人源化c-Kit抗体的制作方法

专利名称：：人源化c-Kit抗体的制作方法
技术领域：
：本申请要求2006年4月24日递交的美国临时申请第60/794,771号的优先权，并将该临时申请并入本文作为参考。本发明涉及治疗c-Kit相关的炎症、纤维化疾病、自身免疫性疾病和癌症的组合物，还涉及包含人源化c-Kit抗体的组合物。
背景技术：
：肥大细胞参与介导炎症，例如哮喘、类风湿性关节炎和炎性肠病，其在过敏性炎症中的作用也己经得到广泛承认。肥大细胞的数目在来自严重哮喘患者的肺外植体中增加，并且是临床相关炎症介质，例如白三烯、组胺和Th2细胞因子的主要来源。肥大细胞还是疾病组织中预形成的TNF的主要来源。干细胞因子(SCF)是一种糖蛋白，其通过下文中称作c-Kit的细胞和膜相关酪氨酸激酶受体进行信号转导，此信号转导途径通常与其它细胞因子协同地在造血活动中起正调节和负调节因子的关键作用。脱落的可溶性c-Kit受体起调节SCF的作用。c-Kit在是淋巴系和红细胞系成熟细胞前体的多能造血千细胞上表达。与其它造血细胞不同的是，肥大细胞的前体和成熟的肥大细胞保持了高水平的c-Kit表达。因此，通过c-Kit的SCF信号转导对于肥大细胞的发育、功能、运输和存活至关重要，并且也在配子发生和黑素合成中起作用。在W位点发生c-Kit失活突变的小鼠几乎没有肥大细胞。人体中的活化c-Kit的突变与肥大细胞增多症相关。c-Kit阳性多能造血干细胞是包括间叶细胞、成纤维细胞和肥大细胞的多种细胞类型的前体。纤维化疾病的部分特征在于成纤维细胞活性过高和过分增殖导致的细胞外基质沉积。已有报道称c-Kit阳性的骨髓多能造血干细胞是纤维化组织中成纤维细胞和肥大细胞的来源。肥大细胞可为炎症介质、造血介质、促有丝分裂和成纤维介质提供稳定来源。肥大细胞在功能和解剖学上与成纤维细胞偶联，并且在活化成纤维细胞中起直接作用。肥大细胞增进成纤维细胞介导的胶原收縮、细胞外基质沉积的动力学性质和强度并可以将成纤维细胞转化成肌成纤维细胞。成纤维细胞则分泌SCF以进一歩活化并扩增肥大细胞，这两种细胞类型都是成纤维网络的组分。在包括特发性肺纤维化(idi叩athicpulmonaryfibrosis,IPF)和硬皮病(scleroderma)在内的大多数人纤维化疾病中，肥大细胞的数目和肥大细胞介质均显著升高。在一些硬皮病患者和硬皮病的Tsk小鼠模型中检测到有差异的肥大细胞表现型。侵袭性系统性肥大细胞增多症可被表征为骨髓纤维化，这表明肥大细胞是纤维化中的效应细胞。GleevecTM和其它如SutentTM类的药物是靶向c-Kit信号转导活性，但也能够抑制许多其它激酶的多耙标酪氨酸激酶受体抑制剂。这些激酶抑制剂被指明用于肿瘤治疗。已有报道指出Gleevec导致了骨髓抑制、贫血以及包括心脏毒性和外周水肿在内的许多副作用。因此，这些分子在长期治疗C-Kit信号转导相关疾病的风险预测方面不具有最优效益。因此，人们需要新的治疗方案和试剂，特别是那些效力更强、选择性更好，且在治疗c-Kit相关炎症和纤维化疾病时具有更高安全性的治疗方案和试剂。此类化合物还可以对如髓性白血病的癌症、如GIST和肥大细胞增多症的c-Kit突变相关疾病、与黑色素瘤和多种SCLC中也出现的c-Kit过表达和/或SCF自分泌活性过高相关的疾病显示出显著提高的疗效和安全性质。目前尚缺乏靶向人c-Kit的能够影响治疗效益，但没有显著副作用的治疗方案和试剂。发明概述本发明提供作为拮抗剂以及细胞相关和膜c-Kit受体处的SCF的中性拮抗剂的试剂，例如单克隆抗体。在一个更具体的实施方案中，提供了结合c-Kit的人源化(非鼠源)单克隆抗体。在另一个更具体的实施方案中，本发明的人源化抗体包含选自SEQIDNo.2、4和6列出的氨基酸序列。本发明还提供了编码任一上述抗体或特异性结合剂的核酸。在本发明的一个相关实施方案中，提供了包含任一上述核酸序列的载体。在另一个实施方案中，提供了包含任一上述核酸或载体的宿主细胞。6在一个实施方案中，c-Kit结合剂和中性拮抗剂可包含SEQIDNo.2、4或6的氨基酸序列。在另一个实施方案中，任一上述试剂包含与SEQIDNo.2、4和6列出的氨基酸序列中的一个或多个具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列。在此类实施方案中，分别对应于SEQIDNo.2、4或6的序列变异可以表现为，例如，在那个位点使用可选的人类氨基酸的IgG对应骨架区的保守性取代。在示范性实施方案中，所述抗体或结合c-Kit的特异性结合剂包含SEQIDNo.2、4或6列出的氨基酸序列。然而，可预期本发明的抗体可以是多个IgG抗体亚型的混合物(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚型的混合物)。例如，上述抗体均可以是天然或突变的IgG抗体(例如，IgGl或IgG3亚型或任意其它IgG亚型)。根据表面等离子共振(BIAcore分析)的测定，上述抗体可显示出表征为kd小于lxl(^或小于lx10—3、lxlO-4、lxlO-5、lxl()-6、lxlO-7、lxlO-8、lxl(T9的亲和力。根据细胞试验的测定，上述抗体可显示出小于lxl(^或小于lx10—3、1xlO-4、lxlO-5、lxl(T6、lxl(T7、lxlO-8、1xl(T9的中性拮抗剂IC50。在--个具体实施方案中，所述人源化抗体的亲和力和功能效力至少可与亲本鼠抗体的亲和力和效力相比。在一个优选的实施方案中，所述人源化抗体不是c-Kit受体激动剂并不激活导致类过敏反应的肥大细胞，但它应该显示出至少可与亲本鼠抗体相比的PD/PK和免疫原性质。本发明涉及多个方法。例如，提供了一种制备上述抗体或特异性结合剂的方法，包含培养上述宿主细胞以表达核酸从而产生抗体或试剂。此类方法还包括从宿主细胞培养物中回收抗体或试剂的步骤。在一个相关的实施方案中，提供了由上述方法制备的分离抗体或试剂。本发明进一步提供了使用任一上述抗体或特异性结合剂的方法，例如通过施用有效量的上述抗体或特异性结合剂治疗或预防c-Kit相关病症。此类可治疗病症的一个实例是纤维化疾病。附图简述图1:SR-1抑制创伤活化模型中的肥大细胞。图2:创伤愈合模型中的肥大细胞计数。图3:人源化SR-1亚型抑制干细胞因子(SCF)引发的c-Kit活化以及随后经c-Kit的磷酸化作用。发明详述分别并入本文作为参考的美国专利第5,919,911号和美国专利第5,489,516号描述了鼠抗人c-Kit抗体SR-1。SR-1显示出合适的c-Kit结合特性并且阻断SCF介导的受体信号转导，然而，除了明显的免疫原性问题之外，该分子并不具有人类治疗方案所需要的所有特点。Broudy报道了SR-1具有一些可能导致受体内化和磷酸化的激动剂样活性(JCellPhysiol.1994Mar;158(3):545-54)。这些功能活性导致此分子效力和安全性下降。虽然单克隆抗体的人源化是一种成熟的方法，并且通常可正确翻译出期望的生物活性，但是依赖于人类骨架区的人源化SR-1抗体的构象可能导致针对c-Kit的不同内在活性和以此造成的不同生物功能。在此具体实施例中，所追求的是所需的药理学性质，而不是非理想的"激动剂"性质，但是实现这一目的的方法尚未被公开。已将SR-1抗体的互补决定区插入结构上不同于IgGl、IgG2禾口IgG4的人类重链和轻链的独特组合中，并意外地保持了相似的对c-Kit的亲和力。然而，己证明这些骨架区都有缺陷。已证明IgG2背景中的人源化SR-1对c-Kit具有高亲和力，但是在多种细胞类型中不能完全阻断SCF介导的受体内化，并且在肥大细胞的培养试验中导致c-Kit磷酸化并介导非正常的细胞凝集现象，其中c-Kit磷酸化是一种细胞生存信号。由于治疗策略的目的是通过阻断SCF生存信号使肥大细胞和其前体凋亡耗尽，并且避免可导致体内类过敏反应的肥大细胞活化，因此这些性质具有潜在的不利性。当将鼠SR-lCDR区插入人IgGl骨架区时，抗体的亲和力和功能效力得到保持，但是由于在此亚型的抗体中经常发现补体激活和细胞介导的细胞毒性，因而此背景并不适合。当将鼠SR-1CDR区插入人IgG4骨架区时，抗体的亲和力和功能效力也可以得到保持，然而在纯化和扩增此分子的过程中意外出现了显著的聚集现象。因此，本发明人经过努力创造出了一种不具有补体激活性并不会活化c-Kit和肥大细胞，同时保留了对膜c-Kit受体而非可溶性c-Kit受体的所需的8亲和力、中性拮抗剂效力的抗体，从而克服了以上各分子的缺点。这种抗体还可以显示出适合的PD/PK，能够有效消除肥大细胞，并且没有在体内激动肥大细胞的迹象。人源化SR-1k轻链SEQIDNo.1表示编码SR-1人源化k轻链的核酸AGTGTTGA(SEQIDNo.1)以下为SEQIDNo.2，其中粗体的部分表示CDR(例如，CDR1是SEQIDNo.2中第43至第58位氨基酸，CDR2是SEQIDNo.2中第74至第80位氨基酸，和CDR3是SEQIDNo.2中第113至第121位氨基酸)。1MVLQTQVF1SLLLWISGAYGD1VMTQSPDSLAVSLGERATincrasesvd51iygnsemhwyQQKPGQPPKLl1ylasnlesGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS101SLQAEDVAVYycqqnnedpyTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK201STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO.2)SEQIDNo.2中第20至第248位氨基酸是成熟的人源化k轻链。人源化SR-1脱糖基-IgGl重链SEQIDNo.3SEQIDNo.4中粗体的部分表示CDR(例如，CDRl是SEQIDNo.4中第50至第54位氨基酸，CDR2是SEQIDNo.4中第69至第85位氨基酸，和CDR3是SEQIDNo.4中第118至第125位氨基酸)51YNMHWVRQAPGQGLEWMGVIYSGNGDTSYNQKFKGRVTITADKSTSTAYM<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQIDNo.5)以下为SR-lIgG2重链的全长氨基酸序列，且CDR以粗体字表示:51Y薩HWVRQAPGQGLEWMGVIYSGNGDTSYNQKFKGRVTITADKSTSTAYM101ELSSLRSEDTAVYYCARERDTRFGNWGGGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPC151201251301NAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKT401QPE腦YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH451YTQKSLSLSPGK(SEQIDNo.6)SR-lMULCTTGA(SEQIDNO.7)CDR以粗体字表示:121METDTLLLWVLLLWVPGSTGNIVLTQSPASLAVSLGLRATISCRASESVD51IYGNSEMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTID101PVEADDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLT151SGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMS201STLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQIDNo.8)SR-lmuIgG2a重链TCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGA(SEQIDNo.9)421GSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQIDNo.10)SR-1的轻链CDR1是RASESVDIYGNSFMH(SEQIDNo.8中第44至第58位氨基酸)，CDR2是LASNLES(SEQIDNo.8中第74至第80位氨基酸)，和CDR3是QQNNEDPYT(SEQIDNo.8中第111至第121位氨基酸)。重链CDR1是SYNMH(SEQIDNo.10中第50至第54位氨基酸)，CDR2是VIYSGNGDTSYNQKFKG(SEQIDNo.10中第69至第85位氨基酸)，CDR3是RDTRFGN(SEQIDNo.10中第118至第125位氨基酸)。应当理解的是本申请中所描述的各个重链和轻链均会在细胞中被加工成成熟形式。也就是信号肽会被切除，并且抗体重链的C末端的赖氨酸会被切除。因此，所述成熟形式已经过蛋白酶解加工并且还包含其它翻译后修饰，例如在哺乳动物细胞中表达时的糖基化修饰。各重链和轻链的信号肽为SEQIDNo.2和10中第1至第20位氨基酸，以及SEQIDNo.4、6和10中的第1至第19位氨基酸。SEQIDNo.7和SEQIDNo.8列出了鼠SR-1轻链的核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNo.9和SEQIDNo.10列出了鼠SR-1重链的核苷酸和氨基酸序列。具有进一步取代(例如鼠氨基酸的保守性取代)的变体也可保留高结合亲和力。可在CDR和骨架区的位点中进行取代、删除或插入而不影响亲和力。在一个实施方案中，所述人源化抗体包含保留了原始鼠SR-1的CDR，例如，SEQIDNo.8中44-58附近、74-80附近和113-121附近的位点的轻链。在另一个实施方案中，所述人源化抗体包含保留了鼠SR-1的CDR，例如，SEQIDNo.10中50-54附近、68-85附近和118-125附近的位点的重链，并且具有源自于人类的骨架区。