养的内皮细胞形成管。
21.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段在体内抑制组织的血管化作用。
22.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段减少小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。
23.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片 段包含含有Fc区域的重链恒定区。
24.权利要求23的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区域具有改变的效 应子功能。
25.权利要求对的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述效应子功能得到增强。
26.权利要求对的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述效应子功能被减弱。
27.权利要求25的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中除去Fc区域中的N-糖基化。
28.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其包含一个或更多个来自非人 或亲本抗体的互补决定区(CDR)。
29.权利要求观的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段 在人受试者中比所述非人或亲本抗体的免疫原性更低。
30.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段抑制EphB4的二聚化或多聚化。
31.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4的自磷酸化作用。
32.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段刺激EphB4激酶的活性。
33.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段结合EphB4的第一纤连蛋白样结构域。
34.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段结合EphB4的第二纤连蛋白样结构域。
35.权利要求1的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中将解除免疫的抗体或其抗 原结合片段缀合至细胞毒性剂。
36.权利要求35的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性剂选自放射 性试剂、植物、真菌或细菌来源的分子、生物蛋白质、长春碱、4-去乙酰长春花碱、长春新碱、 异长春碱和长春地辛。
37.权利要求观的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述非人或亲本抗体是小 鼠单克隆抗体#47或小鼠单克隆抗体#131。
38.权利要求37的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区中一个或更 多个所述置换在选自根据Kabat编号系统的位点5、12、40、66、75和83的氨基酸位点上发 生。
39.权利要求38的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区中一个或更多个所述置换选自位点5上的缬氨酸、位点12上的赖氨酸、位点40上的丙氨酸、位点66上的 精氨酸、位点75上的苏氨酸和位点83上的精氨酸。
40.权利要求37的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区中一个或更多 个所述置换在选自根据Kabat编号系统的位点45、74和100的氨基酸位点上发生。
41.权利要求40的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区中一个或更多 个所述置换选自位点45上的赖氨酸、位点74上的苏氨酸、位点100上的谷氨酰胺。
42.权利要求37的抗体，其中所述重链可变区包含a)选自SEQID NO=USEQ ID NO: 3、SEQ ID NO :4, SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11 禾口 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FRl， b)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :10 的 SEQ ID NO :13 的氨基 酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)选自 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 10 氨基酸 113 至 123 的 FR4。
43.权利要求37的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含a)选 自 SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 的氨基酸 1 至 23 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 18 的氨基酸 35 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :15 和 SEQ ID NO :17 的 氨基酸57至88的FR3 ；和d)选自SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 15的氨基酸98-107的FR4。
44.权利要求37的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含含有 SEQ ID NO 19 的 CDR1、含有 SEQ ID NO 20 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO 21 的 CDR3 ；并且其 中轻链包含含有SEQ IDNO 22的CDRl、含有SEQ ID NO :23的CDR2和含有SEQ ID NO 24 的 CDR3。
45.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段在人受试者中比小鼠单克隆抗体#47的免疫原性更低。
46.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段以为小鼠单克隆抗体#47对EphB4的细胞外结构域的结合亲和力的至少80%的结 合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。
47.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段以为小鼠单克隆抗体#47对EphB4的细胞外结构域的结合亲和力的至少90%的结 合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。
48.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段以为小鼠单克隆抗体#47对EphB4的细胞外结构域的结合亲和力的至少100%的 结合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。
49.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段抑制EphB4与肝配蛋白B2的细胞外部分的结合。
50.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段抑制EphB4的二聚化或多聚化。
