专利名称：一种发形霞水母过氧化物还原酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种发形霞水母过氧化物还原酶及其编码基因与应用。
背景技术：
水母属刺胞动物门，是一类分布广泛、生物总量非常庞大的海洋浮游生物。已有大量研究表明，水母体内富含多种生物活性物质，包括水母毒素蛋白和一些活性强烈、具有良好开发前景的新功能蛋白。水母类浮游于4-6米深的海水表层，长期生活在强烈的光辐射环境下。氧化损伤是紫外辐射造成机体损伤的重要机制之一，已有研究表明，浮游生物为避免或减少紫外辐射造成的损害，经过长期适应性选择，在其机体内产生了种类繁多、结构特异、活性强烈的抗氧化活性物质。发达的抗氧化体系在保护细胞和生物体免受光及感光色素等损伤中起重要作用，能保护强光紫外对生物体的辐射，清除辐射反应中产生的自由基。已有研究发现，发形霞水母触手提取物具有很强的体外抗氧化活性，对活性氧族的清除能力远比常用的抗氧化剂维生素C强。通过硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析等方法也分别从水母Rhopilema esculentum、Stomolophus meleagris中分离出多种具有明显清除自由基功能的蛋白。这些结果均表明，水母体内含有活性强烈的抗氧化活性组分，是抗氧化、抗辐射活性物质的重要来源。尽管如此，目前对水母体内抗氧化系统的组成、重要抗氧化酶类(蛋白)的序列信息、表达情况、抗氧化活性水平等尚未有系统的了解。过氧化物还原酶(Peroxiredoxin, Prx)是近年来发现的一类重要的抗氧化酶,广泛存在于各种生物体内。过氧化物还原酶在清除活性氧中发挥重要作用，也是近年来抗氧化活性方面的研究热点之一。目前已被报导的过氧化物还原酶类主要有六种，根据含有半胱氨酸残基数目，可将其分为1-Cys和2-Cys两个亚类。除过氧化物酶6为1-Cys亚类外，其余五种均属于2-Cys亚类。过氧化物还原酶的主要功能是清除机体新陈代谢产生的活性氧，故主要分布于细胞质、线粒体等容易产生活性氧的结构中。过氧化物还原酶能对机体内各种生物反应进行调节，参与细胞增殖、细胞凋亡、信号传导等过程，从而保护机体应对氧化损伤和保持细胞内环境稳定。过氧化氢在细胞内可以与信号通路中蛋白质的疏基发生反应，使蛋白活化或失活，从而对信号传导过程进行调节，但过高的过氧化氢会对细胞造成损害，甚至引起细胞死亡，过氧化物酶可将大量多余的过氧化氢还原为水，从而保护机体减少或避免此类氧化性损伤。目前，国内外尚未见对水母过氧化物还原酶的有关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发形霞水母过氧化物还原酶及其编码基因，本发明的另一目的在于提供该发形霞水母过氧化物还原酶在制备抗氧化药物、抗辐射药物、皮肤防护剂、食品防腐剂、抗衰老药物等中的应用。本发明通过构建 发形霞水母触手组织cDNA文库，并对该文库重组克隆的序列进行测定和注释分析，获得了发形霞水母过氧化物还原酶的编码基因。该发形霞水母过氧化物还原酶是首次发现的具有明显抗氧化活性的水母类过氧化物还原酶，是水母体内抗氧化系统的重要活性组分，该还原酶在抗氧化、抗辐射药物研究中具有良好的应用前景。本发明的主要技术方案是，通过构建发形霞水母触手组织cDNA文库，对其进行测序和筛选，获得发形霞水母过氧化物还原酶的编码基因，并对其抗氧化活性进行研究。本发明的第一方面，提供了一种发形霞水母过氧化物还原酶，所述的一种发形霞水母过氧化物还原酶，具有如下(i )或( )的蛋白质:( i )具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(ii)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由(i )衍生的蛋白质。所述的一种发形霞水母过氧化物还原酶，具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，该蛋白含有信号肽，为分泌蛋白，定位于细胞外，分子量27.9kDa，等电点为6.3。本发明还提供了一种发形霞水母过氧化物还原酶的编码基因，为如下(i )或( )的DNA分子:( i )具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；(ii )与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列同源性在80%以上的核苷酸序列。