一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶calp1及其编码基因与表达方法

一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶calp1及其编码基因与表达方法
【专利摘要】本发明属于生物医药【技术领域】，本发明提供了一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1，所述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1，具有如SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还提供了发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的编码基因，具有如SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。同时，本发明还提供了发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达方法和应用。
【专利说明】-种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1及其编码基因 与表达方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶 CALP1及其编码基因与表达方法。

【背景技术】
[0002] 水母是一类分布广泛、生物总量非常庞大的海洋浮游动物。水母毒素主要存在于 触手组织中，是包含多种毒性组分的蛋白质与多肽类毒素。水母毒素具有溶血效应、心血 管毒性、酶活性、神经毒性等多种生物活性。研究水母毒素多重生物效应的物质基础，可为 阐明水母毒素的组成及研发水母蜇伤的防治药物提供科学依据，同时也为充分利用水母毒 素，开发新型的海洋生物药物奠定基础。
[0003] 虾红素样金属蛋白酶家族是一类典型的锌依赖的消化性内肽酶，在人、鼠、两栖 类、鱼、昆虫、软体动物、腔肠动物和细菌等不同进化层级生物中都有发现。虾红素样金属蛋 白酶具有典型的序列特征：Zn结合基序HEXXHXXGFXHEXXRXDRD和Met旋转SXMHY。该家族 中大多数蛋白酶在NH2-端含有信号肽和前肽，极个别不含有信号肽。家族成员之间的区 别主要在于C00H-端结构域不同，并以此进行分类，如Μ印rins、BMP1、HMP1、PMP1、Tolloid 和Astacus等。虾红素样金属蛋白酶有很强的蛋白水解活性，可以降解纤维蛋白原、酪蛋 白、明胶和纤连蛋白等，在生长因子活化、多肽降解和胞外蛋白加工等过程中发挥重要作 用。研究发现，虾红素样金属蛋白酶能降解细胞外基质组分，引起出血等，这与水母毒素的 部分生物学活性相一致(参见文献：作者，题名，期刊名，期卷，页码Guti6rrez JM, Rucavado A. Snake venom metalloproteinases:Their role in the pathogenesis of local tissue damage. Biochimie, 2000, 82:841-850. Lee H, Jung Eun-sun，Kang C，et al. Scyphozoan jellyfish venom metalloproteinases and their role in the cytotoxicity. Toxicon，2011，6:1-8)。近期也有研究报道，褐色蝴I蛛（genus Loxosceles)毒液中存在 astacin-like金属蛋白酶家族分子，能降解胞外基质组分，增加血管和组织通透性，协助其 他毒素成分扩散，可能作为毒素组分发挥生物学功能(参见文献：作者，题名，期刊名，期卷， 页石马 Trevisan-Silva D, Gremski LH, Chaim 0M, et al. Astacin-like metalloproteases are a gene family of toxins present in the venom of different species of the brown spider (genus Loxosceles) · Biochimie，2010,92:21-32)。
[0004] 目前，国内外尚未见对水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的有关研究报道。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1及其编码基 因，本发明的另一目的在于提供该发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达方法。
[0006] 本发明通过构建发形霞水母触手组织cDNA文库，并对该文库重组克隆的序列进 行测定和注释分析，获得了发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的编码基因。该发形霞 水母虾红素样金属蛋白酶CALP1属于虾红素样金属蛋白酶家族新成员，可为研究水母金属 蛋白酶结构与功能的关系，阐明水母毒素的生物活性机理提供物质基础，同时在开发栓塞 性疾病药物中具有良好的应用前景。
[0007] 本发明的主要技术方案是，通过构建发形霞水母触手组织cDNA文库，对其进行测 序和筛选，获得发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的编码基因。
