专利名称：As499酶菌提取方法
技术领域：
本发明属于固氮菌类，是指绿氮酶菌的提取方法。
目前国外应用重组DNA技术开发了12种氨基酸产生菌，参见(分开特许公报186、496、1982年)、(JP59-210、887、1984年)及(JP60-62、994、1985年)等，但没有应用重组DNA技术提取绿氮酶菌的新菌株方法，因此关于应用重组DNA技术提取绿氮酶菌的方法尚未见报导。
绿氮酶菌是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006，和野生豆科植物的根瘤菌，应用重组DNA技术进行氨基酸产生菌的定向育种，打破种、属界限，把不同菌株的优良性集中到一株菌上，选育出高产、优质、易人工生产的超级生产菌。
本发明的目的是提供一种具有固定土壤中的含氮量，运用微生物的自由扩散，协助扩散，主动运输功能，改良土壤的在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的绿氮酶菌，保藏编号为0153，以及绿氮酶菌的提取方法。
本发明的主要技术方案是这样实现的保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的绿氮酶菌，保藏编号为0153。它的科学描述为绿氮酶菌，类似椭圆形细胞。
绿氮酶菌结构与功能绿氮酶菌(0153)化学结构为
构成椭圆形细胞的化合物有两大类，第一类为无机物，水(占80～90%)，无机盐(占1～1.5%);第二类为有机物，蛋白质(占7～10%)，核酸加糖类(占1～1.5%)，脂类(占1～2%)。
椭圆形细胞周围绿点类似载体(酶)起自由扩散，被选择吸收的物质从高浓度一边吸到低浓度一边;载体(酶)还起协助扩散，将自由扩散所不能吸收物质，从高浓度一边吸收到低浓度一边，在载体的协助下，细胞消耗一定能量，主动地选择吸收所需的营养物质。它可以把物质从低浓度一边吸收到高浓度一边，也可以把物质从高浓度一边吸收到低浓度一边，但是速度要比协助扩散得多。
本发明利用载体(绿色小点即酶)的主动运输功能，增加“特种”培养基(养料)。在加速载体(绿点一酶)的自身增殖的同时，又给椭圆形细胞主动运输养料，又加速椭圆形细胞分裂增殖，生成二代酶菌，由增殖后二代酶菌去发酵传统的有机肥料，去发酵农业“废弃物”和城市“垃圾”达到综合利用，减少污染，改良土壤，固定土壤中的含氮量，满足植物生产期所必需的营养成份。
本发明提取技术的方法是指绿氮酶菌(0153)菌种来源，利用荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006，和分离野生豆科植物的根瘤菌，应用重组DNA技术，优选种子培养基为葡萄糖3%，玉米浆1.5%，稀土催酶尿素0.4%，KH2PO4 0.4%，MgSO4·7H2O 0.1%，PH6.5。进行氨基酸产生菌的定向育种，把不同菌种的优良性集中到一株菌上，选育高产、优质、易人工生产的超级生产菌，它不仅可以打破种、属的界限，而且对于阐明氨基酸产生菌的遗传体系，进行了基因定位。
应用重组DNA技术提取绿氮酶菌(0153)材料和方法的实施例。
菌种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006，和分离野生豆科植物的根瘤菌。
斜面培养基和培养方法斜面培养基(g)溶菌酶(蛋壳提取)10，蛋白胨10，NaCL5，无菌水1000ml，PH6.5，将“1”的菌种移接于斜面上，30℃培养48小时。
种子培养基和培养方法原种子培养基(g)葡萄糖30，玉米浆15，稀土催酶尿素4，KH2PO44，MgSO43，无菌水1000ml。PH6.5，取一杯已活化菌苔，接入种子培养基(250ml的三角玻璃瓶装量25ml)中，30℃振荡培养48小时，以10%接种量接入发酵培养基中。
发酵培养及培养方法发酵培养基(g)葡萄糖200，酵母膏6，蔗糖400，玉米浆14，稀土催酶尿素6，MgSO4·7H2O0.5，KH2PO41，CaCO37.4，自来水2000ml，PH6.5，装入无菌缸内，进行酶促反应，温度24-26℃，培养144小时，即生育成绿氮酶菌(0153)。
绿氮酶菌(0153)分析方法用国产精密PH试纸测定PH(6.5)，液体种子吸光度测定将种液用蒸馏水稀释20倍，采用国产721型分光度计测定吸光度A690nm(0.38～0.51)。
用1200倍光学显微镜按4小时、8小时、16小时、32小时、48小时、……，分期观查，种子菌增殖情况。
培育绿氮酶菌(0153)及其培养基最优化成份配比经过L8(27)正交试验获得的。
绿氮酶菌(0153)液与有机物草炭混合时所测得的分析结果为有机质9.39%，全氮10.51%，速效氮2.80PPm，全磷0.048P2O5%，速效磷3.26PPm，速效钾6.00%。
因此应用绿氮酶菌(0153)液生产有机肥料，原料资源广泛。可实现农业“废弃物”、城市“垃圾”，及传统农家肥、草炭等“废弃物”的综合利用，减少污染。用绿氮酶菌生产的有机肥，含氮量高(40-50)，植物所必需的微量原素，含量较全，酶促功能，光合作用直接植物综合利用，具体蓄水功能，抗旱、抗灾、肥效长、改善植物品质，增加营养成份含量。
权利要求
1.一种绿氮菌提取方法的特征在于利用保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的绿氮酶菌菌株(0153)作为这样的微生物及绿氮酶菌(0153)的提取方法。
2.按权利要求1所述的绿氮酶菌提取方法，其特征在于a、菌种为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)K1006和自己分离野生豆科植物的根瘤菌;b、斜面培养基和培养方法斜面培养基(g)溶菌酶(蛋壳提取)10，蛋白胨10，NaCL5，无菌水1000ml，PH6.5，将“1”的菌种移接于斜面上，30℃培养48小时;c、种子培养基和培养方法为原种子培养基(g)葡萄糖30，玉米浆15，稀土催酶尿素4，KH2PO44，MgSO33，无菌水1000ml，PH6.5，取一杯已活化菌苔，接入种子培养基(250ml的三角玻璃瓶装量25ml)中，30℃振荡培养48小时，以10%接种量接入发酵培养基中;d、发酵培养及培养方法为发酵培养基(g)葡萄糖200，酵母膏6，蔗糖400，玉米浆14，稀土催酶尿素6，MgSO4·7H20.5，KH2PO41，CaCO37.4，自来水2000ml，PH6.5，装入无菌缸内，进行酶促反应，温度24-26℃，培养144小时，即生育成绿氮酶菌(0153)。
全文摘要
本发明属于固氮菌类，绿氮酶菌(0153)的提取方法是采用荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)K1006和分离野生豆科植物的根瘤菌作为菌种，应用重组DNA技术，优选最佳种子培养基为葡萄精3％、玉米浆1.5％、稀土催酶尿素0.4％、KH
文档编号C12N1/20GK1055388SQ9010185
公开日1991年10月16日 申请日期1990年4月6日 优先权日1990年4月6日
发明者温玉成, 刘永礼 申请人:温玉成