应当理解的是，本文中所使用的术语"附近"是指在维持对c-Kit亲和力的情况下的2至5个氨基酸位点的改变。在一个实施方案中，此类试剂可包含SEQIDNo.2、4或6所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，任一上述试剂包含与SEQIDNo.2、4和6列出的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列。在此类实施方案中，分别对应于SEQIDNo.2、4或6的序列变异可以表现为，例如，在那个位点使用可选的人类氨基酸的IgG对应骨架区的保守性取代。在一个实施方案中，根据表面等离子共振(BIAcore分析)的测定，上述抗体可显示出表征为Kd小于1x10—2或小于1x10—3、1x10—4、1x10—5、1x10—6、lxl(T7、lxl0—8、lxlO力的的亲和力。在另一个实施方案中，根据细胞试验的测定，上述抗体可显示出小于lxl0々或小于lx10—3、lxl(T4、lxIO-5、lx10-6、lxl(T7、lxlO-8、1x10-9的中性拮抗剂IC50。本发明提供了多种特异性结合剂和中性拮抗剂，包括但不限于人或人源化的c-Kit特异性抗体，所述c-Kit特异性抗体衍生自鼠SR-1并保留了期望的性质，例如对c-Kit的Kd(解离常数)为1x10—2或更小，或者低至1x10—9或更小(例如，1x10-2、1x10-3、1x10"、1xl(T5、1xl(T6、1xIO.7、1x10—8、lxlO力或更小)禾口/或对c-Kit的中性拮抗IC50为lxlO^或更小，或者低至1xIO-9或更小(例如，1xIO'2、1xl(T3、1x10-4、1xIO-5、1xl(T6、1x10隱7、lx10—8、lxlO"或更小)禾Q/或缓解c-Kit相关病变症状的能力。本发明还提供了编码所述特异性结合多肽的核酸、载体和包含所述核酸重组宿主细胞、制备所述特异性结合剂的方法、包含所述特异性结合剂的药物制剂、制备所述药物制剂的方法以及使用所述药物制剂和化合物治疗患者的方法。本发明构建了编码这些修饰的轻链可变区的核酸，并将其与编码CDR移植重链或人源化重链的核酸进行了共表达(反之亦然)，并可选择性地将其连接到恒定区。在维持适合的结合亲和力的条件下，可以将任意的人源化或嵌合重链和轻链进行组合。将所需基因导入哺乳细胞，并表达、纯化和表征所得的重组免疫球蛋白产物。本文中所使用的术语"抗体"具有最广泛的含义，并包括完全组装的抗15体、单克隆抗体(包括人、人源化或嵌合抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及能够与抗原结合的抗体片段(例如，Fab'、F(ab)2、Fv、单链抗体、微型双功能抗体)，还包含上述抗体的互补决定区(CDR)，只要它们能够显示出所需的生物活性。术语"抗体"明确地将鼠抗体(即，由鼠杂交瘤产生的抗体或具有与鼠杂交瘤产生的抗体相同序列的抗体)从该术语的范围中排除了。术语"特异性结合剂"包括上述定义的抗体以及重组肽或包含由具有所需抗原结合性的CDR衍生出的序列的其它化合物。此术语还特别地包括含有与鼠SR-1的一个或多个CDR具有至少80%、90%或100%同一性的氨基酸序列的肽，优选地包括重链CDR3。本文中所使用的术语"中性拮抗剂"应被理解为是指能够抑制激动剂活性的特异性结合剂。这些试剂包括上述定义的抗体和重组肽或包含由具有所需抗原结合性的CDR衍生出的序列的其它化合物。此术语还特别地包括含有与鼠SR-1的一个或多个CDR具有至少80%、90%或100%同一性的氨基酸序列的肽，优选地包括重链CDR3。此术语还包括"多肽抗体"(peptibodies)，即包含作为"载体"而被连接到至少一个抗原结合肽上的抗体Fc域的分子。来自SR-1抗体的抗体CDR适合于被整合到多肽抗体中，特别是包括重链的CDR3。公开于2000年5月4日的PCT公开文本WO00/24782简要描述了多肽抗体的生产方法。可使用或不使用接头而将肽串联(即依次连接)。包含半胱氨酸残基的肽可与另一个包含半胱氨酸残基的肽发生交联，其中任意一个或两个肽与载体连接。任何具有一个以上半胱氨酸残基的肽也可形成肽内二硫键。所有这些肽均可进行衍生化，例如可使用氨基基团对羧基末端进行封闭加帽，将半胱氨酸加帽或使用非氨基酸残基部分取代氨基酸残基(参见，例如，Bhatnagar等人，J.Med.Chem.39:3814-9(1996)禾口Cuthbertson等人，J.Med.Chem.40:2876-82(1997)，其全文并入本文作为参考)。可对肽序列进行类似于抗体亲和力成熟的优化，或通过丙氨酸扫描或随机/定点突变改变肽序列，随后通过扫描鉴定最优的结合序列(Ann.Rev.biophys.Biomol.Struct.26:401-24(1997))。可将多种分子插入特异性结合剂的结构中，例如，肽部分本身或特异性结合剂的肽与载体部分之间)，同时保持特异性结合剂的所需活性。例如，人们可以容易地插入分子，例如Fc域或其片段、聚乙二醇或其它相关分子，例如葡聚糖、脂肪酸、脂质、胆固醇基团、小碳水化合物、肽、细胞毒性剂、化疗剂、本文所述的可检测部分(包括荧光剂、如放射性同位素的放射性标记)、寡糖、寡核苷酸、多核苷酸、干涉RNA(或其它RNA)、酶、激素或类似物。本领域技术人员可鉴别适合于以此方式插入的其它分子，这些分子也包含在本发明的范围之内。例如，包括在两个连续氨基酸之间插入所需的分子，任选地通过合适的接头进行连接。所述"分离"抗体是指经过鉴定并从其表达细胞的组分中分离出来的抗体。细胞的污染组分是指可干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，包括酶、激素和其它蛋白质样或非蛋白质样的溶质。在一个优选实施方案中，将抗体纯化至(1)以抗体重量计大于95%，且最优选以重量计大于99%，(2)足以获得N末端或内部氨基酸序列中的至少15个残基的程度，或(3)在使用考马斯亮蓝染色，或优选地使用银染色的还原或非还原条件下的SDS-PAGE中显示均一性。发生自然分离的抗体包括重组细胞中的原位抗体，因为此时抗体天然环境中的至少一种组分缺失。然而，分离抗体通常是通过至少一个纯化步骤制备的。本文中所使用的术语"单克隆抗体"是指从基本同源的抗体群获得的抗体，也就是说除了可能存在少量天然发生的突变之外，抗体群中所包含的抗体个体是相同的。与通常包括靶向不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体具有高度特异性，靶向单一的抗原位点或表位。可以依据重链恒定区的氨基酸序列将人免疫球蛋白分成不同的类。存在有5个主要的类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的几个可以进一步分成亚类或亚型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为ouS、s、Y和p。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型均是公知的。不同的亚型具有不同的效应器功能；例如，IgGl和IgG3亚型具有ADCC活性。术语"超变"区是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包含来自于互补决定区或CDR的氨基酸残基(即，Kabat等，S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)中所述的轻链可变区残基24-34(Ll)、50-56(L2)以及89-97(L3)和重链可变区31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3))。即便是单个CDR也可以识别并结合抗原，虽然其亲和力低于包含所有CDR的完整抗原结合部位。需要了解的是，只要抗体能够保持其对目标分子的结合能力，抗体的CDR抗原可包含上述指定限制之外的更多或更少的序列。Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)将超变"环"残基的另一个定义描述为轻链可变区残基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3)。"骨架区"或FR残基是指除了超变区残基之外的那些可变区残基。"抗体片段"包含完整全长抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；微型双功能抗体、线性抗体(Zapata等人，ProteinEng.,8(10):1057-1062(1995));单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个相同的被称为"Fab"片段的抗原结合片段，以及-个包含恒定区的残留"Fc"片段，其中每个Fab片段各带有-一个抗原结合位点。Fab片段包含所有的可变区，以及轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fc片段上带有糖，并且负责很多抗体效应器功能(例如，结合补体和细胞受体)，这些效应器功能可用来区分不同类的抗体。胃蛋白酶处理会产生一个具有两个"单链Fv"的F(ab')2片段或包含抗体Vh和Vl域的"sFv"的抗体片段，其中Vh和Vj或存在于单一的多肽链上。由于在重链CHl域的羧基末端包含了几个额外的残基，其包括一个或多个抗体铰链区的半胱氨酸残基，而使得Fab片段不同于Fab'片段。优选地，Fv多肽还包含位于Vh和VL域之间的多肽接头，从而使Fv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述可参见Pluckthun所著的ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds"Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。"Fv"是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这一区域由经非共价键紧密链接的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。在此构型中，每个可变区的三个CDR相互作用以在Vh-Vl二聚体的表面限定出抗原结合位点。六个CDR—同赋予抗体抗原结合的特异性。然而，单个可18变区(或Fv的一半，仅包含3个抗原特异性CDR)也具有识别并结合抗原的能力，虽然其亲和力低于完整的结合位点。术语"微型双功能抗体"是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在相同多肽链(Vh-Vl)中相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VJ。通过使用短到不足以使相同链上的两个域发生配对的接头，促使所述域与另一个链上的互补域配对并产生两个抗原结合位点。微型双功能抗体更详细地描述于如EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。现己开发出多种用于生产抗体片段的技术。这些片段在传统上是通过完整抗体的蛋白酶消化得来的，但是也可以直接由重组宿主细胞产生。参见，例如Better等人，Science240:1041-1043(1988);Skerra等人，Science240:1038-1041(1988);Carter等人，Bio/Technology10:163-167(1992)。本发明所提供的用于治疗炎症、自体免疫疾病、肿瘤和纤维化疾病的组合物和方法可单独使用或与其它治疗剂组合使用一种或多种抗c-Kit治疗剂以达到期望的效果。可用于本发明的抗纤维化剂的实例包括细胞因子，而其中所述细胞因子选自于转化生长因子(3(TGF-p)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-9(IL隱9)、白细胞介素-13(IL-D)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白细胞介素-1(3(IL-ip)、结缔组织生长因子(CTGF)、白细胞介素-6(IL-6)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生生长因子(PDGF)、单核细胞趋化蛋白KCCL2/MCP-1)和肺部活化调节趋化因子(CCL18/PARC)。优选通过重组DNA方法，使用本领域熟知的抗体表达系统之一(参见，例如HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory(1988))制备本发明的衍生自SR-1的抗体。此类抗体优选为具有衍生自免疫球蛋白的可变序列和人类恒定区的嵌合融合蛋白质，或更优选为包含人类抗体残基但优选至少保留鼠SR-1的CDR的更类似于人抗体的单克隆抗体(例如，人抗体或人源化抗体)。在完整的全长分子之外，术语"抗体"还包括完整分子的片段、多聚体或聚集体和/或与c-Kit结合的片段。术语"人源化抗体"是指衍生自非人类抗体的抗体，通常是衍生自鼠单克隆抗体的抗体。或者，人源化抗体可衍生自嵌合抗体，所述嵌合抗体保留19了或基本保留了亲本非人类抗体的抗原结合性质，但在施用到人体后显示出比亲本抗体小的免疫原性。本文中所使用的术语"嵌合抗体"是指包含衍生自两种不同抗体的序列的抗体(参见，例如美国专利第4,816,567号)，其中所述两种不同抗体通常来自不同的物种。最典型的嵌合抗体包含人类和鼠抗体片段，通常为人的恒定区和鼠的可变区。抗体的重组制备可以通过直接对蛋白质进行测序来测定目标免疫球蛋白的氨基酸序列，并根据通用密码子表设计适合的核苷酸编码序列。