一种利用香菇粗酶液降解双酚a的方法
【专利摘要】本发明提供一种利用香菇粗酶液降解双酚A的方法。制备香菇粗酶液，移取缓冲溶液，35～55℃恒温水浴，控制反应体系pH值为3～5，加入酶液，再加入浓度为20～60mg/L的双酚A溶液，反应20～60min，加入2mL丙酮终止反应，即实现香菇粗酶液对双酚A的降解。本发明的方法采用的是微生物酶解法降解双酚A，降解效率高，所采用的微生物菌种易获得，具有高效、绿色、无二次污染的优点。
【专利说明】
一种利用香菇粗酶液降解双酚A的方法
技术领域
[0001]本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用香菇粗酶液降解双酸A的方法。
【背景技术】
[0002]双酚A，学名2，2_ 二 (4-羟基苯基)乙烷，简称BPA。双酚A由丙酮和苯酚合成，主要是作为单体生产环氧树脂、聚碳酸酯，二者的用量约占双酸A总用量的95%。双酚A具有良好的机械性能，水分吸收较低，热稳定性好，常被用在生产水管、食品容器、牙科产品等产品，而这些产品与我们的生活息息相关。随着这些产品的广泛使用，双酚A通过富集途径进入环境，通常以低浓度出现在地表水中。近几年，双酚A在水体中检出浓度有逐年增大的趋势。因此，如何处理水环境中双酸A成为急需解决的难题。
[0003]香菇，又称香蕈、冬菇，是一种生长在木材上的真菌类。香菇能够通过胞外酶作用降解木质素、纤维素，是一类降解能力相当强的白腐真菌，富含能够降解木质素的多种酶。白腐真菌木质素酶系统包括两类三种，一类是利用H2O2作电子受体的过氧化物酶类，这类酶包括木质素过氧化物酶和锰依赖过氧化物酶;另一类是利用O2作为电子受体的多酚氧化酶类，这类酶称为漆酶。常规的培养方法获得的香菇木质素降解酶系中存在的木质素降解酶是锰过氧化物酶和漆酶，但不包括另一种常见的木质素过氧化物酶。
[0004]目前，双酚A处理方法大部分采用的是活性炭吸附法和化学法。活性炭吸附是靠分子之间范德华力完成的，操作简便，但此法并没有真正将双酚A从环境中去除，在一定条件下，会发生解吸，造成二次污染。化学去除法降解效率高，而双酸A具有低浓度效应，当双酚A浓度低于废水中干扰物浓度时，去除双酚A至其标准安全范围内需要的成本较高，操作复杂。采用微生物降解双酸A不会造成二次污染。近几年，微生物降解双酚A的报道文献主要是菌种的筛选与鉴定，而这方面工作周期比较长，采用常见微生物降解双酚A的方法仍然比较匮乏。
[0005]根据香菇强的降解木质素能力原理，采用人工加入酶诱导物，提高酶产量和降解能力，提出一种应用香菇粗酶液降解双酚A的方法。我国香菇资源丰富，在人们日常生活中比较容易获得，成本低、绿色、安全、无污染。酶促反应具有催化效率高、反应条件温和、可调节性等特点，应用香菇粗酶液分解双酚A可以大大提高分解双酚A类物质的效果，达到有效去除环境污染物的目的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术对双酚A处理中存在二次污染、操作复杂、降解效率低，提供一种利用香菇粗酶液降解双酸A的方法。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0008]—种利用香菇粗酶液降解双酸A的方法，包括以下步骤:
[0009](I)挑取香菇菌种转接到PDA培养基上，25°C恒温培养10d，待菌丝长满培养基后，挑取若干菌丝接种到含有1.5mmol/L的苯甲醇的液体培养基中进行培养12?15d，即得香菇菌种培养液。
[0010](2)取步骤(I)中培养液，经冷冻离心机4°C、4000?6000r/min离心分离15?20min
后，取上层清液即为粗酶液。
[0011](3)按缓冲溶液与双酚A溶液体积比(v/v)为20?30%移取缓冲溶液于三角烧瓶中，将三角烧瓶置于35?55°C恒温水浴中，控制反应体系pH值为3?5，然后按酶液与双酚A溶液体积比(v/v)为2?5 %加入步骤⑵制备的粗酶液，再加入浓度为20?60mg/L的双酚A溶液，反应20?60min，加入2mL丙酮终止反应，即实现香菇粗酶液对双酸A的降解。
[0012]本发明步骤(3)所述的缓冲溶液为乙酸-乙酸钠缓冲溶液、乳酸-乳酸钠缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中的任一种。
[0013]优选的，所述缓冲溶液为乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
[0014]优选的，所述pH值为3.5?4.5。
[0015]优选的，所述双酸A初始浓度为30?50mg/L。
[0016]优选的，所述温度为50°C。
[0017]优选的，所述反应时间为30min。
[0018]优选的，酶加入量为3%。
[0019]本发明的有益效果体现在:本方法采用的是微生物酶解法降解双酚A，降解效率高，且所采用的微生物菌种易获得，具有高效、绿色、无二次污染的优点。
