专利名称：一种溶菌酶的制备方法
技术领域：
本发明提供了一种以鸡蛋为原料制备溶菌酶的方法。
背景技术：
溶菌酶(lysozyme)，又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide lycanohydrlase)，是一种广泛存在于乳汁、唾液、眼泪、鸡蛋清和鱼卵中的天然酶，具有高效抑菌、杀菌、抗病毒的生物活性。它能够分解杀灭诸如葡萄球菌属、链球菌属等革兰阳性菌。可作为一种杀菌和营养添加剂，在医药、食品及生物化学领域广泛应用，市场前景广阔。由于该酶在抗病毒、杀菌消炎等药理药效方面较突出的高效性和广泛性，成为生物医药领域研究的热点。鸡蛋清中溶菌酶含量最丰富，且资源充足，成为溶菌酶生产中的首选原料。传统溶菌酶生产方法有结晶法、离子交换法、亲和层析法、色谱法等。结晶法是通过调整透析液pH值，加入磷酸盐，再调整其pH值，然后离心去除杂质得到纯化液，再使溶菌酶以结晶态析出。离子交换法是溶菌酶生产最常用的方法，其原理是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离。亲和层析法是根据酶与作用底物的特异性亲和能力，利用酶分子独有的专一性结合位点或结构性质的分离方法。传统溶菌酶生产方法中存在着生产周期长、产品收率低、生物活性低、资源利用率低、环境污染等问题，产品质量低，难以进行规模化生产和精细化运作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种溶菌酶的制备方法，以提高产品的酶活力和收率。
本发明是这样实现的，一种溶菌酶的制备方法，所述的方法的步骤是， a、预处理用流动水喷射清洗除去新鲜鸡蛋表面的杂物和污物，然后在二氧化氯含量为20-30mg/L的二氧化氯溶液中浸泡15-25分钟，浸泡后用热风吹去鸡蛋表面的水分，用打蛋机破壳并分离出蛋清和蛋黄，蛋清经灭菌后进入原料储罐； b、分离纯化在搅拌下，将原料储罐内的蛋清用蛋清重量0.8-1.2倍的水稀释，得蛋清液，用稀盐酸溶液调整蛋清液的pH值至5.0-6.5，再用板框式压滤机除去蛋清液中的沉淀物和固体杂质，然后送入均质机中均质处理15-25分钟，均质后的蛋清液用截留分子量为30000D的超滤膜进行超滤分离，分离出大分子量蛋白，获得滤过液；将滤过液送入离子交换树脂层析柱中进行层析，层析时，平衡液为pH值为5.0-6.5的改良磷酸盐缓冲液PSB，层析后进行洗脱，洗脱用液为pH值为5.0-6.5的改良磷酸盐缓冲液PSB，采用梯度洗脱方式，20分钟内，改良磷酸盐缓冲液PSB中的NaCl含量从0线性增加到0.5mol/L；对洗脱所得液进行检测，波长258nm-280nm、用10％氢氧化钠溶液及10％硫酸铜溶液与洗脱所得液混合时显色呈紫红色为合格，收集合格的洗脱所得液，将洗脱所得液用截留分子量为5000D的超滤膜过滤，获得截留浓缩液，排除透过液； c、干燥对上述截留浓缩液进行喷雾干燥，进风温度为110-120℃，出风温度65-75℃，干燥后制得成品溶菌酶。
这种制备方法，采用了离子交换树脂层析分离技术和超滤膜分离技术，所得产品的酶活力高(＞25000U/mg)，高于国内现有产品，生产周期短(3.5天)，收率高(≥3.2‰)，既可用作医药原料和生化工具酶试剂，也可作为高档生物防腐剂和食品添加剂，产品的各项指标均达到或优于国家药品标准。
具体实施例方式 下面进一步说明本发明。
所述的a步骤中的灭菌方式为巴氏消毒。
所述的b步骤中的离子交换树脂层析柱为葡聚糖凝胶离子交换树脂层析柱、724弱酸性阴离子交换树脂层析柱、D155大孔弱酸性阳离子交换树脂层析柱中的一种。葡聚糖凝胶离子交换树脂可采用CM-sephadex C-25或DEAE-sephadex A-25。
所述b步骤中的超滤膜为聚醚砜超滤膜、聚砜超滤膜、磺化聚砜超滤膜中的一种。
均质处理时，工作压力为23-25MPa。过滤时，可采用铜筛板框式压滤机。
利用本发明之方法连续进行3批次溶菌酶生产，并抽取该3批次产品样品，进行化验分析。试验数据见下表。
上表数据表明，本发明之产品的收率有了较大提高，收率≥3.2‰，而现有的溶菌酶制备方法的收率为2.1-2.2‰，各项指标均达到或优于现行的《中华人民共和国卫生部药品标准》二部第六册、生化药品第一分册中的规定。现有的制备方法生产的溶菌酶的酶活力通常在4000-6250U/mg之间，而本发明之方法制备的溶菌酶的酶活力大于25000U/mg，远高于现有产品。同时，本发明之方法的生产周期从现有制备方法的5-7天缩小到3.5天。