[0008] 本发明的第一方面，提供了一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1，所述的一 种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1，具有如下（i )或（ii)的蛋白质：
[0009] ( i )具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010] (ii)SEQ ID N0:2所示的氨基酸序经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且 同等功能的由（i )衍生的蛋白质。
[0011] 所述的一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1，具有如SEQ ID N0:2所示的氨 基酸序列，该蛋白含有信号肽，为分泌蛋白，定位于细胞外，分子量35. 6kDa，等电点为8. 0。
[0012] 本发明还提供了一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的编码基因，为如下 (i )或（? )的DNA分子：
[0013] ( i )具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
[0014] (ii )与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列同源性在80%以上的核苷酸序列。
[0015] 所述的一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的编码基因，该核苷酸序列全 长1254bp，包含一个942bp的开放阅读框，如SEQ ID NO: 1所示。
[0016] 本发明的第二方面，提供了一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达方 法，包括如下步骤：
[0017] (1)构建发形霞水母触手组织cDNA文库；
[0018] (2)对上述发形霞水母触手组织cDNA文库重组克隆的序列进行测定和分析，获得 一个编码奸红素样金属蛋白酶CALP1的核苷酸序列；
[0019] (3)构建发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达质粒，重组工程菌；
[0020] (4)发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达；
[0021] (5)重组发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的纯化。
[0022] 所述步骤（1)中的发形霞水母触手组织cDNA文库通过如下方法构建：
[0023] 1)抽提发形霞水母触手组织总RNA ;
[0024] 2 )分离mRNA，合成发形霞水母触手组织cDNA ;
[0025] 3)将上述cDNA插入pUC19质粒载体，再转化至大肠杆菌DH5a中，涂布于LB培养 基平板进行蓝白斑筛选，即构建成发形霞水母触手组织cDNA文库。
[0026] 所述步骤（3)中的构建发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达质粒，重组 工程菌，具体步骤为：
[0027] 1)根据发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的成熟蛋白编码序列以及原核表 达载体pET24a的酶切位点，设计一对带有特异性酶切位点Nhe I和Xho I的PCR引物，如 下所示：
[0028] 上游引物：5' -TACTAGCTAGCAAGATTTGGCCTG-3'（Nhe I 位点），Tm 值为 60. 26°C ;
[0029] 下游引物：5' -CCGCTCGAGGTATAAATCTTGCT-3'（Xho I 位点），Tm 值为 60. 17°C ;
[0030] PCR 反应条件为：95°C保温 5min ;95°C保温 30sec，55. 2-65. 2°C保温 30sec，72°C 保温30sec，35个循环；72°C保温lOmin ;冷却至4°C保存；
[0031] 2)酶切回收后的PCR产物及pET24a原核表达质粒；
[0032] 3)利用两个酶切位点将编码序列连接到pET24a载体上，构建重组表达质粒，然后 转化到大肠杆菌Rosetta (DE3)获得重组工程菌。
[0033] 所述步骤（4)中的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达条件为：30°C， ImM IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，150rpm/min下诱导8h，在此诱导条件下重组蛋 白主要以可溶蛋白的形式表达，表达量占总蛋白量的30%左右。
[0034] 所述步骤（5)中的纯化为采用镍离子亲和层析柱一步纯化即得，洗脱条件为 NaH2P0420mM ;NaC1500mM ;咪唑 30mM ;ρΗ=8· 0。
[0035] 本发明通过构建发形霞水母触手组织cDNA文库，采用BLASTx分析法，获得了一个 编码过虾红素样金属蛋白酶CALP1的序列，即包含序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。 此核苷酸序列全长1254bp，包含一个942bp的开放阅读框，编码一个含313个氨基酸残基的 蛋白质，即序列表SEQ ID N0. 2所不氣基酸序列。该蛋白含有f目号肤，为分泌蛋白，定位于 细胞外。分子量35. 6kDa，等电点为8.0。