51.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4的自磷酸化作用。
52.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原结合片段刺激EphB4激酶的活性。
53.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段结合EphB4的第一纤连蛋白样结构域。
54.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段结合EphB4的第二纤连蛋白样结构域。
55.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中将解除免疫的抗体或其抗 原结合片段缀合至细胞毒性剂。
56.权利要求55的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性剂选自放 射性试剂、植物、真菌或细菌来源的分子、生物蛋白质、长春碱、4-去乙酰长春花碱、长春新 碱、异长春碱和长春地辛。
57.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段抑制培养的内皮细胞形成管。
58.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段在体外抑制血管化作用。
59.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段减少小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。
60.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段包含含有Fc区域的重链恒定区。
61.权利要求60的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区域具有改变的效 应子功能。
62.权利要求61的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述效应子功能得到增加。
63.权利要求61的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述效应子功能被减弱。
64.权利要求63的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中除去Fc区域中的N-糖基化。
65.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含a) 选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO 1的氨基酸113至123组成的FR4 ；并且其中所述轻链可变区包含a)由SEQ ID NO 6 的氨基酸 1 至 23 组成的 FRl，b)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9 的 氨基酸 35 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸 57 至88的FR3 ；和d)由SEQ ID NO 6的氨基酸98至107组成的FR4。
66.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含选 自:a) SEQ ID NO 1 ；b)SEQ ID NO 2 ；c)SEQ ID NO :3,d) SEQ ID NO :4和 e) SEQ ID NO :5 的 氨基酸序列。
67.权利要求44的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含选 自:a) SEQ ID NO 6 ；b)SEQ ID NO 7 ；c)SEQ ID NO 8 和 d) SEQ ID NO 9 的氨基酸序列。
68.权利要求66的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含选自:a) SEQ ID NO 6 ；b)SEQ ID NO 7 ；c)SEQ ID NO :8 禾口 d) SEQ ID NO 9 的氨基酸序列。
69.权利要求68的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含选自a)SEQ ID N0:7和b)SEQ ID NO :8 的氨基酸序列。
70.权利要求68的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含选自a)SEQ ID N0:7和b)SEQ ID NO :8 的氨基酸序列。
71.权利要求69的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列。
72.权利要求37的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变 区，其中所述重链可变区包含含有SEQ ID NO 25的⑶Rl，含有SEQ ID N0J6的⑶R2和含 有SEQ ID NO 27的⑶R3 ；并且其中所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO 28的⑶R1，含有 SEQ ID NO 29 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO 30 的 CDR3。
73.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段在人受试者中比小鼠单克隆抗体#131的免疫原性更低。
74.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段以为小鼠单克隆抗体#131对EphB4的细胞外结构域的结合的结合亲和力的至少 80%的结合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。
75.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段以为小鼠单克隆抗体#131对EphB4的细胞外结构域的结合的结合亲和力的至少 90%的结合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。
76.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段以为小鼠单克隆抗体#131对EphB4的细胞外结构域的结合的结合亲和力的至少 100%的结合亲和力结合EphB4的细胞外结构域。
77.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段抑制EphB4与肝配蛋白B2的细胞外部分的结合。
78.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段抑制EphB4的二聚化或多聚化。
79.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4的自磷酸化作用。
80.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段刺激EphB4激酶的活性。
81.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段结合EphB4的第一纤连蛋白样结构域。
82.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段结合EphB4的第二纤连蛋白样结构域。
83.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中将解除免疫的抗体或其抗 原结合片段缀合至细胞毒性剂。