或者，可以使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合单克隆抗体重链和轻链的编码基因的寡核苷酸)由杂交瘤细胞分离编码单克隆抗体的DNA，并进行测序。序列测定通常需要分离至少部分目标基因或cDNA。这通常需要克隆DNA，或优选地克隆编码单克隆抗体的mRNA(即cDNA)。可使用标准技术(参见，例如Sambrook等人，(1989)Molecular.Cloning:ALaboratoryGuide,Vols1-3,ColdSpringHarborPress,其文件已并入本文作为参考)进行克隆。例如，可以通过逆转录polyA+mRNA，优选逆转录膜相关mRNA(membrane-associatedmRNA)构建cDNA文库，并使用人类免疫球蛋白多肽基因序列特异的探针对文库进行筛选。然而，在一个优选实施方案中使用了聚合酶链式反应(PCR)来扩增编码目标免疫球蛋白基因片段(例如，轻链可变片段)的cDNA(或全长cDNA的一部分)。可以很容易地将扩增序列克隆进任何合适的载体，例如表达载体、小基因载体(minigenevector)或噬菌体展示载体中。应当了解的是只要能够测定目标免疫球蛋白多肽的部分序列，所使用的具体克隆方法并不重要。本文中所使用的"分离"核苷酸分子或"分离"核酸序列是指(O从至少一条通常与天然来源核酸相结合的污染核酸分子中鉴定并分离的核酸分子，或(2)能够从背景核酸中克隆、扩增、标记或分离，从而测定目标核酸序列的核酸分子。分离核酸分子的形式或背景与其天然存在的不同。然而，分离的核酸分子包括正常表达抗体的细胞中含有的核酸分子，其中该核酸分子在所述细胞中的染色体定位与在天然细胞中的定位不同。从转基因小鼠的B细胞，并将所得B细胞与永生细胞相融合而产生的杂20交瘤是用于克隆和测序的RNA的一个来源。使用杂交瘤的一个优点在于其易于筛选并选择产生目的人单克隆抗体的杂交瘤。或者，可以从经免疫的动物的B细胞(或整个脾脏)中分离RNA。在使用非杂交瘤的其它来源时，可能需要筛选编码免疫球蛋白或具有特异结合特征的免疫球蛋白多肽的序列。一种用于此类筛选的方法是使用噬菌体展示技术。噬菌体展示描述于例如，Dower等人，WO91/17271;McCafferty等人，WO92/01047以及Caton和Koprowski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6450-6454(1990)中，所述文献均并入本文作为参考。在一个使用噬菌体展示技术的实施方案中，从经免疫的转基因小鼠中分离cDNA(例如，总脾脏cDNA)，使用聚合酶链式反应扩增编码部分免疫球蛋白多肽(例如，CDR区)的cDNA序列，并且将扩增序列插入噬菌体载体。通过如淘选法(panning)的标准技术鉴定编码目标肽的cDNA，例如编码具有所需结合特征的可变区肽的cDNA。随后确定扩增或克隆的核酸的序列。典型的方案是测定编码免疫球蛋白多肽的整个可变区的序列，然而，有些情况下，仅测定可变区的一部分，例如编码CDR的部分也是足够的。通常，测序部分的长度为至少30个碱基，更常见的是对可变区编码长度的至少三分之一或至少二分之一的碱基进行测可以使用从cDNA文库中分离的克隆进行测序，或者在使用PCR的情况下，可以在将扩增序列进行亚克隆之后进行测序，或通过PCR直接对扩增序列进行测序。可以使用标准技术(例如，参见Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryGuide,Vols1-3,ColdSpringHarborPress;禾口Sanger,F.等人，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463-5467，以上文献已并入本文作为参考)进行测序。通过将克隆核酸的序列与人类免疫球蛋白基因和cDNA的公开序列进行比对，本领域技术人员能够根据测序的区域很容易地确定(i)杂交瘤免疫球蛋白多肽(包括重链亚型)的种系片段特征和(ii)重链和轻链可变区的序列，包括由N-区添加和体细胞突变过程产生的序列。免疫球蛋白基因序列信息的一个来源是位于美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.)的美国国家医学图书馆(NationalLibraryofMedicine)所属的美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)。21DNA分离后，即可将其可操作地连接于表达控制序列或将其插入表达载体，随后转染到宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或转染前不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以指导重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。抗体的重组生产是本领域熟知的技术。表达控制序列是指可操作性连接的编码序列在特定宿主体内表达所必需的DNA序列。例如，适合于原核细胞的控制序列包括启动子，优选操纵子序列，以及核糖体结合位点。已知真核细胞可利用启动子、多腺苷化信号和增强子。当核酸与另一个核酸序列产生功能上的关联时，即被可操作性地连接。例如，如果前序列或分泌引导序列的DNA被表达为参与分泌多肽的前蛋白质，那么前序列或分泌引导序列的DNA被可操作性地连接于所述多肽的DNA;如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么所述启动子或增强子被可操作性地连接于所述序列；如果核糖体结合位点的定位能够促进翻译，那么所述核糖体结合位点被可操作性地连接于所述编码序列。一般而言，可操作地连接是指将DNA序列连续连接，并且在分泌引导序列的情况下，是指DNA序列连续连接并能够进行读码。然而，增强子不一定是连续的。可以通过在方便的限制性位点的连接反应完成连接。如果不存在此类位点，则可以参照常规操作使用合成的寡核苷酸适配子或接头。本文中所有常交替使用名称细胞、细胞系和细胞培养物均包括其子代。转化体和转化细胞包括初代处理细胞和不计传代次数的其衍生培养物。需要理解的是，由于有意或无意突变，并非所有子代含有的DNA都完全一致。具有与筛选的初始转化细胞相同的功能或生物活性的突变子代也被包括在内。本发明还提供了任选地可操作地连接于被宿主细胞识别的控制序列的编码本发明的特异性结合剂或抗体的分离核酸，包含所述核酸的载体或宿主细胞，以及用于生产所述特异性结合剂或抗体的重组技术，所述重组技术可包含培养宿主细胞以表达所述核酸，以及可选地，从宿主细胞培养物或培养基中回收所述特异性结合剂或抗体。本领域中已经已知多种载体。载体组分可包括下列的一种或多种信号序列(例如，可指导所述特异性结合剂或抗体的分泌)、复制起点、一个或多个可选择的标记基因(例如，赋予抗生素或其它药物抗性、与营养缺陷型互补或提供培养基中缺乏的关键营养)、增强子元件、启动子和转录终止序列，所有以上组分均为本领域所熟知。合适的宿主细胞包括上述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。适合于此目的的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，如肠杆菌禾斗(五"tera6acfen'"ceae)的埃希氏菌属(^&c/zen'c/z/fl)(例如大肠杆菌(￡.co/0)、肠道杆菌属(五"feraZ)acfer)、欧文氏菌属(￡rw/w'")、克雷伯氏菌属(尺/efe/e〃a)、变形杆菌属(Prato^)、沙门氏菌属(&/mw7e〃")(例如，鼠伤寒沙门菌(&z/mo"e〃a(v//2/wwhwm))、沙雷氏菌属(5ferra"a)(例如，茅占质沙雷氏菌(&rraf/"和志贺氏菌属(幼/ge〃a)，以及杆菌属(Sac////)，例如枯草芽孢杆菌(S.^&//&)和地衣芽孢杆菌(&//c/^m/wm/s)，假单胞菌属(P化w^ww"w)和链霉菌属(&^ptow>;c")。除原核生物之外，如丝状真菌或酵母的真核微生物也适合作为特异性结合剂编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(&cc/2mw^casce"v/w'^)或普通面包酵母是最常用的低级真核宿主微生物。然而，本文中也常可使用许多其它的种、属或菌株，例如毕赤酵母属(P/c/2/fl)(例如，巴斯德毕赤酵母(P/Wto/^)、粟酒裂殖-酵母(5b/2/zcwacc/zarcw^ces/70/wZ)e))、克鲁纟隹其万酵母属(A7wyveramyces0、耳卩氏酉孝母属(K^rcw/a)、念珠5求菌属(Ca"c//<ia)、里氏木霉(7Hc/0(iew7areas/a)、粗糙脉孢菌(脸wms/oracra咖)、许旺酵母属(5b/z而聽'蘭戸s)(例如，西方许旺酵母(&Mva""/ow_yc"和丝状真菌，例如脉孢菌属(A^#Ywpora)、青霉菌属(尸em'c/〃/ww)、弯颈霉属(7b/y/oc/<3<i/mw)禾口曲霉菌属(A^6^/〃m)宿主，例如构巢曲霉".mV/w/""s)和黑曲霉"."/取"。适合于表达糖基化的特异性结合剂或抗体的宿主细胞来自于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。现已鉴定出多种杆状病毒株和变体，以及对应的容许昆虫宿主细胞，这些细胞来自于如草地贪夜蛾(5^odopfera/n^ipera")(毛虫)、埃及斑蛟(Jedaswgy;^/)(蛟子)、白纹伊蚊(v4ecfesa/6o;/c^s)(蛟子)、黑腹果蝇(Drarap/w7awe/awogwfer)(果蝇)和家蚕(So附xww7')等宿主。这类细胞转染的许多病毒株是公众可获得的，例如苜蓿丫纹夜蛾"wtogra//zaco/i/^"/ca)NPV的Ll变体和家蚕(Somxwon')NPV的Bm-5菌株。23然而，人们最为感兴趣的是脊椎动物细胞，而且脊椎动物细胞的培养增殖(组织培养)已经成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例有中国仓鼠卵巢细胞，包括CHOKl细胞(ATCCCCL61)、DXB-ll、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞Z-DHFR(CHO,Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚肾细胞系(293或悬浮培养生长的亚克隆293细胞；Graham等人，J.GenVirol.36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCLIO);小鼠睾丸sertoli细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1，ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34);布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺细胞(W138，ATCCCCL75);人肝癌细胞(HepG2，HB8065);鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.YAcad.Sci.383:44-68(1982));MRC5细胞或FS4细胞。使用上述核酸或载体转化或转染用于生产特异性结合剂或抗体的宿主细胞，并在适合于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因的经改进的常规培养基中培养宿主细胞。此外，具有由选择标记分离的多拷贝转录单位的新型载体和转染的细胞系特别有用，并且优选用于表达特异性结合剂或抗体。用于生产本发明的特异性结合剂或抗体的宿主细胞可培养于多种培养基中。如Ham'sF10(Sigma)、MinimalEssentialMedium(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)禾nDulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEM,Sigma)的可商购培养基均适合培养宿主细胞。此外，也可使用描述于Ham等人，Enz.58:44(1979);Barnes等人，Anal.Biochem.102:255(1980);美国专利第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、或第5,122,469号；WO90103430;WO87/00195;或U.S.PatentRe.No.30,985号中的任何一种培养基作为宿主细胞的培养基。可以根据需要向这些培养基中添加激素和/或其它生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(例如，氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺苷和胸苷)、抗生素(例如，药物GentamycinTM)、微量元素(定义为24通常以微摩尔水平的终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能量源。也可以包含本领域技术人员所熟知的合适浓度的其它必要的补充剂。如温度、pH和类似的培养条件是早先用于选择细胞表达的培养条件，并且对于本领域技术人员是显而易见的。将分别包含适当的轻链和重链对(如美国专利申i青第20030082735号中所述)的表达载体pDC323和pDC324转染到CS9宿主细胞系中。培养宿主细胞时，特异性结合剂或抗体可以在细胞内、细胞周质产生，或被直接分泌到培养基中。