[0036] 本发明通过构建发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1基因的原核重组表达载 体，将重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，筛选得到表达发形霞水母虾红素样金属蛋白 酶CALP1的重组工程菌，诱导表达后利用亲和层析法纯化获得重组蛋白，方法简单，价格低 廉。
[0037] 本发明的第三方面，是提供上述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1在制备 蛋白水解剂、生长因子活化剂、溶血药物、溶栓药物、抗肿瘤药物等中的应用。
[0038] 本发明的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1，具有潜在的细胞外蛋白降解活 性，可能与肿瘤细胞侵袭、转移、血管生长及肿瘤细胞增殖有关，可开发为新型溶栓和抗肿 瘤药物。
[0039] 本发明提供的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1属于虾红素样金属蛋白酶 家族新成员，可为研究水母金属蛋白酶结构与功能的关系，阐明水母毒素的生物活性机理 提供物质基础，同时在开发栓塞性疾病药物中具有良好的应用前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0040] 图1为发形霞水母虾红素样金属蛋白酶与其他物种虾红素样金属蛋白酶序列的 多重比对；其中，黑色代表完全同源的区域，箭头区域标示Astacin结构域的保守的活化位 点位置。
[0041] 图2为发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1结构域示意图；
[0042] 图3为载体pET24a (+)的图谱；
[0043] 图4为重组质粒pET24a_CALPl的构建流程示意图；
[0044] 图5为本发明中扩增发形霞水母虾红素样金属蛋白酶开放阅读框(不含编码信号 肽和前肽的区域）编码序列的梯度PCR产物的核酸电泳结果；
[0045] 其中，M:DNA Marker(DL2,000) ;1-12 :退火温度分别为 55.2°C、55.7°C、56.4°C、 57. 3°C、58. 7°C、59. 9°C、60. 8°C、62. 1°C、63. 3°C、64. 3°C、64. 9°C、65. 2°C 的梯度 PCR 产物；
[0046] 图6为重组载体构建后阳性菌落进行菌落PCR验证电泳结果；
[0047] 其中，1-4 :菌落PCR产物；5 :阳性对照；6 :阴性对照；
[0048] 图7为本发明中CALP1诱导表达的SDS-PAGE电泳结果；
[0049] 其中，1 :阴性对照；2 :诱导后的重组大肠杆菌SDS直接裂解；3 :诱导后的重组大 肠杆菌超声裂解；4 :诱导后的重组大肠杆菌超声裂解上清；
[0050] 图8为本发明中CALP1诱导表达的Western Blot鉴定结果；
[0051] 其中，1 :阴性对照；2 :诱导后的重组大肠杆菌SDS直接裂解；3 :诱导后的重组大 肠杆菌超声裂解；4 :诱导后的重组大肠杆菌超声裂解上清；
[0052] 图9为本发明中CALP1纯化后电泳验证结果；
[0053] 其中，1 :纯化前蛋白样品，M :170，130,95,72,55,43,34,26kD ;2、3 :纯化后的收集 的各蛋白样品；
[0054] 图10为本发明中CALP1纯化后Western Blot鉴定结果；
[0055] 其中，1 :纯化前蛋白样品，2、3 :纯化后的收集的各蛋白样品。

【具体实施方式】
[0056] 下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明 范围的限制。
[0057] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0058] 本发明选择的发形霞水母（Cyanea Capillata)采集自浙江省三门湾海域，并经集 美大学水产学院教授鉴定（L. Xiao et al，Toxicon, 2009, 53:146 - 152)。
[0059] 实施例1 :发形霞水母触手组织cDNA文库的构建和分析
[0060] 1)总RNA的抽提根据Invitrogen公司的Trizol试剂说明进行，氯仿去除蛋白质， 获得约7 μ g总RNA ;
[0061] 2)mRNA 的分离按照 QIANGEN 公司的 Oligotex mRNA Spin-column Kit 说明进行， cDNA 的合成则参照 Clontech 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 说明进行；
[0062] 3)将cDNA插入pUC19质粒载体(购自Takara公司），再转化至大肠杆菌DH5 α (购 自北京博迈德公司)中，涂布于15CM培养皿进行蓝白斑筛选，即构建成发形霞水母触手组织 cDNA文库。
[0063] 该文库共有菌落1923个，其中蓝斑35个，重组率98. 18%，库容量1.92 X 106,插入 长度彡400bp的有效序列1035条，采用100bp、90%的原则对这些序列进行unigene归并， 得到unigene数为528条。同时对序列进行全长分析，在20条序列中有12条序列有相关 同源信息，结果为其中12条全长，完整性比率：12/12X100%= 100%，表明该cDNA文库具 有较好的质量。对该cDNA文库进行随机测序，所得序列经去载体后进行NCBI的蛋白质数 据库同源十牛检索矛口注释（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。