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例中缓冲溶液种类对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0021]图2为本发明实施例中温度对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0022]图3为本发明实施例中双酸A浓度对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0023]图4为本发明实施例中酶解时间对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0024]图5为本发明实施例中粗酶液添加量对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0025]图6为本发明实施例中香菇菌种培养液中添加苯甲醇、添加白藜芦醇和常规培养液制备的香菇粗酶液降解双酸A对比情况。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明保护范围不仅限于此。
[0027]本实施中的PDA培养基配方:马铃薯20%、葡萄糖2%、K2HP04 0.2%、琼脂2%、水余量，PH自然;液体培养基:马铃薯20 %、麦芽糖2.5 %、蛋白胨0.5 %、酵母粉0.3 %、牛肉浸膏
0.3%,MgSO4 0.01% ,K2HPO4 0.1 %、水余量、柠檬酸调节pH值至3.5。培养基配制后先煮沸30min，经三层纱布过滤，分装后于121°C ,0.103Mpa灭菌20min。
[0028](I)香菇培养液的制备
[0029]挑取香菇菌种Icm2接种到TOA培养基上，25°C恒温培养10d，待菌丝长满培养基后，挑取若干菌丝接种到含有1.5mmol/L苯甲醇的液体培养基中，于25°C、160r/min条件下恒温振荡培养12d，获得香燕菌种培养液。
[0030](2)香菇粗酶液的制备
[0031 ] 取步骤(I)中的培养液经冷冻离心机4°C、6000r/min离心分离15?20min后，取上层清液即为粗酶液。
[0032]实施例1缓冲溶液种类及pH对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0033]分别按缓冲溶液与双酚A溶液体积比(v/v)为20%移取乙酸-乙酸钠缓冲溶液、乳酸-乳酸钠缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，每种缓冲溶液分别放置于6只编号的三角烧瓶中，总共18只三角烧瓶，将三角烧瓶置于45°C恒温水浴中，控制反应体系pH值为3、3.5、
4、4.5、5、6，然后按酶液与双酸A溶液体积比(v/v)为2 %加入步骤(2)制备的粗酶液，再加入浓度为30mg/L的双酚A溶液，反应30min，加入2mL丙酮终止反应，即实现香菇粗酶液对双酚A的降解。得到的结果具体如图1所示，从图中可以看出，在PH值为3.5?4.5，三种缓冲溶液体系下双酸A降解率均高于80%，其中乙酸-乙酸钠缓冲溶液体系的双酸A降解率比乳酸-乳酸钠缓冲溶液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液体系的双酚A降解率高。当pH>5，三种缓冲溶液体系的双酸A降解率均发生下降。
[0034]实施例2温度对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0035]分别按缓冲溶液与双酚A溶液体积比(v/v)为20%移取乙酸-乙酸钠缓冲溶液于7只编号的三角烧瓶中，将三角烧瓶分别置于300C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C恒温水浴中，然后分别控制反应体系pH值为4，然后按酶液与双酚A溶液体积比(v/v)为3%加入步骤(2)制备的粗酶液，再加入浓度为40mg/L的双酚A溶液，反应30min，加入2mL丙酮终止反应，即实现香菇粗酶液对双酚A的降解。得到的具体结果如图2所示，从图中可以看出，当温度为50°C时，双酸A降解率最高，为95%;当温度大于50°C后，双酚A降解率开始下降；当温度达到600C时，双酚A降解率仅为32 %，这是由于高温导致酶失活，从而导致双酚A降解率下降。
[0036]实施例3双酸A浓度对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0037]分别按缓冲溶液与双酚溶液体积比(v/v)为25%移取乙酸-乙酸钠缓冲溶液于6只编号的三角烧瓶中，将三角烧瓶置于50°C恒温水浴中，控制反应体系pH值为4.5，然后按酶液与双酚A溶液体积比(v/v)为2.5%加入步骤(2)制备的粗酶液，再分别加入浓度为20mg/1^、3011^凡、4011^凡、5011^凡、6011^凡、7011^凡的双|^\溶液，反应30111；[11，加入21111^丙酮终止反应，即实现香菇粗酶液对双酚A的降解。具体结果如图3所示，从图中可以看出，双酚A浓度为20?50mg/L时，双酚A降解率均大于90%，当双酚A浓度兰70mg/L时，双酚A的降解率仅为65%。