如果特异性结合剂或抗体产生于细胞内，那么第一步要通过离心或超滤除去颗粒碎片，例如宿主细胞或裂解的片段。例如，可以使用如羟基磷灰石层析、阳离子或阴离子交换层析，或优选使用目标抗原、蛋白质A或蛋白质G作为亲和配基的亲和层析来纯化特异性结合剂或抗体。蛋白质A可被用来纯化基于人Yl、Y2或y4重链的特异性结合剂或抗体(Lindmark等人，J.ImmunolMeth.62:1-13(1983))。蛋白质G适合于所有的鼠亚型和人y3(Guss等人，EMBOJ.5:15671575(1986))。最常用的附着亲和配基的基质是琼脂糖，但也可使用其它基质。机械稳定的基质，例如孔径可控的玻璃或聚苯乙烯/二乙烯基苯可获得比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。当特异性结合剂或抗体包含CH3域时，可使用BakerbondABX树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ.)进行纯化。可以依据待回收的特异性结合剂或抗体选择使用其它的蛋白质纯化技术，例如乙醇沉淀、反相HPLC、聚焦层析、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。嵌合抗体和人源化抗体可以使用本领域己知的标准方法(参见Morrison,S.L.等人，(1984)ChimericHumanAntibodyMolecules;MouseAntigenBindingDomainswithHumanConstantRegionDomains,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,6841-6855;禾口Boulianne，GL.等人，Nature312,643-646.(1984))产生啮齿动物单克隆抗体的Ig可变区与人Ig恒定区相融合的嵌合的单克隆抗体。虽然己经证明一些嵌合的单克隆抗体在人体中的免疫原性较小，但是啮齿动物Ig可变区仍会导致显著的人抗啮齿动物反应。可以通过多种方法获得人源化抗体，例如(1)将非人类互补决定区(CDR)移植进人类骨架区和恒定区(本领域中是指通过"CDR移植"进《亍人源化的过程)，或者(2)移植整个非人类可变区，但是通过替换表面残基将其"伪装"成类似于人类抗体的表面(本领域中是指"镶饰"过程)。这些方法公开于，例如Jones等人，Nature321:522525(1986);Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL,U.S.A.,81:68516855(1984);Morrison和Oi，Adv.Immunol"44:6592(1988);Verhoeyer等人，Science239:15341536(1988);Padlan，Molec.Immun.28:489498(1991);Padlan,Molec.Immunol.31(3):169217(1994)和Kettleborough,CA.等人，ProteinEng.4(7):77383(1991)，以上文献均并入本文作为参考。特别地，将啮齿动物抗体单独或以偶联物的形式连续地向人体体内施用将导致受体中产生针对啮齿动物抗体的免疫反应；即所谓的HAMA反应(人抗鼠抗体反应)。在需要重复给药的情况下，HAMA反应会使药物的效果受到限制。可以使用如聚乙二醇的亲水聚合物对抗体进行化学修饰或使用基因工程方法使抗体具有更类似于人的结合结构，以减少抗体的免疫原性。CDR移植包括将来自鼠重链和轻链Ig可变区中6个CDR中的一个或多个引入到人类Ig可变区的合适的骨架区中。此技术(Riechmann,L.等人，Nature332,323(1988))利用保守的骨架区(FR1-FR4)作为支架以支持作为抗原主要接触区的CDR环。然而，CDR移植的一个显著缺点是可造成人源化抗体的结合亲和力显著小于原始的鼠抗体，这是因为骨架区的氨基酸有助于抗原结合，还因为CDR环的氨基酸会影响两个Ig可变区的结合。在基于细胞的试验中，嵌合的SR-1抗体没能表现出合适的功效。可以通过选择最接近于原始鼠抗体骨架区的人类骨架区，并通过计算机构建抗原结合位点的模型以辅助进行骨架区内或CDR内的单氨基酸定点突变，来改进CDR移植技术以维持人源化单克隆抗体的亲和力(例如，Co,M.S.等人，(1994)，J:Immunol.152,2968-2976)人源化抗体的一个方法包含的步骤有比对非人类重链和轻链序列与人类重链和轻链，基于上述比对选择非人类骨架区并将其替换成人类骨架区，进行分子建模以预测人源化序列的构象，并将预测的构象与亲本抗体的构象进行比较。在此过程后，反复对CDR区中干扰CDR结构的残基进行回复突变，直到人源化序列模型的预测构象非常接近于亲本非人类抗体中非人类CDR的构象。例如，可以通过Ashwdl受体等，进一步对此类人源化抗体进行衍生化以促进其吸收和清除(参见，例如美国专利第5,530,101号和第5,585,089号)。现己报道了很多合理设计的鼠单克隆抗体的人源化产物(参见，例如公开于2002年7月11日的20020091240、WO92/11018和美国专利第5,693,762号、美国专利第5,766,866号)。抗体的人类工程化还描述在，例如，Studnicka等人，美国专利第5,766,886号；Studnicka等人，ProteinEngineering7:805-814(1994)中。抗体变体的生产可通过向编码DNA中引入合适的核苷酸变化或肽合成制备所需特异性结合剂或抗体的氨基酸序列变体。此类变异体包括，删除和/或插入和/或取代特异性结合剂或抗体氨基酸序列中的残基。只要其最终构建物具有所需的特征，可以通过删除、插入和取代的任意组合获得最终构建物。氨基酸的变化还会改变特异性结合剂或人源化抗体或抗体变体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。可通过本领域己知的多种方法制备编码特异性结合剂或抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。此类方法包括寡核苷酸介导的(或定点)突变、PCR突变以及对预先制备的变体和非变体形式的特异性结合剂或抗体的盒式突变。如CunninghamandWellsScience,244:1081-1085(1989)所述，用于鉴定特异性结合剂或抗体中的特定残基或区域为优选突变位点的有用方法被称为"丙氨酸扫描突变"。在此过程中，鉴定目标残基中的一个或一组残基(例如，如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸的带电残基)并将其替换成中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)以影响氨基酸和抗原的相互作用。随后，对于功能易受其取代影响的那些氨基酸位点，可通过在取代位点进一步引入该突变或取代成其它变体来优选这些氨基酸位点。因此，由于预先确定了引入氨基酸序列突变的位点，而不再需要预定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点突变的表现，可在目标密码子或目标区域进行丙氨酸扫描或随机突变，并筛选具有所需活性的表达变体。通常，特异性结合剂或抗体的氨基酸序列变体的氨基酸序列与原始的特27异性结合剂或抗体(鼠抗体或人源化抗体)重链或轻链的氨基酸序列具有至少60%的氨基酸序列同一性，或至少65%、至少70%、至少75%、至少80%的同一性，更优选至少85%的同一性，更优选至少90%的同一性，和最优选至少95%的同一性，包括如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、和100%的同一性。本文中将此序列的同一性或同源性定义为在比对序列并引入达到最大序列同一性所必须的间隔后，候选序列中氨基酸残基与原始序列的相同的百分比，并且保守性取代(如下表I中的定义)不被认为是序列同一性的一部分。在特异性结合剂或抗体序列的N末端、C末端或中间部分的延长、删除或插入都不认为影响序列的同一性或同源性。因此，可通过常用的比较两条多肽中氨基酸位置相似性的标准方法来确定序列同一性。使用如BLAST或FASTA的计算机程序比对两条多肽，以获得其各自氨基酸的最佳匹配(根据一条或两条序列的全长或根据一条或两条序列的预定部分)。所述程序提供了与计算机程序配套使用的默认开放罚分(openingpenalty)、默认空位罚分(gappenalty)和记分矩阵，例如PAM250(标准记分矩阵；参见Dayhoff等人，AtlasofProteinSequenceandStructure,vol.5,supp.3(1978))。例如，可按以下方式计算同一性百分率将相同匹配的总数乘以IOO，然后除以匹配范围内较长序列的总长以及为了比对两条序列而引入较长序列中的空位的数目。插入氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端的长度为一个残基至包含一百个或一百个以上残基的多肽的融合，以及向序列内插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括使特异性结合剂或抗体与N末端蛋胺酰残基融合或使特异性结合剂或抗体(包括抗体片段)与表位标签或补救受体表位(salvagereceptorepitope)相融合。特异性结合剂或抗体分子的其它插入变体包括，例如在N末端或C末端与延长特异性结合剂或抗体的血清半衰期的多肽的融合。表位标签的实例包括流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等人，Mol.Cell.Biol.8:2159-2165(1988));c-myc标签以及其抗体8F9、3C7、6E10、G4、B7禾口犯10(Evan等人，MolCell.Biol.5(12):3610-3616(1985));和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等人，ProteinEngineering3(6):547-553(1990))。其它的示范性标签有聚组氨酸序列，其通常具有约6个组氨酸残基，并可以使用镍螯合物标记的化合物进行分离。其它的标记物和标签，例如FLAG⑧标签(EastmanKodak,Rochester,NY)也为本领域熟知和常用，。术语"补救受体结合表位"是指负责延长IgG分子(例如，IgG,、IgG2、IgG3或IgG4)的体内血清半衰期的IgG分子Fc区表位。取代变体的另一种类型是氨基酸取代变体。在这些变体中，至少从特异性结合剂或抗体分子上移除一个氨基酸残基并在移除位点插入不同的残基。所考虑的是高变区、CDR区或骨架区中任何一个区的取代突变。表1中列出了保守性的取代。在"优选取代"标题下为最保守的取代。如果此类取代的结果不改变生物活性，则可以引入表l中"典型取代"所示的其它实质性变化或下文参考氨基酸类型进一步描述的其它实质性变化，并对其产物进行筛选。表1原始典型取代优选取代残基Ala(A)Val;Leu;lieValArg(R)Lys;Gin;AsnLysAsn(N)Gin;His;Asp;Lys;GinArgAsp(D)Glu;AsnGluCys(C)Ser;AlaSerGin(Q)Asn;GluAsnGlu(E)Asp;GinAspGly(G)AlaHis(H)Asn;Gin;Lys;Arglie(I)Leu;Val;Met;Ala;PheLeu;正亮氨酸Leu(L)正亮氨酸；lie;Val;Met;Ala;Phelie29<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>可以通过选择取代完成特异性结合剂或抗体生物学性质的实质性修饰，所选取代保持(a)取代区域多肽骨架的结构，例如片层或螺旋构象，(b)该分子目标位点的带电性或疏水性，或(c)侧链体积的效果存在显著区别。天然存在的残基可根据常见侧链性质分为以下类别(1)疏水性正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性亲水性Cys、Ser、Thr;(3)酸性:Asp、Glu;(4)碱性Asn、Gln、His、Lys、Arg;(5)影响链方向的残基:Gly、Pro;和(6)芳香性Trp、Tyr、Phe。保守性取代包括将氨基酸替换成与之同类的另一个氨基酸。非保守性取代包括将一个类别的氨基酸替换成另一个类别的氨基酸。通常使用丝氨酸取代特异性结合剂、人源化抗体或抗体变体中不参与维持正常构象的任何半胱氨酸残基，从而改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。反之，也可以向特异性结合剂或抗体中加入半胱氨酸键以改进其稳定性(特别是在所述抗体为抗体片段，例如Fv片段的情况下)。亲和力成熟亲和力成熟包括制备和筛选在亲本特异性结合剂或抗体的CDR内发生突变(删除、插入或取代)的特异性结合剂或抗体变体，并选择与亲本特异性结合剂或抗体相比，具有改进的生物学性质(例如，结合亲和力)的变体。产生此类取代变体的常规方式是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，突变多个高变区位点(例如，6-7个位点)以在各位点产生所有可能的氨基酸取代。将以此产生的特异性结合剂或抗体变体与在各病毒颗粒内包装的M13的基因III的产物相融合，并以单价形式由丝状噬菌体颗粒展示。随后，对噬菌体展示变体的生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。可进行丙氨酸扫描突变以鉴定显著促进抗原结合的高变区残基。额外地或在此基础上，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定特异性结合剂或抗体与抗原的接触位点也是有益的。