所述的一种发形霞水母过氧化物还原酶的编码基因，该核苷酸序列全长884bp，包含一个744bp的开放阅读框，如SEQ ID NO:1所示。本发明的第二方面，提供了一种发形霞水母过氧化物还原酶的制备方法，该方法包括如下步骤:·(I)构建发形霞水母触手组织cDNA文库；(2)对上述发形霞水母触手组织cDNA文库重组克隆的序列进行测定和分析，获得一个编码过氧化物还原酶的核苷酸序列；(3)构建发形霞水母过氧化物还原酶的表达质粒，重组工程菌；(4)发形霞水母过氧化物还原酶的表达；(5)重组发形霞水母过氧化物还原酶的纯化。所述步骤(I)中的发形霞水母触手组织cDNA文库通过如下方法构建:I)抽提发形霞水母触手组织总RNA ；2 )分离mRNA，合成发形霞水母触手组织cDNA ；3)将上述cDNA插入pUC19质粒载体，再转化至大肠杆菌DH5a中，涂布于LB培养基平板进行蓝白斑筛选，即构建成发形霞水母触手组织cDNA文库。所述步骤(3)中的构建发形霞水母过氧化物还原酶的表达质粒，重组工程菌，具体步骤为:I)根据发形霞水母过氧化物还原酶基因序列以及原核表达载体pET24a的酶切位点，设计一对带有特异性酶切位点Nhe I和Xho I的PCR引物，如下所示:上游引物:5’ -CTAGCTAGCATGAAAGATGACGAGTC-3 ’下游引物:5，-CCGCTCGAGCATTTCTTCCTTC-3，PCR 反应条件为:95°C保温 5min ;95°C保温 30sec，55.5°C保温 30sec，68°C保温lmin, 30 个循环；68°C保温 5min ；
2)酶切回收后的PCR产物及pET24a原核表达质粒；3)利用两个酶切位点将编码序列连接到pET24a载体上，构建重组表达质粒，然后转化到大肠杆菌Rosetta (DE3)获得重组工程菌。所述步骤(4)中的发形霞水母过氧化物还原酶的表达条件为:12°C，0.5mM IPTG,150rpm/min下诱导10小时,在此诱导条件下重组蛋白主要以可溶形式表达,表达量占总蛋
白量的30%左右。所述步骤(5)中的纯化为采用镍离子亲和层析柱一步纯化即得，洗脱条件为分别占总体积50%的结合缓冲液与50%的洗脱缓冲液；其中，结合缓冲液为NaH2P0420mM;NaC1500mM;咪唑 30mM ；pH7.4，洗脱缓冲液为 NaH2P0420mM; NaC1500mM;咪唑500mM ；pH7.4。本发明的第三方面，提供了发形霞水母过氧化物还原酶及其编码基因在制备抗氧化药物、抗辐射药物、皮肤防护剂、食品防腐剂、抗衰老药物中的应用。本发明通过构建发形霞水母触手组织cDNA文库，采用BLASTx分析法，获得了一个编码过氧化物还原酶的序列，即包含序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。此核苷酸序列全长884bp,包含一个744bp的开放阅读框,编码一个含248个氨基酸残基的蛋白质，即序列表SEQ ID N0.2所不氨基酸序列。该蛋白含有信号肽,为分泌蛋白，定位于细胞外。分子量27.9kDa，等电点为6.3。本发明通过构建发形霞水母过氧化物还原酶基因的原核重组表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，筛选得到表达发形霞水母过氧化物还原酶的重组菌，诱导表达后利用亲和层析法纯化获得重组蛋白，方法简单，价格低廉。本发明获得的重组发形霞水母过氧化物还原酶具有显著的抗氧化活性。通过ABTS+自由基清除法检测到纯化蛋白清除ABTS+自由基的能力为维生素C等价物Trolox的23倍。胰岛素还原法实验中，DTT存在的情况下，胰岛素A、B链间的二硫键可以被重组发形霞水母过氧化物还原酶还原而断裂，两链解离，因B链的溶解度较低而使反应液变浑浊，在655nm处吸光值升高。在进行纯化蛋白对H2O2清除能力的检测时，可观察到随着纯化蛋白浓度的升高或作用时间的延长，反应液在475nm处吸光值持续下降，说明剩余H2O2量随之减少。此外，还通过超螺旋质粒的保护实验证实了纯化蛋白对超螺旋DNA构象具有明显的保护作用。因此，本发明中涉及的发形霞水母过氧化物还原酶在开发抗氧化药物、抗衰老药物、抗辐射药物、皮肤防护剂、食品防腐剂方面将有很大的应用价值。