[0038]实施例4酶解时间对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0039]分别按缓冲溶液与双酚溶液体积比(v/v)为25%移取乙酸-乙酸钠缓冲溶液于5只编号的三角烧瓶中，将三角烧瓶置于50°C恒温水浴中，控制反应体系pH值为4.5，然后按酶液与双酚A溶液体积比(v/v)为2 %加入步骤(2)制备的粗酶液，再加入浓度为50mg/L的双酚A溶液，分别反应20111；[11、30111；[11、40111；[11、50111；[11、60111；[11，加入21111^丙酮终止反应，即实现香燕粗酶液对双酸A的降解。具体结果如图4所述，从图中可以看出，随着酶解时间的增长，双酚A降解率增大，当酶解时间为30min时，双酸A的降解率为92.3%。
[0040]实施例5粗酶液添加量对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0041]分别按缓冲溶液与双酚溶液体积比(v/v)为25%移取乙酸-乙酸钠缓冲溶液于7只编号的三角烧瓶中，将三角烧瓶置于50°C恒温水浴中，控制反应体系pH值为4，然后分别按酶液与双酚A溶液体积比(￥八)为1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%加入步骤(2)制备的粗酶液，再分别加入浓度为30mg/L的双酸A溶液，反应40min，加入2mL丙酮终止反应，即实现香菇粗酶液对双酚A的降解。具体结果如图5所示，从图中可以看出，随着酶添加量增加，双酸A降解率增大，当酶添加量为3%时，双酸A降解率为95%。
[0042]实施例6苯甲醇和白藜芦醇对香菇粗酶液降解双酸A的影响。
[0043]分别按缓冲溶液与双酚溶液体积比(v/v)为25%移取乙酸-乙酸钠缓冲溶液于3只编号的三角烧瓶中，将三角烧瓶置于50°C恒温水浴中，控制反应体系pH值为4.5，然后按酶液与双酚A溶液体积比(v/v)为3 %加入粗酶液，编号I加入步骤(2)制备的粗酶液，编号2加入以白藜芦醇替代苯甲醇的香菇培养液按照步骤(2)制备的粗酶液，编号3加入以蒸馏水替代苯甲醇的香菇培养液按照步骤(2)制备的粗酶液作为空白对照，再分别加入浓度为40mg/L的双酸A溶液，反应30min，加入2mL丙酮终止反应，即实现香燕粗酶液对双酸A的降解。得到的结果具体如图6所示，香菇菌种培养液中加入苯甲醇获得的粗酶液降解双酸A的降解率高于添加白藜芦醇获得的粗酶液，而不添加任何化学物质的培养液获得的粗酶液降解双酚A能力最差。
[0044]上述实施例为本发明较佳实施方式，但是本发明实施方式不仅限于此，凡是对本发明技术方案进行修改、组合、等同替换，但不脱离本发明技术方案的思路和范围，均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种利用香菇粗酶液降解双酸A的方法，其特征在于，所述方法具体步骤为: (1)挑取香菇菌种转接到PDA培养基上，25°C恒温培养10d，待菌丝长满培养基后，挑取若干菌丝接种到含有1.5mmol/L苯甲醇的液体培养基中进行培养12?15d，即得香菇菌种培养液。 (2)取步骤(I)中培养液，经冷冻离心机4°C、4000?6000r/min离心分离15?20min后，取上层清液即为粗酶液。 (3)按缓冲溶液与双酚A溶液体积比(v/v)为20?30%移取缓冲溶液于三角烧瓶中，将三角烧瓶置于35?55°C恒温水浴中，控制反应体系pH值为3?5，然后按酶液与双酸A溶液体积比(v/v)为2?5 %加入步骤⑵制备的粗酶液，再加入浓度为20?60mg/L的双酚A溶液，反应20?60min，加入2mL丙酮终止反应，即实现香菇粗酶液对双酸A的降解。2.根据权利要求1所述的香菇粗酶液降解双酚A的方法，其特征在于，所述香菇菌种培养液中含有苯甲醇。3.根据权利要求1所述的香菇粗酶液降解双酚A的方法，其特征在于，所述缓冲溶液乙酸-乙酸钠缓冲溶液、乳酸-乳酸钠缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中的任一种。4.根据权利要求1或3所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液优选为乙酸-乙酸钠缓冲溶液。5.根据权利要求1所述的香菇粗酶液降解双酚A的方法，所述反应体系pH值优选为3.5?4.5ο6.根据权利要求1所述的香菇粗酶液降解双酚A的方法，所述双酚A初始浓度优选为30?50mg/Lo7.根据权利要求1所述的香菇粗酶液降解双酸A的方法，所述酶解温度优选为50°C。8.根据权利要求1所述的香菇粗酶液降解双酚A的方法，所述酶解反应时间优选为30mino9.根据权利要求1所述的香菇粗酶液降解双酚A的方法，所述酶液加入量按酶液与双酚A溶液体积比(v/v)优选为3%。
【文档编号】C02F3/34GK106006994SQ201610341621
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】杨广群, 何兰兰
【申请人】佛山市聚成生化技术研发有限公司