根据本文中阐述的技术，此类接触性残基或相邻残基是取代的候选残基。一旦产生变体，即可按本文所述对变体组进行筛选，并且可选择在一个或多个相关试验中显示出较好性质的特异性结合剂或抗体进行进一歩研究。可使用应用基因重排和定向进化的技术制备并筛选特异性结合剂或抗体以获得所需的活性。例如，Jermutus等人在ProcNatlAcadSciUSA.2001Jan2;98(l):75-80中公开，将基于核糖体展示的改良型体外选择策略与经DNA重排的体外多样化结合以改进单链Fv抗体片段(scFv)的解离速率和热动力学稳定性；Fermer等人在TumourBiol.2004Jan-Apr;25(l-2):7-13中报道噬菌体展示和DNA重排组合使用将亲和力提高了几乎三个数量级。糖基化的改变也可以制备与亲本特异性结合剂或抗体相比，具有改良的糖基化模式的特异性结合剂或抗体变体，例如，删除特异性结合剂或抗体中发现的一个或多个糖部分，和/或添加特异性结合剂或抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。包括抗体的多肽的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接是指糖部分与天门冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天门冬酰胺-X-丝氨酸和天门冬酰胺-X-苏氨酸(X为脯氨酸之外的氨基酸)是天门冬酰胺侧链与糖部分之间酶连接的识别序列。多肽中存在这些三肽之一即产生了潜在的糖基化位点。因此，可通过改变含有一个或多个这些三肽序列的氨基酸序列在特异性结合剂或抗体中添加N-连接的糖基化位点。O-连接的糖基化是指将N-乙酰半乳糖胺、31半乳糖或木糖之一的糖与羟氨基酸的连接，最常见的羟氨基酸是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。通过在原始特异性结合剂或抗体序列中插入或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基，可将O-连接的糖基化位点添加到特异性结合剂或抗体中。其它修饰可在Fc区内移除或引入半胱氨酸残基，从而减少或增加此区域中链间二硫键的形成。以此产生的特异性结合剂或抗体的同源二聚体具有改进的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤作用和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。也可以使用如Wolff等人，CancerResearch53:2560-2565(1993)所述的异源双功能交联剂制备特异性结合剂或抗体的同源二聚体。或者对特异性结合剂或抗体进行工程化，使其具有两个Fc区，并因此具有增强的补体裂解活性和ADCC能力。参见Stevenson等人，Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。现已显示CDR中的序列可导致抗体与MHCII类分子结合并引发有害的辅助T细胞反应。保守性取代可使特异性结合剂或抗体保留结合能力，同时降低其引发有害的辅助T细胞反应的能力。也可考虑移除重链或轻链N末端20个氨基酸中的一个或多个。延长血清半衰期的修饰也是可取的，例如，通过引入或添加补救受体结合表位(例如，通过适当区域的突变，或通过DNA合成或肽合成将表位引入到随后被融合到特异性结合剂或抗体的任一末端或中间部分的肽标签上)(参见，例如W096/32478)或添加如PEG或其它水溶性聚合物的分子，包括多糖聚合物。在由补救受体结合表位组成的区域中，优选将来自Fc域中一个或两个环的一个或多个氨基酸残基转移到特异性结合剂或抗体或片段的类似位置。更优选地，转移来自Fc域中一个或两个环的三个或更多残基。甚至更优选地，将来自Fc区(例如，IgG的Fc区)中CH2域的表位转移到特异性结合剂或抗体的Ch1、Ch3或Vh区，或多个上述区域。或者，将来自Fc区中Ch2域的表位转移到特异性结合剂或抗体片段的Q^区或/和Vl区。也可参见描述了Fc变体及其与补救受体相互作用的国际申请WO97/34631和WO96/32478。体内IgG动态平衡的调节依赖于IgG与FcRn的结合。已有报道，改变IgG的Fc区和FcRn间的相互作用可改进单克隆抗体的血清半衰期。优选对新生Fc受体FcRn可产生较高亲和力的结合，并减缓降解、改进PK特性的Fc突变。IgG中的FcRn結合位点位于Ch2-Ch3域的界面。此区域中残基的突变(M428L禾[JT250Q/M428L、T250Q/M428L、P257I/Q311I、M252Y/S254T/T256E、H433K/N434F/Y436H或M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F/Y436H)可增大pH6.0和pH7.3条件下IgGl对人类FcRn的亲和力。此外，对猴子静脉给药时，此类突变中的一些可改进药物动力学性质(清除更慢、半衰期延长)。现已确定恒定区的其它位点负责补体依赖的细胞毒性，例如Clq结合位点和/或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)(参见，例如Molec.Immunol.29(5):633-9(1992);Shields等人，J.Biol.Chem.,276(9):6591-6604(2001)，其全文并入本文作为参考)。Fc受体结合位点中的残基的突变可造成效应器功能的改变(即，增强或减弱)，例如，改变ADCC或CDC活性或改变半衰期。如上文所述，可能的突变包括一个或多个残基的插入、删除或取代，包括丙氨酸取代、保守性取代、非保守性取代或在来自不同亚类的相同位置处用对应氨基酸残基替换(例如，将lgGl残基替换成此位置上对应的IgG2残基)。其它共价修饰特异性结合剂或抗体的共价修饰也包含在本发明的范围之内。在适合的条件下，可以通过化学合成，或通过酶切或化学裂解特异性结合剂或抗体进行共价修饰。通过目标氨基酸残基与有机衍生化试剂的反应可将其它类型的共价修饰引入特异性结合剂或抗体，其中所述有机衍生化试剂能够与所选的恻链或N末端或C末端残基发生反应。半胱氨酰残基最常与a-卤代乙酸酯(以及对应的胺)(例如氯乙酸或氯乙酰胺)发生反应，从而生成羧甲基或羧胺甲基衍生物。也可以通过与溴三氟丙酮、a-溴-卩-(5-咪唑)丙酸、氯乙酰磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基-2-吡啶二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基酚、或氯-7-硝基苯-2-氧杂-l,3-二唑的反应对半胱氨酰进行衍生化。可通过在pH5.5-7.0的条件下与焦碳酸二乙酯的反应对组氨酰残基进行衍生化，因为此试剂对组氨酰侧链具有相对特异性。也可使用对溴苯酰甲基溴；优选在pH6.0的条件下在0.1M二甲基砷酸钠中进行反应。可将赖氨酰或氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。使用这些试剂进行衍生化具有逆转赖氨酰残基带电性的作用。其它适合于含(X-氨基的残基衍生化的试剂包括亚氨酸酯，例如methylpicolinimidate、吡咳醛磷酸盐、吡哆醛、氯硼氢化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2,4-戊二酮和使用乙醛酸的转氨酶催化的反应。可通过与一种或多种常规试剂的反应修饰精氨酰残基，所述试剂包括苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。因为胍官能团的高pKa，精氨酸残基的衍生化反应需要在碱性条件下进行。此外，这些试剂还与赖氨酸基团以及精氨酸s-氨基基团反应。可以通过与芳香族重氮盐或四硝基甲垸的反应特异性地修饰酪氨酰残基，特别是向酪氨酰残基引入光谱标记。最常使用N-乙酰咪唑和四硝基甲垸以分别形成O-乙酰酪氨酰类和3-硝基衍生物。可使用1251或'311碘化酪氨酰残基以制备用于放射性免疫测定的标记蛋白质。可通过与碳二亚胺(R-N=C=N-R')的反应选择性地修饰羧基侧链(天冬氨酰或谷氨酰)，其中R和R'为不同的烷基基团，例如，l-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或"乙基-3-(4-氮鐵-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，可通过与铵离子的反应将天冬氨酰或谷氨酰残基转化成天冬氨酰胺和谷氨酰胺残基。经常脱去谷氨酰胺和天冬氨酰胺残基中的酰胺基以分别获得对应的谷氨酰和天冬氨酰残基。在中性或碱性条件下进行这些残基的脱酰胺反应。这些残基的脱酰胺形式也属于本发明的范围。其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基中羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链中a-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983))、N末端胺的乙酰化以及C末端羧基基团的酰胺化。另--类型的共价修饰包括经化学或酶促方式将糖苷偶联到特异性结合剂34或抗体上。这些方法的优点在于不需要在具有N-连接或O-连接糖基化能力的宿主细胞中生产特异性结合剂或抗体。依据使用的偶联模式，可将糖连接到(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基基团，(C)游离巯基基团，例如半胱氨酸的巯基基团，(d)游离羟基基团，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基基团，(e)芳基基团，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳基基团，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。1987年9月11日公开的WO87/05330以及AplinandWriston,CRCCrit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981)中描述了这些方法。可通过化学或酶促方式除去特异性结合剂或抗体上存在的任何糖部分。化学脱糖基化需要将特异性结合剂或抗体暴露于三氟甲磺酸化合物或等效化合物。这种处理的结果是切除连接糖(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖，同时保持特异性结合剂或抗体的完整性。化学脱糖基化描述于Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Bi叩hys.259:52(1987)以及Edge等人，Anal.Biochem.，118:131(1981)中。可使用Thotakura等人，Meth.Enzymol.138:350(1987)描述的多种内切和外切糖苷酶完成特异性结合剂或抗体上糖部分的酶促切除。特异性结合剂或抗体的另一类共价修饰包括将特异性结合剂或抗体连接到多种非蛋白质聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油、聚氧化烯或多糖聚合物，例如葡聚糖中的一种上。此类方法是本领域已知的，参见，例如美国专利第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号、第4,179,337号、第4,766,106号、第4,179,337号、第4,495,285号、第4,609,546号或EP315456。治疗应用"治疗"是指以阻止病症发展或改变病症病理学为目的而进行的干涉活动。因此，"治疗"包括治疗性处理以及预防性或防止性的措施。需要治疗的对象包括已患有病症的患者以及需要预防所述疾病的那些对象。用于本发明目的的"哺乳动物"包括哺乳动物分类中的任何动物，包括人类、养殖和驯养的动物、动物园的动物、以及用于体育运动的动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。优选的哺乳动物是人类。35本文所用短语"治疗有效量"是指减少肥大细胞或祖细胞数目和/或活性，减少纤维性元件或其前体，或降低C-Kit相关疾病有关症状的严重性或进展(即，提供"治疗效力")的治疗性或预防性的人源化C-Kit抗体的量。肥大细胞和多能造血始祖干细胞是表达C-Kit的主要细胞类型，因此可以预期本发明的组合物和方法可治疗衍生自HSC的细胞，例如，肥大细胞和参与疾病的细胞。短语"减少纤维化的活性"是指参与抑制、完全或部分地逆转免疫系统活化和纤维化造成的炎症的能力。本文所用术语"纤维化疾病或病症"是指与一种或多种组织中的纤维化相关的疾病。本文所用术语"纤维化"是指作为反应性过程在器官或组织中过量纤维性结缔组织的异常形成或发育，这与作为正常组成的纤维组织的形成或器官或组织的愈合相反。纤维化的特征是任何特定组织中成纤维细胞的累积和超出正常沉积量的胶原蛋白质沉积。本文所用术语"纤维化"的意思与"异常愈合，包括间叶成纤维细胞转化、过量成纤维细胞增殖、胶原蛋白质及其它细胞外基质蛋白质的活性和沉积"相同。成纤维细胞是结缔组织细胞，分散于全身的结缔组织中。成纤维细胞分泌包含1型和/或III型胶原蛋白质的非刚性细胞外基质。响应组织伤害时，邻近的成纤维细胞或循环的间叶前体细胞可迁移至创面，并受其它细胞(例如，肥大细胞)及其介质的影响而被选择性地活化、增殖并产生大量胶原蛋白质细胞外基质。胶原蛋白质是富含甘氨酸和脯氨酸的纤维蛋白质，是细胞外基质以及结缔组织、软骨和骨的主要组分。