84.根据权利要求83的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性剂选自放射性试剂、植物、真菌或细菌来源的分子、生物蛋白质、长春碱、4-去乙酰长春花碱、长春 新碱、异长春碱和长春地辛。
85.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段 抑制培养的内皮细胞形成管。
86.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段管在体内抑制组织的血管化作用。
87.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段减少小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。
88.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中解除免疫的抗体或其抗原 结合片段包含含有Fc区域的重链恒定区。
89.权利要求88的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区域具有改变的效 应子功能。
90.权利要求89的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述效应子功能得到增加。
91.权利要求89的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述效应子功能被减弱。
92.权利要求91的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中除去Fc区域中的N-糖基化。
93.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含a)选 自 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11 禾口 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :10、 SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO 10的氨基酸113至123组成的FR4 ；并且其中所述轻链可变区包含a)选自SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 的氨基酸 1 至 23 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 18 的 氨基酸35至49的FR2 ；c)选自SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 17的氨基酸57至88的FR3 ； 和d)由SEQ ID NO 15的氨基酸98至107组成的FR4。
94.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含选 自:a) SEQ ID NO :10 ；b) SEQ ID NO 11 ；c)SEQ ID NO :12,d) SEQ ID N0:13*e)SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。
95.权利要求72的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含选 自:a) SEQ ID NO :15 ;b) SEQ ID NO: 16，c) SEQ ID NO :17 和 d) SEQ ID NO :18 的氨基酸序 列。
96.权利要求94的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含选自a)SEQ ID N0:17*b)SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。
97.权利要求94的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含选自a)SEQ ID N0:17*b)SEQ ID NO 18的氨基酸序列。
98.权利要求97的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQ ID N0:14的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO 18的氨基酸序列。
99.结合EphB4的细胞外结构域的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可 变区和轻链可变区，其中所述抗体或抗原结合片段以与亲本或非人抗体相同或更大的亲 和力结合，并且其中所述抗体或其抗原结合片段具有一个或更多个下列特征a)各可变区 完全来源于一个或更多个人抗体；b)各可变区，与所述亲本或非人抗体相比较，具有减少 的T细胞表位数目；和c)各可变区，与所述亲本或非人抗体相比较，具有减少的B细胞表位 数目。
100.权利要求99的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中一个或更多个下列残基 存在于重链可变区中位点5上的缬氨酸、位点12上的赖氨酸、位点40上的丙氨酸、位点66 上的精氨酸、位点75上的苏氨酸以及位点83上的精氨酸，所述位点根据Kabat编号系统。
101.权利要求99的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中一个或更多个下列残基 存在于轻链可变区中位点45上的赖氨酸、位点74上的苏氨酸和位点100上的谷氨酰胺， 所述位点根据Kabat编号系统。
102.权利要求99的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含含 有 SEQ ID NO 25 的 CDRl、含有 SEQ ID NO 26 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO 27 的 CDR3 ；并且 其中所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO 28的⑶Rl、含有SEQ ID NO 29的⑶R2和含有 SEQ ID NO 30 的 CDR3。
103.权利要求102的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含a) 选自 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO IUSEQ ID NO: 12 禾口 SEQ ID NO :14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO 10 的氨 基酸113至123组成的FR4 ；并且其中所述轻链可变区包含a)选自SEQ ID N0:15和SEQ ID NO 16的氨基酸1至23的FRl，b)选自SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO 18的氨基酸；35至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 17 的氨基酸 57 至 88 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 15的氨基酸98至107组成的FR4。
104.权利要求99的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含含 有 SEQ ID NO 19 的 CDRl、含有 SEQ ID NO 20 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO :21 的 CDR3 ；并且 其中所述轻链包含含有SEQ ID NO :22、含有SEQ ID NO 23的CDR2和含有SEQ ID NO 24 的 CDR3。