[0064] 实施例2 :发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1基因序列的分析
[0065] 发形霞水母奸红素样金属蛋白酶CALP1基因来自上述cDNA文库中编号为 SM003-H04的克隆。序列全长1254bp，如SEQ ID N0:1所示，包含183bp5'非编码区，942bp 编码区，201bp3'非编码区，后接polyA尾，起始密码子出现在第184位，终止密码子出现在 1078位。CALP1全长序列的0RF框编码一个包含313个氨基酸残基的蛋白质（139-1080位 碱基)，如SEQ ID勵:2所示，分子量35.61^)&，等电点为8.0。
[0066] Blastx搜索结果显示，该蛋白与多个物种的虾红素样金属蛋白酶具有高度同源性 (如图1 )，是水母来源的虾红素样金属蛋白酶家族的新分子。
[0067] 对其进一步的生物信息学分析显示，该蛋白含有信号肽，为分泌蛋白，定位于细胞 夕卜。结构域分析结果如图2所示，CALP1含有Astacin结构域。
[0068] 实施例3 :发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1重组表达质粒的构建及工程菌 重组
[0069] 1)根据发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的成熟蛋白编码序列以及原核表 达载体pET24a (购自Novagen公司）的酶切位点，选择Nhe I和Xho I为酶切位点，设计 特异性引物，构建目标蛋白C端融合表达6*His标签的原核重组表达质粒(如图4)。引物序 列如下（由上海生工生物工程公司合成）：
[0070] 上游引物：5' -TACTAGCTAGCAAGATTTGGCCTG-3'（Nhe I 位点），Tm 值为 60. 26°C ; (SEQ ID N0:3)
[0071] 下游引物：5' -CCGCTCGAGGTATAAATCTTGCT-3'（Xho I 位点），Tm值为 60. 17°C; (SEQ ID N0:4)
[0072] CALP1目标序列经PCR扩增后，预期为653bp。
[0073] 为了获得较高的PCR扩增量，先通过梯度PCR筛选最适退火温度，再按照最优退火 温度进行PCR扩增。
[0074] 取0· 2ml PCR管，每管分别按10 μ 1 (或25 μ 1)体系加入相应液体：
[0075] 模板 DNA 0.2 μ? 0 5 μ? 2xTaq DNA|.fi 5 μ] 12.5 μ] 上游引物(100 μΜ) 0.2 μ? 0.5 μ? 下游引物(100 μΜ) 0.2 μ? 0.5 μ? ddH20 Up to 10 μ? Up to 25 μ!
[0076] 在管盖处加入约5μ 1无菌石蜡油，闭合管盖后，快速离心，使各种成分混匀。
[0077] PCR扩增，循环参数为：
[0078] 95 °C 5 min 95 °C 30 sec 退火温度范围* 30 sec ^35个循环 72 C 30 sec 72 C 10 min 4°C /
[0079] 注：*此处为CALP1的12个温度梯度：55. 2°C -65. 2°C
[0080] PCR反应结束后采用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。取5 μ 1 PCR产物与适 量6XDNA Loading Buffer混匀，点入琼脂糖凝胶上样孔中，以DNA Marker (DL2000)为对 照，在DNA水平电泳槽中110V恒压电泳30min。电泳结束后将凝胶放入凝胶成像仪进行成 像、分析。
[0081] 根据10 μ 1 PCR体系的梯度PCR结果选择扩增效果最好的退火温度，结果如图5 所示，PCR产物片段大小均与目标插入序列大小相一致。CALP1退火温度为56. 4-58. 7°C时， 扩增效果均较佳，其中56. 4°C为其最适的退火温度。在此温度下按照25μ1 PCR体系大量 扩增目的片断。将鉴定结果正确的PCR产物按照北京天根生化公司的DNA纯化回收试剂盒 的说明步骤进行回收。
[0082] 2)接种含pET24a空质粒的E.coli Τ0Ρ10 (购自北京博迈德公司），按照质粒小提 试剂盒进行质粒提取。分别用Nhe I和Xho I双酶切CALP1和pET24a载体，酶切体系如 下：
[0083] l〇xNEBuffer4 5 μ1 PCR产物/pET24a载体 约2·5 μ8 lOxBSA 〇·2 μ1 内切酶 各0·5 μ? ddH20 Up to 50 μ?
[0084] 将溶液混匀，水浴槽中37 °C反应lh后全部进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物以 DNA Marker (DL2, 000)为对照，pET24a 载体以 DNA Marker (DL15, 000)为对照，紫外灯下分 别将鉴定结果正确目的产物和载体切下，使用DNA纯化回收试剂盒进行琼脂糖凝胶回收纯 化，回收后分别取适量的洗脱产物由1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物和载体条带是否正 确，利用核酸蛋白检测仪进行DNA定量。去磷酸化反应按照如下体系进行：
[0085] 酶切处理的质粒 1-20 pmol lOxCIAP Buffer 5 μ? CIAP 1-2 μ? ddH20 Up to 50 μ?