图1为发形霞水母过氧化物还原酶与其他物种过氧化物还原酶序列的多重比对；其中黑色代表完全同源的区域。图2为本发明中扩增发形霞水母过氧化物还原酶开放阅读框(不含编码信号肽的区域)编码序列的梯度PCR产物的核酸电泳结果；其中，M:2kb的核酸分子量Marker ;1_12:梯度PCR产物。图3为本发明中重组发形 霞水母过氧化物还原酶诱导表达的SDS-PAGE电泳结果；其中，M:蛋白分子量Marker ;1，4:诱导后的重组大肠杆菌超声裂解液；2，5:诱导后的重组大肠杆菌超声裂解上清；3:诱导后的重组大肠杆菌超声裂解沉淀。图4为本发明中重组发形霞水母过氧化物还原酶分离纯化的SDS-PAGE电泳结果；其中，1:未诱导的重组大肠杆菌；2:诱导后的重组大肠杆菌超声裂解上清；3:重组蛋白纯化时穿透峰；4，5:重组蛋白纯化时洗脱峰。图5为检测重组发形霞水母过氧化物还原酶抗氧化能力(ABTS+自由基清除法)时用维生素C等价物Trolox反应而制作的标准曲线(y=_0.0005x+0.2979，R2=0.9976)。图6为检测重组发形霞水母过氧化物还原酶对胰岛素A、B链间二硫键还原作用能力的曲线图。图7为检测重组发形霞水母过氧化物还原酶对H2O2清除能力的曲线图。图8为检测纯化蛋白对超螺旋构象DNA保护作用的核酸电泳结果；其中，
酸分子量 Marker ；1:质粒；2:质粒、FeCl3 ；3:质粒、DTT ；4:质粒、FeCl3、DTT ；5-10:质粒、FeCl3、DTT 及不同浓度(200，150，100，50，25，12.5 μ g/ml)重组蛋白。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。用实施例1制得的发形霞水母过氧化物还原酶进行实施例2-5的实验。
本发明选择的发形霞水母(Cyanea Capillata)采集自浙江省三门湾海域,并经集美大学水产学院教授鉴定(L.Xiao et al, Toxicon, 2009，53:146 - 152)。实施例1:发形霞水母过氧化物还原酶的筛选及制备。1.发形霞水母触手组织cDNA文库的构建和分析I)总RNA的抽提根据Invitrogen公司的Trizol试剂说明进行,氯仿去除蛋白质，获得约7 μ g总RNA ；2)mRNA 的分离按照 QIANGEN 公司的 Oligotex mRNA Spin-coIumn Kit 说明进行，cDNA 的合成则参照 Clontech 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 说明进行；3)将cDNA插入pUC19质粒载体(购自Takara公司)，再转化至大肠杆菌DH5 α(购自博迈德公司)中，涂布于15CM培养皿进行蓝白斑筛选，即构建成发形霞水母触手组织cDNA文库。该文库共有菌落1923个，其中蓝斑35个，重组率98.18%，库容量1.92*106，插入长度彡400bp的有效序列1035条，采用100bp、90%的原则对这些序列进行unigene归并，得到unigene数为528条。同时对序列进行全长分析，在20条序列中有12条序列有相关同源信息，结果为其中12条全长，完整性比率:12/12X100%= 100%，表明该cDNA文库具有较好的质量。对该cDNA文库进行随机测序，所得序列经去载体后进行BLAST分析(http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov)。2.发形霞水母过氧化物还原酶基因序列的分析发形霞水母过氧化物还原酶基因来自上述cDNA文库中编号为4D10的克隆。序列全长884bp，如SEQ ID NO:1所示，包含一个744bp的开放阅读框；编码含248个氨基酸残基的蛋白质，如SEQ ID NO: 2所示，分子量27.9kDa，等电点6.3。
Blastx搜索结果显示该蛋白与多个物种的过氧化物还原酶具有高度同源性(如图1 )，是水母来源的过氧化物还原酶家族的新分子。对其进一步的生物信息学分析显示，该蛋白含有信号肽，为分泌蛋白，定位于细胞外。3.发形霞水母过氧化物还原酶重组表达质粒的构建及工程菌重组I)根据发形霞水母过氧化物还原酶基因序列以及原核表达载体pET24a (购自Novagen公司)的酶切位点，设计并合成一对引物，扩增范围不包含开放阅读框中编码信号肽结构的区域，其中上游引物包含酶切位点Nhe I (GCTAGC)，下游引物包含酶切位点Xho I (CTCGAG),两引物的序列具体如下:上游引物:5’-CTAGCTAGCATGAAAGATGACGAGTC-3’(SEQ ID NO:3)下游引物:5’-CCGCTCGAGCATTTCTTCCTTC-3’ (SEQ ID N0:4)经过梯度PCR实验后，选定55.5°C为最佳退火温度，对目的基因进行PCR大量扩增，PCR反应条件为:
权利要求
1.一种发形霞水母过氧化物还原酶，其特征在于，所述的发形霞水母过氧化物还原酶具有如下(i )或(ii)的蛋白质 (i )具有SEQ ID NO:2所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (ii )SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由(i )衍生的蛋白质。