胶原蛋白质分子是被称为a-链的三链螺旋结构，a-链相互缠绕形成绳状螺旋。胶原蛋白质以多种形式或类型存在，其中，发现于皮肤、肌腱和骨中的I型胶原蛋白质最为普遍；III型胶原蛋白质被发现于皮肤、血管和内脏中。肥大细胞相关的纤维化疾病包括病理性纤维化或疤痕(包括心内膜硬化)、特发性间质纤维化、肺间质纤维化、肌周纤维化(perimuscularfibrosis)、Symmer氏纤维化、中心纤维化(pericentralfibrosis)、肝炎、皮肤纤维瘤、胆汁性肝硬化、酒精性肝硬化、急性肺纤维化、特发性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、肾纤维化/肾小球肾炎、肾纤维化/糖尿病肾病、系统性硬皮病、局部硬皮病、瘢痕瘤、增生性瘢痕、严重关节粘连/关节炎、骨髓纤维变性、角膜瘢痕、囊肿性纤维化、肌营养不良(杜兴氏(Duche皿e)肌营养不良)、心脏纤维化、肌肉纤维化/视网膜剥落、食道狭窄和皮洛尼氏病(Payronle'sdisease)。手术可诱导或引发其它纤维化病变，包括瘢痕修复/整形手术、青光眼、白内障纤维化、角膜瘢痕、关节粘连、移植物抗宿主病、腱手术、神经卡压症、杜普伊特伦挛縮(Dupuytren'scontracture)、OB/GYN粘附/纤维化、骨盆粘连、硬膜纤维化、再狭窄。预期本发明可用于治疗由纤维连接蛋白沉积而导致的纤维化病症。本发明可治疗的病症的实例还包括特发性肺纤维化、博莱霉素肺、囊肿性纤维化和肾小球肾病，包括以肾脏中Fn沉积为特征并最终导致肾衰竭的疾病。本发明还可以治疗与免疫系统活化相关的炎症、其中肥大细胞分泌如TNF的炎症细胞因子，并可以激活淋巴细胞并直接与其发生相互作用。硬皮病被认为是一种结缔组织的自体免疫疾病，其导致特征在于皮肤增厚和硬化的纤维化病症，其中皮肤增厚和硬化是由皮肤和其它器官中成纤维细胞产生过量的新胶原蛋白质而引起的。硬皮病可以是局部疾病或累及多个器官的系统性疾病。硬皮病也被称为系统性硬化症。硬皮病病理上的发展与受影响的疾病组织/器官中的肥大细胞数目的增加有关。系统性硬化症的特征是形成透明加厚的胶原纤维组织，并伴随有皮肤加厚和下层组织粘连，特别是在手和面部。该病的特征还在于由缺乏蠕动性和食道黏膜下层纤维化造成的吞咽困难、由肺纤维化造成的呼吸困难、心脏纤维化以及肾血管病变(Stedman'sMedicalDictionary,第26版，Williams&Wilkins，1995)。30%至70%的硬皮病患者受到肺纤维化的影响，其通常导致限制性肺疾病(Atamas等人，CytokineandGrowthFactorRev14:537-550(2003))。一些患者重叠地患有硬皮病和其它结缔组织疾病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多肌炎。当硬皮病的特征与多肌炎和系统性红斑狼疮的特征同时出现时，这种病症被称为混合结缔组织病(MCTD)。己知以皮炎的一些形式出现的症状是皮肤肥大细胞的脱粒化，尤其是脱粒化导致的组胺释放造成的。因此，本发明适合治疗的另一种肥大细胞相关病变是色素性荨麻疹。该病变表现出特征性的皮肤损害，即单个或多个着色斑疹或摩擦后出现风块并包含大量肥大细胞的结节。存在不同形式的相关皮炎(皮肤炎症)，例如出现在人和动物皮肤炎中的红斑、水肿、丘疹性发疹、以及瘙痒症，以上形式均可用本发明进行治疗。在很多情况下，肥大细胞增多症是肿瘤疾病并且涉及新生性或异常性肥大细胞的生长，而且可能是升高的SCF自分泌信号或活化的C-Kit突变的结果。肥大细胞增多症可以是限制性疾病或累及多个器官(例如，骨髓)的系统系疾病。响应特定事件时，肥大细胞向体内释放特定的介质或化学物质，其中之一为组胺。系统性肥大细胞增多症患者的肥大细胞的数目增加，或产生形状异常、不具备正常功能的肥大细胞。此外，这些肥大细胞不能按计划死亡，因此进一步增加了肥大细胞的总量。肥大细胞脱粒化并释放其内容物时，可导致很多急性且潜在严重的病症或疾病。肥大细胞病变还包括导致局部疾病的增殖性病变，例如单发性皮肤细胞瘤乃至肥大细胞白血病等更为严重的疾病。实例包括皮肤肥大细胞瘤、侵袭性肥大细胞增多症、惰性肥大细胞增多症、伴有血液系统异常的肥大细胞增多症、色素性荨麻疹、持久性发疹性斑状毛细血管扩张症(TMEP)、系统性肥大细胞病、肥大细胞白血病、髓细胞白血病、系统性肥大细胞增多症(伴有或没有例如色素性荨麻疹的皮肤表现)、肥大细胞活化综合征/病变，以及更为常见的小儿肥大细胞病变，例如单发性肥大细胞瘤和弥漫性皮肤肥大细胞增多症。肥大细胞活化综合征或病变的特征是正常数量或接近正常数量的肥大细胞。然而，这些肥大细胞极易受激发而释放其内容物，造成很多相同的症状。这种病变存在过敏性反应和休克的危险，但是与肥大细胞增殖病变不同，这种综合征不具有发展到更高侵袭性或恶性阶段的潜能。伴有肥大细胞脱粒化的此类病变的实例包括腹痛、荨麻疹和皮疹、过敏性反应、食道炎症、血压变化和休克、肠痉挛和腹胀、骨痛(轻度至严重疼痛/虚弱)、瘙痒、伴有或没有皮疹、胸痛，肝、脾和其它器官损害、认知困难/脑雾(brainfog)、吸收不良、退行性腰椎间盘疾病、偏头痛、腹泻、肌肉痛、头晕/眩晕/晕眩、恶心、虚弱、骨质疏松症/骨质缺乏症、疲劳、外周神经病变和感觉异常、面红、心率增快、胃食道返流和呕吐。现已使用阻断肥大细胞特异性介质(例如组胺和皮质类固醇)并具有引发肥大细胞凋亡活性的药物，在临床上证实了肥大细胞在过敏性疾病中的作用。其它肥大细胞相关疾病包括组胺介导的过敏性反应，这种过敏性反应可通过抑制趋化因子诱导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱粒以及组胺释放进行治疗。可由本发明的方法和组合物有效治疗的肥大细胞相关病变或疾病的实例还包括，但不限于接触性皮炎、特应性皮炎、过敏性皮炎、湿疹性皮炎和由昆虫叮咬引起的皮炎。适合由本发明的方法和组合物治疗的其它肥大细胞相关适应症包括间质性肺疾病(interstitiallungdisease)中的肺部炎症状态，例如结节病、新生儿呼吸窘迫综合症(RDS)、肺支气管发育不良(BPD)和以血清PLA2活性升高为特征的病症，例如成人RDS(ARDS)。现已公开肥大细胞在关节炎中的作用。肥大细胞在RA和OA患者的发炎的滑膜组织中增多，而已发现Gleevec可引发滑膜外植体中肥大细胞凋亡，对人类患者的研究显示出其在RA患者体内的效力。肥大细胞在感染性休克、胰腺炎、胶原血管病、急性肾衰竭、腹膜炎和自身免疫性葡萄膜炎中起作用。研究还表明肥大细胞参与多发性硬化的病理生理过程。人们认为脑部肥大细胞释放可导致脱髓鞘的血管活性胺。肥大细胞释放的组胺可改变血管完整性并导致也与多发性硬化病因相关的血脑屏障的部分破坏。因此，可预期本发明的方法和组合物适合于治疗或改善与多发性硬化病相关的病状。C-Kit还表达于特定的非免疫细胞，例如黑色素细胞和肠细胞以及精母细胞。本发明可用于治疗黑色素瘤和GIST，并可作为男性避孕药使用。药用制剂的服用和制备可将本发明方法实施中使用的抗c-Kit特异性结合剂或抗体制备成包含适合所需给药方法的载体的药用组合物。适合用作载体的物质不与受试者的免疫系统反应，并且在与抗c-Kit特异性结合剂和中性拮抗剂或抗体组合时可保持其对c-Kit的高亲和力结合和效力。实例包括但不限于多种标准药物载体的任一种，例如无菌磷酸盐缓冲溶液、抑菌水和类似物。可使用多种水性载体，例如水、缓冲液、0.4%盐水、0.3%甘氨酸和类似物，并可包括其它用于增加稳定性的蛋白质，例如能经受温和化学修饰或类似处理的白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。制剂中的示范性抗体浓度可以是约0.1mg/mL至约180mg/mL或约O.lmg/mL至约50mg/mL，或约0.5mg/mL至约25mg/mL，或者约2mg/mL至约10mg/mL。可在pH缓冲液中制备抗体的水性制剂，例如在pH范围为395.5，或约5.0的条件下。具有此范围内pH值的合适缓冲液的实例包括醋酸盐(例如，醋酸钠)、琥珀酸盐(例如，琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲液。缓冲液浓度可以是约lmM至约200mM，或约10mM至约60mM，这取决于缓冲液以及制剂需要的等渗性。本制剂中可包括也能稳定抗体的张度剂。张度剂的实例包括多元醇，例如甘露醇、庶糖或海藻糖。优选等渗的水性制剂，但是高渗或低渗溶液也是合适的。制剂中多元醇的示范性浓度范围为约1%至约15%(w/v)。还可以向抗体制剂中添加表面活性剂以减少制剂抗体的凝聚和/或使制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。表面活性剂的实例包括非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。表面活性剂的示范性浓度范围为约0.001%至约0.5%，或约0.005%至约0.2%，或者约0.004%至约0.01%(w/v)。在一个实施方案中，所述制剂包含以上确定的试剂(即，抗体、缓冲液、多元醇和表面活性剂)，并且基本不含有一种或多种防腐剂，例如苯甲醇、苯酚、间甲苯酚、氯丁醇和苄索氯铵。在另一个实施方案中，所述制剂可包含防腐剂，例如浓度为约0.1%至约2%，或约0.5%至约1%的防腐剂。只要不对所需的制剂特征产生消极影响，本制剂可包含一种或多种其它药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.Ed.(1980)中所描述的那些。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在其使用的剂量和浓度下对受体无毒，且包括其它的缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂(包括抗坏血酸和蛋氨酸)、螯合剂(例如EDTA)、金属配合物(例如，Zn-蛋白质配合物)、可生物降解的聚合物(例如，聚酯)和/或成盐平衡离子(例如，钠)。通过将所需纯度的抗体与可选择的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.Ed.(1980))相混合，制备冻干剂或水溶液形式的用于存储的治疗性抗体制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在其使用的剂量和浓度下对受体无毒，且包括缓冲液(例如，磷酸盐、拧檬酸盐和其它有机酸)、抗氧化剂(包括抗坏血酸和蛋氨酸)、防腐剂(例如，十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄40索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、烷基苯甲酸酯类，例如甲基或丙基苯甲酸酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲苯酚)、低分子量多肽(少于约IO个残基)，蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)、单糖、二糖和其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖、麦芽糖或糊精)、螯合剂(例如EDTA)、糖类(例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇)、成盐平衡离子(例如钠)、金属配合物(例如，Zn-蛋白质配合物)和/或非离子表面活性剂(例如，TWEEN、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG))。在一个实施方案中，本发明要求保护的合适制剂包含等渗缓冲液(例如，磷酸盐、醋酸盐或TRIS缓冲液)与用于维持张性和稳定的张度剂(例如，多元醇、山梨醇、蔗糖或氯化钠)的组合。此类张度剂的一个实例是5%山梨醇或蔗糖。此外，所述制剂可任选地包含0.01%至0.02%(w/v)的表面活性剂以防止凝聚和保持稳定。帝!j剂的pH范围可为约4.5-6.5至4.5-5.5。关于抗体药用制剂的其它示范性描述可在US2003/0113316和美国专利第6,171,586号中找到，其全文分别并入本文作为参考。本文的制剂还包含治疗特定病症所必须的多于一种的活性化合物，优选那些具有互补活性、彼此不消极影响的活性化合物。例如，进一步提供免疫抑制剂也是合乎需要的。此类分子适合于以预期目的有效量组合存在。所述活性组分也可以包裹在微胶囊中，例如，分别用于胶体给药系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊，所述微胶囊通过凝聚技术或界面聚合制备。此类技术公开于Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.Ed.(1980)。也可考虑使用悬浮液或晶体形态的抗体。制备悬浮液和晶体形态的方法为本领域技术人员所熟知。用于体内服用的制剂必须是无菌的。可通过常规的公知灭菌技术对本发明的组合物进行灭菌。例如，通过无菌滤膜过滤可简单完成灭菌。可将所得溶液包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，在服用前将冻干制剂与无菌溶液混合。41通常使用冻干过程来稳定长期存放的多肽，特别是在液体组合物中相对不稳定的多肽。冻干循环通常由3个歩骤组成冷冻、一次干燥和二次干燥(Williams禾口Polli，JournalofParenteralScienceandTechnology,38巻，Number2，48-59页(1984))。在冷冻步骤中，将溶液冷却直至完全冻结。溶液形式的主体水在此阶段中形成冰。使用真空干燥机将气室压力降低至冰的蒸汽气压之下，从而在一次干燥阶段使冰升华。最后，在低气室压力和高储存温度下的二次干燥阶段除去吸附水或结合水。