[0086] 37°C水浴，反应30-60min。反应后使用DNA纯化回收试剂盒进行DNA回收纯化。 纯化后分别取适量的洗脱产物由1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物和载体条带是否正确， 利用核酸蛋白检测仪进行DNA定量。
[0087] 3)CALP1目标插入序列和pET24a表达载体的连接方式如图4,连接反应体系如 下：
[0088] T4 Ligase Buffer 2 μ] DNA 片段* 总 _ii;::<10ng/,ul
[0089] T4 Ligase 1 μ? ddH20 Up to 20 μ]
[0090] 注* :按照PCR纯化产物/质粒片段=3、5、6、8、9、10分别加入，总量不多于0. 2μ g。
[0091] 将上述反应体系混匀并短暂离心，16°C，反应2h。转化连接产物：取4支100μ 1大 肠杆菌E. coli Τ0Ρ10感受态细胞置于冰浴中，取刚融化细胞悬液50 μ 1分装到预冷的无菌 离心管中，置于冰浴中。为8支感受态细胞悬液标号，一支加入5μ 1空白载体pET24a，作为 阳性对照；另一支为阴性对照，其余6支中分别加入上步对应的连接液5μ 1 ;轻轻旋转离心 管以混匀内容物，在冰浴中静置30min。将离心管置于42°C水浴热激90s，冰浴5min。向每 个离心管中加入950 μ 137°C预温的无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37°C、150rpm 摇床振荡培养lh，使菌体复苏。12, OOOrpm离心lmin，除去上层培养液900 μ 1，吹打混匀转 化菌，吸取已转化的感受态细胞全部加到含卡那霉素（100 μ g/ml)和氯霉素（34 μ g/ml)的 LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液涂布均匀。37°C培养，待转化产物完 全被培养基吸收后，倒置培养14_16h，封口膜封口后4°C避光存放。
[0092] 阳性菌落的检测：从平板上挑取单菌落至5ml含卡那霉素（100μ g/ml)和氯霉素 (34μ g/ml)的LB培养基中，250rpm，37°C振荡培养12-16h。吸取50μ 1菌液沸水浴5min， 12, OOOrpm离心lmin，取1 μ 1上清液为模板，其余成分和条件同前，按照前述10 μ 1 PCR体 系和最优退火温度进行PCR扩增。取5μ1 PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测是否与目 的条带大小一致。然后将经菌落PCR反应验证条带位置正确的重组菌株(如图6)送到华大 基因测序，测序结果和目的基因序列进行BLAST比对，比对结果完全正确的即为所需的重 组质粒。
[0093] 实施例4 :发形霞水母奸红素样金属蛋白酶CALP1的表达
[0094] 将构建好的重组质粒转化入E. coli Rosetta(DE3)感受态细胞（购自北京博迈 德公司）中，挑取阳性重组菌和含有空载体pET24a的表达菌分别接种于10mL含卡那霉素 (100 μ g/ml)和氯霉素（34 μ g/ml)的LB培养液中，37 °C，250rpm振荡培养过夜。取2. 5mL 过夜培养的表达菌接种于50mL含卡那霉素（100 μ g/ml)和氯霉素（34 μ g/ml)的LB培养液 中，分别接种两瓶50ml培养液，37°C，250rpm振荡培养3h。取培养好的重组表达菌和含有 空载体pET24a的表达菌各一瓶，加入IPTG使终浓度为1禮，251：，150印111振荡培养811，分 别取样lml用SDS裂解液直接裂解后进行SDS-PAGE电泳检测。将电泳检测阳性结果的菌 液，转入50ml离心管，8, 000 X g离心5min，收集菌体，每管加入10ml含l%Triton X-100的 PBS，冰浴超声100W、100X 5s、间隔10s破碎，裂解菌体，分别留取裂解液50 μ 1进行后续检 测。裂解后菌液10, 〇〇〇Xg离心15min，收集上清，经SDS-PAGE电泳可见在此诱导条件下 重组蛋白主要以可溶蛋白的形式表达，表达量占总蛋白的30%左右，分子量与预测值(加上 His标签后约26kDa)相符，如图7所示。
[0095] 使用6*HIS标签抗体对目标蛋白进行了检测，以确定目标融合蛋白的特异性。 Western Blot鉴定结果显示，小鼠抗His单抗在各组样品中均仅能显示出一条特异性条 带，且各条带位置均与上述SDS-PAGE分析结果相一致（图8)。
[0096] 实施例5 :重组发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的纯化
[0097] 将诱导后的菌液离心（10, 000 X g*10min)收集菌体，然后使用结合缓冲液 (NaH2P0420mM ;NaC1500mM ;pH=8. 0)充分重悬菌体，进行超声裂菌，超声裂解液离心 (10, 000 Xg*10min)后取上清进行纯化。最终根据GE Healthcare公司的HisTrap HP层析 柱以及人KTApurifier分离纯化系统的操作说明进行镍离子亲和层析，即得到较纯的发形 霞水母虫下红素样金属蛋白酶CALP1。
[0098] SDS-PAGE电泳可见目的条带与预测位置相符（图9)，纯度在75%以上，使用的洗脱 条件为：NaH2P0 420mM ;NaC1500mM ;咪唑 30mM ;ρΗ=8· 0。
[0099] Western Blot鉴定结果显示，小鼠抗His单抗在各组样品中均仅能显示出一条特 异性条带，且各条带位置均与上述SDS-PAGE分析结果相一致（图10)。