2.根据权利要求I所述的一种发形霞水母过氧化物还原酶，其特征在于所述的发形霞水母过氧化物还原酶具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，该蛋白含有信号肽，为分泌蛋白，定位于细胞外，分子量27. 9kDa，等电点为6. 3。
3.—种如权利要求I所述的发形霞水母过氧化物还原酶的编码基因，其特征在于，该编码基因为如下(i )或( )的DNA分子 (i )具有SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列； ( )与SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列同源性在80%以上的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的所述的一种发形霞水母过氧化物还原酶的编码基因，其特征在于所述的发形霞水母过氧化物还原酶的编码基因，该核苷酸序列全长884bp，包含一个744bp的开放阅读框。
5.一种如权利要求2所述的发形霞水母过氧化物还原酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (A)构建发形霞水母触手组织cDNA文库； (B)对上述发形霞水母触手组织cDNA文库重组克隆的序列进行测定和分析，获得一个编码过氧化物还原酶的核苷酸序列； (C)构建发形霞水母过氧化物还原酶的表达质粒，重组工程菌； (D)发形霞水母过氧化物还原酶的表达； (E)重组发形霞水母过氧化物还原酶的纯化。
6.根据权利要求5所述的发形霞水母过氧化物还原酶的制备方法，其特征在于所述步骤(A)中的发形霞水母触手组织cDNA文库通过如下方法构建 a)抽提发形霞水母触手组织总RNA； b)分离mRNA，合成发形霞水母触手组织cDNA； c)将上述cDNA插入pUC19质粒载体，再转化至大肠杆菌DH5α中，涂布于LB培养基平板进行蓝白斑筛选，即构建成发形霞水母触手组织cDNA文库。
7.根据权利要求5所述的发形霞水母过氧化物还原酶的制备方法，其特征在于所述步骤(C)中的构建发形霞水母过氧化物还原酶的表达质粒，重组工程菌，具体步骤为 a)设计并合成PCR引物如下 上游引物如SEQ ID NO:3所示， 下游引物如SEQ ID N0:4所示， PCR 反应条件为95°C保温 5min ;95°C保温 30sec，55. 5°C保温 30sec，68°C保温 lmin，30个循环；68°C保温5min ； b)酶切回收后的PCR产物及pET24a原核表达质粒； c)利用两个酶切位点将编码序列连接到pET24a载体上，构建重组表达质粒，然后转化到大肠杆菌Rosetta获得重组工程菌。
8.根据权利要求5所述的发形霞水母过氧化物还原酶的制备方法，其特征在于所述步骤(D)中的发形霞水母过氧化物还原酶的表达条件为12°C，0. 5mM IPTG，150rpm/min下诱导10小时。
9.一种如权利要求I或2所述的发形霞水母过氧化物还原酶在制备抗氧化药物、抗辐射药物、皮肤防护剂、食品防腐剂或抗衰老药物中的应用。
10.一种如权利要求3所述的发形霞水母过氧化物还原酶的编码基因在制备抗氧化药物、抗辐射药物、皮肤防护剂、食品防腐剂或抗衰老药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，目前尚未见对水母过氧化物还原酶的有关研究报道。本发明提供了一种发形霞水母过氧化物还原酶，所述的发形霞水母过氧化物还原酶，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还提供了发形霞水母过氧化物还原酶的编码基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。同时，本发明还提供了发形霞水母过氧化物还原酶及其编码基因在制备抗氧化药物、抗辐射药物、皮肤防护剂、食品防腐剂、抗衰老药物等中的应用。本发明具有较大的临床应用价值。
文档编号A61K48/00GK103255113SQ20131018870
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月21日 优先权日2013年5月21日
发明者张黎明, 阮增良, 柳国艳, 周永红, 张博, 常银龙, 郑杰民, 王倩倩 申请人:中国人民解放军第二军医大学