105.权利要求104的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含 a)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸 1 至 30 的 FR1，b)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d) 由SEQ ID NO 1的氨基酸113至123组成的FR4 ；并且其中所述轻链可变区包含a)由SEQ ID NO 6 的氨基酸 1 至 23 组成的 FRl，b)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9 的氨基酸；35 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸 57至88的FR3 ；和d)由SEQ ID NO 6的氨基酸98至107组成的FR4。
106.解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其结合EphB4的细胞外结构域并且免疫原性 低于从具有ATCC保藏号PTA-6214的杂交瘤获得的#131抗体，并且以与所述从杂交瘤获得 的抗体相同的或更大的亲和力结合。
107.权利要求106的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含含 有 SEQ ID NO 25 的 CDRl、含有 SEQ ID NO 26 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO 27 的 CDR3 ；并且 其中所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO 28的⑶Rl、含有SEQ ID NO 29的⑶R2以及含 有 SEQ ID NO 30 的 CDR3。
108.权利要求107的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含a) 选自 SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 11 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :10、SEQ ID NO IUSEQ ID NO: 12 禾口 SEQ ID NO :14 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO: 10 的氨 基酸113至123组成的FR4 ；并且其中所述轻链可变区包含a)选自SEQ ID N0:15和SEQ ID NO 16的氨基酸1至23的FRl，b)选自SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO 18的氨基酸；35至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 17 的氨基酸 57 至 88 的 FR3 ；禾口 d)由 SEQ ID NO 15的氨基酸98至107组成的FR4。
109.解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其结合EphB4的细胞外结构域并且免疫原性 低于从具有ATCC保藏号PTA-6211的杂交瘤获得的#47抗体，并且以与所述从杂交瘤获得 的抗体相同的或更大的亲和力结合。
110.权利要求109的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含含 有 SEQ ID NO 19 的 CDR1、含有 SEQ ID NO 20 的 CDR2 和含有 SEQ ID NO 21 的 CDR3 ；并且 其中所述轻链包含含有SEQID NO 22的CDRl、含有SEQ ID NO 23的CDR2和含有SEQ ID NO 24 的 CDR3。
111.权利要求110的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含a) 选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 的氨基酸 1 至 30 的 FRl，b)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 36 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的氨基酸 67 至 98 的 FR3 ；和 d)由 SEQ ID NO 1的氨基酸113至123组成的FR4 ；并且其中所述轻链可变区包含a)由SEQ ID NO 6 的氨基酸 1 至 23 组成的 FRl，b)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 9 的 氨基酸；35 至 49 的 FR2 ；c)选自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 的氨基酸 57 至88的FR3 ；和d)由SEQ ID NO 6的氨基酸98至107组成的FR4。
112.结合EphB4的细胞外结构域的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可 变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含下列位点5上的缬氨酸、位点12上的赖氨 酸、位点40上的丙氨酸、位点66上的精氨酸、位点75上的苏氨酸和位点83上的精氨酸中 的一个或更多个，所述位点根据根据Kabat编号系统。
113.权利要求112的解除免疫的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含下 列位点45上的赖氨酸、位点74上的苏氨酸以及位点100上的谷氨酰胺中的一个或更多 个，所述位点根据Kabat编号系统。
114.降低减少受试者中肿瘤生长速率的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的 权利要求1至113的任一项的解除免疫的抗体或其抗原结合片段。
115.权利要求114的方法，其中所述受试者是人受试者。
116.治疗患有癌症的受试者的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的权利要求 1至113的任一项的解除免疫的抗体或其抗原结合片段。
117.权利要求116的方法，其中所述受试者是人受试者。
118.权利要求116的方法，其中所述受试者被诊断患有选自结肠癌、乳腺癌、间皮瘤、 前列腺肿瘤、鳞状上皮细胞癌、卡波西肉瘤、卵巢癌和白血病的癌症。
119.权利要求116的方法，其中全身性施用解除免疫的抗体或其抗原结合片段。
120.权利要求116的方法，其中局部施用解除免疫的抗体或其抗原结合片段。
121.抑制受试者中血管生成的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用有效量的 权利要求1至113的任一项的抗体。
122.权利要求121的方法，其中所述受试者被诊断患有黄斑变性。
123.权利要求121的方法，其中所述受试者是人受试者。
124.包含权利要求1至113的任一项的解除免疫的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
125.权利要求1至113的任一项的解除免疫的抗体或其抗原结合片段用于制备用于治 疗癌症的药剂的用途。
126.权利要求125的用途，其中所述癌症选自结肠癌、乳腺癌、间皮瘤、前列腺肿瘤、鳞 状上皮细胞癌、卡波西肉瘤、卵巢癌和白血病。
127.权利要求1至113的任一项的解除免疫的抗体或其抗原结合片段用于抑制受试者 中血管生成的用途。
全文摘要
在某些实施方案中，本申请提供了结合EphB4蛋白的人源化抗体以及所述抗体用于治疗目的的用途。
文档编号C07K16/30GK102083861SQ200880111128
公开日2011年6月1日 申请日期2008年8月11日 优先权日2007年8月13日
发明者F·J·卡尔, P·吉尔, S·W·基恩, T·D·琼斯, V·克拉斯诺佩罗夫 申请人:瓦斯基因治疗公司