[0100] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
【权利要求】
1. 一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1，其特征在于，所述的发形霞水母虾红 素样金属蛋白酶CALP1,具有如下（i )或（ii)的蛋白质： (i )具有SEQ ID NO:2所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (ii)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等 功能的由（i )衍生的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1，其特征在于，所 述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，该蛋 白含有信号肽，为分泌蛋白，定位于细胞外，分子量35. 6kDa，等电点为8. 0。
3. -种如权利要求1所述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的编码基因，其特 征在于，该编码基因为如下（i )或（ii )的DNA分子： (i )具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列； (ii )与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列同源性在80%以上的核苷酸序列。
4. 根据权利要求3所述的一种发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的编码基因， 其特征在于，所述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的编码基因的核苷酸序列全长 1254bp，包含一个942bp的开放阅读框。
5. -种如权利要求1或2所述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达方法， 其特征在于，该方法包括如下步骤： (A) 构建发形霞水母触手组织cDNA文库； (B) 对上述发形霞水母触手组织cDNA文库重组克隆的序列进行测定和分析，获得一个 编码虾红素样金属蛋白酶CALP1的核苷酸序列； (C) 构建发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达质粒、重组工程菌； (D) 发形霞水母奸红素样金属蛋白酶CALP1的表达； (E) 重组发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的纯化。
6. 根据权利要求5所述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达方法，其特征 在于：所述步骤(A)中的发形霞水母触手组织cDNA文库通过如下方法构建： a) 抽提发形霞水母触手组织总RNA ; b) 分离mRNA，合成发形霞水母触手组织cDNA ; c) 将上述cDNA插入pUC19质粒载体，再转化至大肠杆菌DH5 α中，涂布于LB培养基平 板进行蓝白斑筛选，即构建成发形霞水母触手组织cDNA文库。
7. 根据权利要求5所述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达方法，其特征 在于，所述步骤（C)中的构建发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达质粒、重组工程 菌，具体步骤为： a) 设计并合成PCR引物如下： 上游引物如SEQ ID NO:3所示， 下游引物如SEQ ID N0:4所示， PCR 反应条件为：95°C保温 5min ;95°C保温 30sec，55. 2-65. 2°C保温 30sec，72°C保温 30sec，35个循环；72°C保温lOmin ;冷却至4°C保存； b) 酶切回收后的PCR产物及pET24a原核表达质粒； c) 利用两个酶切位点将编码序列连接到pET24a载体上，构建重组表达质粒，然后转化 到大肠杆菌Rosetta (DE3)获得重组工程菌。
8. 根据权利要求5所述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达方法，其特征 在于，所述步骤（D)中的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达条件为 ：30°C，lmM IPTG，150rpm/min 下诱导 8 小时。
9. 根据权利要求5所述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1的表达方法，其 特征在于，所述步骤（E)中的纯化为采用镍离子亲和层析柱一步纯化即得，洗脱条件为 NaH2P0420mM ;NaC1500mM ;咪唑 30mM ;ρΗ=8· 0。
10. -种如权利要求1或2所述的发形霞水母虾红素样金属蛋白酶CALP1在制备蛋白 水解剂、生长因子活化剂、溶血药物、溶栓药物、抗肿瘤药物等中的应用。
【文档编号】A61K38/48GK104195124SQ201310258184
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】张黎明, 温小娟, 柳国艳, 陆佳, 阮增良, 王倩倩, 王涛 申请人:中国人民解放军第二军医大学