此方法产生被称为冻干块的产物。此后，在使用前将冻干块复溶。标准的冻干材料复溶过程是加回一定体积的纯水(通常等于冻干期间除去的体积)，但有时在制备胃肠外服用的药品时也使用抗菌剂的稀释溶液(Chen，DrugDevelopmentandIndustrialPharmacy,18巻，11禾口12期，1311-1354页(1992))。已经注意到在一些情况下赋形剂对冻干产品起稳定剂的作用(Carpenter等人，DevelopmentsinBiologicalStandardization,74巻，225-239页(1991))。例如，已知的赋形剂包括多元醇(包括甘露醇、山梨醇和甘油)、糖类(包括葡萄糖和蔗糖)和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。此外，常使用多元醇和糖类保护多肽，使其免受冷冻和干燥导致的损害，并增强干燥状态下的存储稳定性。通常，糖类，特别是二糖，在冷冻干燥过程和存储期间均有效。现已报道，其它类型的分子，包括单糖、二糖以及如PVP的聚合物可作为冻干产品的稳定剂。用于注射的药物制剂和/或药物可以是适合于用上述的合适溶液复溶的粉末。其实例包括但不限于冷冻干燥粉、旋转干燥粉或喷雾干燥粉、无定形粉、颗粒、沉淀物或微粒。用于注射的制剂可选地包含稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂和其组合。可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括包含抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，其中所述基质的形式为成型物，例如，膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和yethyl-L-glutamate的共聚物、不可降解的乙烯醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LupronDepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的注射用微球)，以及聚42(D-(+3-羟基丁酸)。如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子超过100天，而特定的水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内保留长时间时，37。C下与水分的接触会导致抗体变性或聚集，从而会造成生物活性损失和可能的免疫原性变化。可按照涉及的机理设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集的机理是通过巯基-二硫键互换形成的分子内s-s键，则可通过修饰巯基残基，由酸性溶液冻干，控制水分含量，使用合适的添加剂并开发特异的聚合物基质组合物以实现稳定化。可将本发明的制剂设计成本文所述的速效、速释、长效或缓释制剂。因此，也可将药物制剂制备成控释或缓释制剂。可根据病情、年龄、体重、一般健康状况、受试者的性别和饮食、剂量间隔、给药途径、排泄率以及药物组合来调整特定的剂量。包含有效量的上述所有剂型均在常规实验的范围之内，因此也在本发明的范围之内。可通过任意适合的方式施用所述特异性结合剂或抗体，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内给药，以及需要局部治疗情况下的病变部位内给药。胃肠外灌注包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮内或皮下给药。此外，所述特异性结合剂或抗体适合于脉冲灌注，特别是使用递减剂量的特异性结合剂或抗体。优选通过注射给药，最优选静脉内或皮下注射，这部分取决于给药是短期的还是长期的。其它可考虑的给药方法包括局部给药，特别是经皮、经粘膜、直肠、口腔或局部给药，例如通过放置在期望位点附近的导管给药。最优选在生理溶液中经静脉注射本发明的特异性结合剂或抗体，其剂量为0.01mg/kg至100mg/kg，频率为每天、每周至每月一次(例如，每天、每两天、每三天，或每周2、3、4、5或6次)，优选的剂量为0.1至45mg/kg、0.1至15mg/kg或0.1至10mg/kg，频率为每周2或3次或每个月45mg/kg。与其它试剂一同施用本发明的抗体也可以与其它抗炎治疗剂同时施用。同时施用包括在不同的时间以不同的给药途径施用两种不同的治疗剂，只要所述试剂在一个重叠的时间能够发挥其治疗功效就可以。本领域中已知的示范性抗c-Kit试剂包括甲磺酸伊马替尼(ImatinibMesylate)(GleevecTM)。应注意甲磺酸伊马替尼还拮抗来自Abl酪氨酸激酶的信号传导，因此并不是特异的c-Kit抑制剂。43实施例SR-1的人源化通过直接的CDR移植使SR-1人源化，意外的是不需要进行回复突变以保持亲和力，尽管其保持有所需的功能活性。选择保持最规范残基并且没有引入其它脯氨酸残基的人类骨架区作为受体序列。基于这些规则，在重链受体序列中，选择VH11-46作为骨架区1和11，选择VH1l-e作为骨架区ni，并选择JH4作为最近的J区域(也称为骨架区IV)。轻链受体序列为VK4B3种系序列，并选择JK2作为最近的J区域。进行同种型转换以产生人IgG2、IgGl、IgG4P和脱糖基化IgGl形式的人源化抗体。通过将297位(Kabat计数)的天冬酰胺单碱基突变成谷氨酸，从人类IgGl恒定区序列中除去了N-连接的糖基化共有序列。脱糖基化IgGl(hSR-lalgGl)形式的人源化SR-1按期望的方式结合膜c-Kit，其对膜c-Kit的亲和力高于对可溶性c-Kit的亲和力，并且基于使用近端末梢读取c-Kit信号的实验，它是一种高效中性SCF拮抗剂，并且不会在任何细胞中直接介导c-Kit的激动效应。选择脱糖基化IgGl亚型以避免通过旁效应引发的效应器功能和细胞杀伤作用。此抗体在猴子中显示出意想不到的合乎需要的半衰期、非线性PK和可饱和的靶标介导的抗体清除作用。它还可按预期在体内消除肥大细胞。与c-Kit二聚体的结合干细胞因子(SCF)结合时的c-Kit活化最可能通过网格蛋白(clathrin)依赖性途径导致二聚化/寡聚化、自身磷酸化和受体内化。根据Biacore测定，SR-1单克隆抗体与c-Kit二聚体结合的亲和力比对可溶性细胞外区域c-Kit单体高出100倍。动力学建模表明即使存在有ng/mL的可溶性脱落受体(shedreceptor),SR-1仍可优先结合天然膜偶联受体。糖蛋白上存在的糖会影响其生物学和功能性质。脱糖基化IgGl形式的人源化SR-1显示出保留的结合参数。在Biacore测试中，人源化SR-1algGl与重组c-Kit受体-Fc结合的KinExA平衡结合Kd为1.0pM，hSR國lalgGl阻断干细胞因子(SCF)结合的Ki等于70pM。hSR-1algGl结合受体二聚体的亲和力高于单体。这是不能以人源化翻译的确定性预测的一个重要特征，并且可溶性C-Kit单体在体内不大可能起抗体接收器的作用。抑制C-Kit依赖细胞的存活和受体信号转导人类成巨核细胞系UT-7的存活依赖于SCF，而除去或抑制SCF可导致其生存能力迅速下降和增殖减少。此试验适合于测定SCF拮抗剂的IC50效力。hSR画lalgGl表现出35pM的平均IC50。hSR-1algGl有效抑制M07e细胞中SCF介导的c-Kit磷酸化和内化，说明所述抗体能够阻断SCF介导的c-Kit信号转导事件。与发现SR-1能够内在地介导c-Kit内化和磷酸化相反，在对hSR-1algGl进行的M07ec-Kit受体近端磷酸化读取中没有检测到激活作用的证据。特别地，IgG2抗体hSR-1IgG2的效力稍低，并且不完全抑制SCF介导的c-Kit受体内化。使用初代分离的人CD34+、CD117+(c-Kit)骨髓细胞发现，l.Oug/mL的hSR-1algGl可中和SCF对源自集落形成的GM-CSF的协同作用。与我们关于hSR-1algGl不介导c-Kit内化或磷酸化的新发现一致的是，在此试验中没冇观察到浓度高达10ug/mL的hSR-1algGl抗体的内在激动性存活活性。实际上，所述抗体能够将存活抑制到基准线以下。肥大细胞聚集、CDC和FcR活性的缺乏使用源自骨髓CD34+细胞的培养的人类肥大细胞测定所述化合物的表观效力和等级次序。hSR-1algGl抑制SCF依赖的肥大细胞存活，不向肥大细胞传导存活信号，不介导c-Kit受体磷酸化(图3)，也未显示介导同型肥大细胞聚集的能力。与之相反，hSR-lIgG2能够阻断SCF-肥大细胞存活，但其本身显示出部分的传导存活信号的激动剂活性，介导c-Kit受体磷酸化并产生导致肥大细胞聚集的可重复性作用。将hSR-lalgGl抗体以高至30mg/kg的剂量，每周一次，连续4周或高至150mg/kg的剂量，每周一次，连续2周皮下注射到非人类灵长动物时，没有观察到意外异常。hSR-1algGl没有表现出可测量的FcR与U-937细胞的非特异性结合，其中U-937细胞表达Fcy受体I:CD64;Fcy受体II:CD32和Fey受体III:CD16。与之相反，推测检测到hSR-lalgGl和lgG4P亚型与高亲和力FcYRI的结合。因此，预测hSR-lalgGl没有ADCC活性，并且迄今为止的试验数据表明没有补体依赖的细胞毒性细胞死亡。现已报道脱糖基化嵌合鼠/人IgGl抗体保留了某些效应器功能(Hybridoma.1991Apr;lO(2):211-7)，因此，hSR-lalgGl的这些所需活性是意料之外的。数据显示应用标准方法并以此选择典型的IgG2、IgGl或IgG4亚型不能产生具有合适特性的分子，即高亲和力结合剂，c-Kit的功能性中性拮抗剂，且不会激活肥大细胞。药物动力学进行初步PK研究以比较在3mg/kg的单次IV或SC给药后雄性猕猴体内hSR-lIgG2和hSR-lalgGl的PK值。时间曲线说明两者均为非线性PK。浓度越低，浓度降低得越快。根据猕猴在单次IV或SC给药后的C。/Q^和AUCo.tM测定，两种抗体显示出相似的药物动力学参数(exposures)。基于AUC。-t^测定，两种人源化抗体的血清清除率约为^0.3mL/hr/kg。SC给药后，hSR-lalgGl和hSR-lIgG2人源化形式的SR-1的生物利用度分别约为82%和69%。基于SR-1和人源化抗体重复对非洲绿猴的每周一次给药的初步药物动力学参数数据，人源化抗体达到的药物动力学参数高于SR-1。特别地，hSR-lalgGl在PK组里同样是最优，并且早先已发现分子的糖基化程度可改变其药物动力学性质，对于抗体而言，会改变其新陈代谢和其它生物学性质(CancerImmunolImmunother.1992;35(3):165-74)。表1.雄性Cyn6m61gus猕猴在3mg/kg单次IV或SC施用hSR-lIgG2或hSR-lalgGl后的药物动力学参数评估测试物给药途径(ug/mL)Timax(hr)AUCo_tiast(hr*ug/mL)CX或CI7Fa(mI7hr/mL)F%hSR-lalgGlIV103-9710$0.309-hSR-lIgG2IV107-10600$0.283-hSR-lalgGlsc36.4727970$0.37682.1hSR-lIgG2sc36.7607290$0.41268.8C。=IV给药后估计的初始浓度Cn^二SC给药后的最大浓度Tmax=达到CmaJ勺时间AUC。.tlast=从时间0到浓度可测的最后时间点的浓度-时间曲线下面积CL二IV给药后的清除率；CL/F=SC给药后的表观清除率F%=生物利用度％a基于AUC。-t^t计算的清除率-不适用C。、Cmax、AUC0-tlast、CL、CL/F和F。/o公开于3个重要附图中。人类剂量预测猴伤口PD模型中，肥大细胞扩增的最小有效量0.3mg/Kg，每周一次，持续两周。根据基于体表面积的剂量转换，按等效剂量法预计人的最小有效量0.1mg/Kg。然而，由于此时尚不了解临床终点，以及hSR-lalgGl在人体内c-Kit抑制中程度与持续时间的药物动力学关系，因此这种评估是初步的。在获得更多的药物动力学和药效学数据后，可进行更精确的预测。体内效力使用SR-1和hSR-lalgGl消除猴体内肺和结肠基底肥大细胞在人体中，表达类胰蛋白酶且缺乏糜酶的肥大细胞MCt主要定位于如肺和结肠的粘膜组织，而此亚型现已在皮肤中被发现，并且一些硬皮病患者中出现了高水平的此细胞亚型，这说明在此条件下肥大细胞也可能会被活化。表达类胰蛋白酶和糜酶的肥大细胞MCtc也共定位于一些此类组织中，类似47地，也可能与硬皮病和其它纤维化病症相关。因此，在粘膜和结缔组织的疾病(例如，IPF、SSc、哮喘、RA和IBD)中，所述两种亚型均可作为c-Kit抑制剂的主要靶标。由于肥大细胞通常是长寿命的组织固有细胞，因此需要治疗剂具有高效力、有效性并具有良好的分布容积和PK。此外，肥大细胞主要为静止细胞，直到被活化脱粒并重新合成介质时，它们才会在炎症反应中起重要作用。体内研究的目的是证明消除了如存在于肺和结肠的基底膜和结缔组织肥大细胞，并测定持续大部分地抑制c-Kit后对造血作用、祖细胞以及红血球生成、黑素生成以及精子发生(从而可用于男性避孕)的影响。基于人和猴c-Kit在CD34+骨髓细胞CFU测试中的等价功能效力(抑制率为1.0ug/mL)及其猴PK，选择SR-1单克隆抗体。SR-1的施用剂量范围为3mg/Kg至30mg/Kg，每周一次持续4周。在时间进程研究中，结肠基底肥大细胞的消除在2个剂量后(第14天)达到最大值(Ct腿gh〉细胞IC50的800倍)，因此选择第14天作为测定c-Kit拮抗结肠基底肥大细胞的药理活性的时间点。由于实践上的原因，在第28天研究结束进行解剖时对肺基底肥大细胞进行评估。每周一次施用3.0mg/Kg剂量的SR-1时，观察到消除肺基底肥大细胞的Ctr。ughPK水平大于UT-7细胞IC50的200倍。没有评估较低剂量SR-1对肺和结肠基底肥大细胞、黑素生成和精子发生的影响。但是，对0.3、1.0和3.0mg/Kg的较低剂量的hSR-lalgGl进行了研究。第14天，Cfgh水平分别大于细胞IC50的200倍、2000倍和8000倍，这些C加ugh水平分别对应于无效力，接近半消除(69%)和接近完全消除(96%)结肠基底肥大细胞(总结于表1中)。hSR-lalgGl的药物动力学参数与细胞效力和效果的关系与关于SR-1的报道发现一致。SR-1和hSR-lalgGl在猴肥大细胞扩增的伤口药效学模型中的体内效力皮肤损伤后会出现严重炎症反应，在所述严重炎症反应中，嗜中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞先后从旁组织和循环系统中迁移而来，粒化并进行组织的表皮再生以及成纤维细胞相关的下层伤口结缔组织收縮(DiegelmamiRF等人，FrontBiosci.2004，Janl;9:283-9)。皮肤创伤是用于研究纤维化相关机制的模型，这是由于多种细胞类型与纤维化疾病相关。然而，现己报道人48体内的纤维化还与源自成纤维细胞的SCF增加，以及肥大细胞的活化和密度增加有关(TrautmannA等人，J.Pathol.2000，Jan;190(1):100-6)。猴皮肤创伤后，肥大细胞的数目以时间依赖性方式增加，并在受伤后第14天达到稳定期，这与人类示例相似。每周一次服用0.3、1或3mg/Kg剂量的SR-1在第14天导致对伤口激活的肥大细胞扩增的近似最大抑制(图1)。最大抑制的定义为在受伤后第14天，100%阻断肥大细胞超出基底数量增长的能力。在第14天，0.3mpk剂量的C加ugh水平大于UT-7IC50的7倍(表2)。在第3周，血清水平约为UT-7IC50的2倍，并且在此暴露条件下仅观察到部分抑制(图l)。在第3周，1和3mg/Kg剂量组中仍可观测到最大效力，其中血清Ctrough水平维持在大于IC50的200倍。这些研究表明对伤口扩增肥大细胞的最大抑制很可能需要Ctrough持续暴露于大于7倍IC50浓度。基于此模型所示的SR-1的最大效力，对0.3、1.0和3.0mg/Kg剂量的hSR-lalgGl进行了评估。在测试的最低剂量(0.3mg/Kg)下，在2周之内观测到对伤口诱发的肥大细胞扩增的最大抑制。此时，血清QTOUgh水平大于UT-7IC50的200倍(表2)。表2SR-1和hSR-lalgGl在伤口PD模型中的PD/PK作用的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>对人(左)或非人类灵长类(右)切伤后钻取活组织检査，直到实验第21天(图2)。分别通过染色法和IHC显示肥大细胞和/或表达SCF的成纤维细胞。在人体正常伤口愈合期间，SCF的表达增加并回落至基底值，随后肥大细胞数量出现瞬时增加。在猴中观察到相似的肥大细胞对创伤的反应。在纤维化和异常伤口愈合期间，SCF表达和肥大细胞数目均维持在较高的值。造血作用和黑素生成鼠遗传学显示c-kit在胚胎发育期间参与造血作用，但是尚未将人类斑驳病受试者的杂合失活和/或c-Kit突变体功能缺失与血液学异常相关联。因为已经将SCF与G-CSF组合用于动员造血干细胞，因此SCF和c-Kit对于人类造血作用很重要。此外，现已报道在GIST患者中，主要靶向BCR-ABL、PDGFR和c-Kit的多激酶抑制剂Gleevec的主要药理作用有骨髓抑制、重度(3-4级)贫血和血小板减少症(HensleyML等人，Semin.Hematol.2003,Apr;40(2Suppl2):21-5)。鼠遗传学显示c-Kit在胚胎发育期间参与成黑素细胞从神经嵴的迁移，这一作用在人类斑驳病(Piebaldism)中得到支持。现已有报道称Gleevec在少数GIST患者的头发中产生"条带状"褪色，但是这尚不是一致性的发现，而且还没有关于色素沉着的报道。也不能排除其它激酶(例如，PDGF)的作用。使用多激酶抑制剂和c-Kit抗体对小鼠的研究表明对头发色素沉着的抑制是完全可逆的，这说明c-Kit抑制影响黑素细胞的功能，但在出生后的环境中不会一直保留(Moss等人，2003)。连续4周，每周施用一次剂量范围为3至30mg/Kg的SR-1以研究测定抑制造血作用、精子发生和活跃黑素生成所需的暴露量。对取自研究开始后基线期、第4、7、14、21和28天的血样进行包括细胞分类在内的全面血液检查。在QueenElizabethHospitalClinicalHematologylab,Barbados对新分离的血样进行分析。虽然在给药起4周后的药物处理动物中存在不显著的RBC减少，但在所分析的血液学参数中没有检测出相对于对照受试者和基底值的SR-1的显著影响。在最高测试剂量(连续4周，每周一次，30mg/Kg)达到了大于UT-7IC50效力70,000倍的暴露水平。对血液学参数没有显著影响得到了骨髓组织病理学分析的验证，其中在骨髓组织病理学分析中发现药物处理组和对照组没有差别，也没有CD117阳性造血干细胞的消除，这说明NHP种非洲绿猴中存在潜在冗余的造血途径。由于可能用于黑素瘤的治疗，还测试了每周一次，持续四周施用3-30m!3k对黑素生成的影响。除去毛发以激发黑素形成，从而评估活化黑素细胞的功能，其中所述活化黑素细胞可较好地反应疾病的状态。各组正常毛发表层的颜色没有受到可见的影响。然而，在接受30mg/Kg剂量的猴的新生毛发中观察到可见程度的毛发着色抑制。未观察到10mg/Kg组的影响表明没有影响的剂量范围在10-30mg/Kg之间。在10mg/Kg组中，SR-1的暴露大于UT-7IC50的8,000倍。在大于UT-7IC50的7倍时达到最大肥大细胞消除效力。这些数据表明c-Kit抑制影响黑素细胞功能，并且可能需要较高剂量/暴露以阻断表征为过高黑素细胞活性的疾病。精子发生现已在小鼠研究中发现c-Kit对于分化的c-Kit受体阳性精原细胞的维持和增殖非常重要，但是对于精原细胞分化的起始步骤并不重要。均为非活性c-Kit受体等位基因杂合子的男性和女性斑驳病受试者是可生育的，这说明这种程度的c-Kit失活似乎不影响原始生殖细胞的发育、精子发生或卵子发生。SR-1在0.3-30mg/Kg时对精子发生显示出剂量依赖性抑制。每周一次0.3mg/Kg剂量的效力低于在较高剂量下观察到的最大效力，并且需要关于较低剂量范围的研究以确定ED50。所达到的暴露为UT-7IC50的7倍，这是伤口模型中肥大细胞扩增的最大效力所需要的暴露。PK外推法表明抗体很可能在最后一次给药1个月后被清除，但选择9个月作为评估康复的保守性时间点。9个月时，所有给药的动物中均发现正常的精子发生，这说明类hSR-lalgGl分子作为男性避孕药是有用的。心5r人源化抗c-Kit脱糖基化IgGl(hSR-lalgGl)抗体是高效价的特异性抗体，并且在使用近端末梢读取c-Kit信号的所有基于细胞的实验中起中和作用。本质上讲，hSR-lalgGl不介导c-Kit受体内化或磷酸化，这与关于亲本鼠SR-1单克隆抗体的报道不同。基于标准方法尚不能预知在人源化IgGl、IgG2和IgG4亚型中选择脱糖基化IgGl亚型的方法。通过新实验靠经验选择的hSR-lalgGl显示出对膜c-Kit受体的合适的药理学性质，避免激发c-Kit和肥大细胞的活性，缺乏通过旁效应引发的效应器功能和细胞杀伤作用。此抗体显示出优良的皮下注射的生物利用度和半衰期、非线性PK和可饱和目标介导的抗体清除作用，并在猴体内消除肥大细胞。这些数据可预测出适合消除人类肥大细胞的有效量。亲本鼠SR-1单抗在猴伤口PD模型中的最小有效剂量小于0.3mg/Kg(Ctrough>细胞IC50的7倍)，并且在稍高的暴露(Ctough>细胞IC50的800倍)下可有效消除皮肤、结肠和肺基底肥大细胞。相似地，需要使暴露水平大于细胞IC508,000倍，才能观察到其对新生毛发中色素沉着的定性影响。现已报道多激酶抑制剂和c-Kit抗体可抑制啮齿动物新生毛发的色素沉着，而hSR-lalgGl可用于与过高黑素细胞活性相关的疾病。此作用在治疗停止后是可逆的。抑制精子发生的次最大作用发生在暴露水平大于细胞IC50的7倍的水平，此暴露水平在伤口PD模型中显示最大效力。本说明书提到和/或列出于申请数据页的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开均以其全文并入本文作为参考。由上文可知，尽管本文为了解释说明描述了本发明的具体实施方案，但是可进行多种改进而不脱离本发明的内涵和外延。5权利要求1.与c-Kit特异性结合的结合剂，其包含与SEQIDNo2所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的结合剂，其包含与SEQIDNo:2所示可变区氨基酸序列具有至少95%或更高同一性的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的结合剂，其包含与SEQIDNo:2所示可变区氨基酸序列具有至少98%或更高同一性的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的结合剂，其还包含SEQIDNo:4所示的氨基酸序列。5.如权利要求1所述的结合剂，其中所述结合剂的互补决定区中至少有一个保守氨基酸取代，其中所述结合剂对c-Kit的亲和力得到了保留。6.如权利要求5所述的结合剂，其中存在一个保守氨基酸取代。7.与c-Kit特异性结合的结合剂，其包含与SEQIDNo:4所示氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。8.如权利要求7所述的结合剂，其包含与SEQIDNo:4所示可变区氨基酸序列具有至少95%或更高同一性的氨基酸序列。9.如权利要求7所述的结合剂，其包含与SEQIDNo:4所示可变区氨基酸序列具有至少98%或更高同一性的氨基酸序列。10.如权利要求7所述的结合剂，其还包含SEQIDNo:2所示的氨基酸序列。11.如权利要求7所述的结合剂，其中所述结合剂的互补决定区中至少有一个保守氨基酸取代，其中所述结合剂对c-Kit的亲和力得到了保留。12.如权利要求ll所述的结合剂，其中存在一个保守氨基酸取代。13.与c-Kit特异性结合的结合剂，其包含与SEQIDNo:6所示氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。14.如权利要求13所述的结合剂，其包含与SEQIDNo:6所示可变区氨基酸序列具有至少95%或更高同一性的氨基酸序列。15.如权利要求13所述的结合剂，其包含与SEQIDNo:6所示可变区氨基酸序列具有至少98%或更高同一性的氨基酸序列。16.如权利要求13所述的结合剂，其还包含SEQIDNo:2所示的氨基酸序列。17.如权利要求13所述的结合剂，其中所述结合剂的互补决定区中至少有一个保守氨基酸取代，其中所述结合剂对c-Kit的亲和力得到了保留。18.如权利要求17所述的结合剂，其中存在一个保守氨基酸取代。19.如权利要求1-18中任一项所述的结合剂，其通过表面等离子共振分析测定，所述结合剂显示出的对c-Kit的亲和力b小于10—2。20.编码结合c-Kit的特异性结合剂的核酸，其中所述特异性结合剂包含与选自SEQIDNo:2、4或6组成的组中的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。21.核酸，其包含的核酸序列与选自SEQIDNo:1、3或5所示核酸序列具有至少90%的同一性。22.载体，其包含权利要求20或21所述的核酸。23.宿主细胞，其包含权利要求22所述的载体。24.制备c-Kit特异性结合剂的方法，其包含培养如权利要求23所述的宿主细胞，从而表达所述核酸以产生所述特异性结合剂。25.如权利要求24所述的方法，其进一步包含从宿主细胞培养物中回收所述特异性结合剂的步骤。26.缓解或治疗受试者与纤维化、炎症、自身免疫或癌症相关的c-Kit疾病或病变的方法，其包含给受试者施用治疗有效量的c-Kit抗体。27.如权利要求26所述的方法，其中所述病变或疾病为纤维化。28.如权利要求26所述的方法，其中所述拮抗剂抗体选自以下组成的组人类抗体、人源化抗体、单链抗体或抗体片段。29.如权利要求28所述的方法，其中所述肽或多肽结合剂、可溶性受体或可溶性异源二聚体受体还包含Fc结构域。30.如权利要求27所述的方法，其中所述纤维化病变选自以下组成的组:硬皮病、间质性肺疾病、特发性肺纤维化、慢性乙型肝炎或丙型肝炎引起的纤维化、辐射诱导的纤维化和伤口愈合引起的纤维化。31.如权利要求30所述的方法，其进一步包含施用促纤维化细胞因子的第二拮抗剂，其中所述细胞因子选自转化生长因子P(TGF-p)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-13(IL-13)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白细胞介素-ip(IL-ip)、结缔组织生长因子(CTGF)、白细胞介素-6(IL-6)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生生长因子(PDGF)、单核细胞趋化蛋白1(CCL2/MCP-1)和肺部活化调节趋化因子(CCL18/PARC)。32.用于缓解或预防患有纤维化病变的受试者纤维化的药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1所述的成分。全文摘要本发明涉及治疗如纤维化的c-Kit相关病症的组合物和方法，更具体地，涉及包含人源化c-Kit抗体的组合物。文档编号C07K16/28GK101472949SQ200780020054公开日2009年7月1日申请日期2007年4月24日优先权日2006年4月24日发明者戈登·吴,沈文彦申请人:安姆根有限公司