与现有制备方法相比，本发明还具有以下优点 1、采用层析分离和超滤膜分离技术提高分离效率，综合利用蛋清，实现生产过程中“三废”的减排。
2、创新性地采用葡聚糖凝胶离子交换树脂层析柱，一方面提高分离性能、减少离子交换介质的用量和离子交换溶液的体积，另一方面也减少废液的排放，缩短了生产周期，并降低了生产成本。
3、采用超滤膜进行超滤分离，减少了制备过程中的酶活性的损失，提高了溶菌酶活力。
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1 一种溶菌酶的制备方法，所述的方法的步骤是， a、预处理用流动水喷射清洗除去新鲜鸡蛋表面的杂物和污物，然后在二氧化氯含量为20mg/L的二氧化氯溶液中浸泡25分钟，浸泡后用热风吹去鸡蛋表面的水分，用打蛋机破壳并分离出蛋清和蛋黄，蛋清经灭菌后进入原料储罐； b、分离纯化在搅拌下，将原料储罐内的蛋清用蛋清重量0.8倍的水稀释，得蛋清液，用稀盐酸溶液调整蛋清液的pH值至6.5，再用板框式压滤机除去蛋清液中的沉淀物和固体杂质，然后送入均质机中均质处理15分钟，均质后的蛋清液用截留分子量为30000D的超滤膜进行超滤分离，分离出大分子量蛋白，获得滤过液；将滤过液送入离子交换树脂层析柱中进行层析，层析时，平衡液为pH值为6.5的改良磷酸盐缓冲液PSB，层析后进行洗脱，洗脱用液为pH值为5.0的改良磷酸盐缓冲液PSB，采用梯度洗脱方式，20分钟内，改良磷酸盐缓冲液PSB中的NaCl含量从0线性增加到0.5mol/L；对洗脱所得液进行检测，波长258nm-280nm、用10％氢氧化钠溶液及10％硫酸铜溶液与洗脱所得液混合时显色呈紫红色为合格，收集合格的洗脱所得液，将洗脱所得液用截留分子量为5000D的超滤膜过滤，获得截留浓缩液，排除透过液； c、干燥对上述截留浓缩液进行喷雾干燥，进风温度为120℃，出风温度65℃，干燥后制得成品溶菌酶。
所用的灭菌方式为巴氏消毒，所述的b步骤中的离子交换树脂层析柱为葡聚糖凝胶离子交换树脂层析柱，所述b步骤中的超滤膜为聚醚砜超滤膜。
实施例2 一种溶菌酶的制备方法，所述的方法的步骤是， a、预处理用流动水喷射清洗除去新鲜鸡蛋表面的杂物和污物，然后在二氧化氯含量为30mg/L的二氧化氯溶液中浸泡15分钟，浸泡后用热风吹去鸡蛋表面的水分，用打蛋机破壳并分离出蛋清和蛋黄，蛋清经灭菌后进入原料储罐； b、分离纯化在搅拌下，将原料储罐内的蛋清用蛋清重量1.2倍的水稀释，得蛋清液，用稀盐酸溶液调整蛋清液的pH值至5.0，再用板框式压滤机除去蛋清液中的沉淀物和固体杂质，然后送入均质机中均质处理25分钟，均质后的蛋清液用截留分子量为30000D的超滤膜进行超滤分离，分离出大分子量蛋白，获得滤过液；将滤过液送入离子交换树脂层析柱中进行层析，层析时，平衡液为pH值为5.0的改良磷酸盐缓冲液PSB，层析后进行洗脱，洗脱用液为pH值为6.5的改良磷酸盐缓冲液PSB，采用梯度洗脱方式，20分钟内，改良磷酸盐缓冲液PSB中的NaCl含量从0线性增加到0.5mol/L；对洗脱所得液进行检测，波长258nm-280nm、用10％氢氧化钠溶液及10％硫酸铜溶液与洗脱所得液混合时显色呈紫红色为合格，收集合格的洗脱所得液，将洗脱所得液用截留分子量为5000D的超滤膜过滤，获得截留浓缩液，排除透过液； c、干燥对上述截留浓缩液进行喷雾干燥，进风温度为110℃，出风温度75℃，干燥后制得成品溶菌酶。
所用的灭菌方式为巴氏消毒，所述的b步骤中的离子交换树脂层析柱为724弱酸性阴离子交换树脂层析柱，所述b步骤中的超滤膜为聚砜超滤膜。
实施例3 一种溶菌酶的制备方法，所述的方法的步骤是， a、预处理用流动水喷射清洗除去新鲜鸡蛋表面的杂物和污物，然后在二氧化氯含量为25mg/L的二氧化氯溶液中浸泡20分钟，浸泡后用热风吹去鸡蛋表面的水分，用打蛋机破壳并分离出蛋清和蛋黄，蛋清经灭菌后进入原料储罐； b、分离纯化在搅拌下，将原料储罐内的蛋清用蛋清重量1.0倍的水稀释，得蛋清液，用稀盐酸溶液调整蛋清液的pH值至6，再用板框式压滤机除去蛋清液中的沉淀物和固体杂质，然后送入均质机中均质处理20分钟，均质后的蛋清液用截留分子量为30000D的超滤膜进行超滤分离，分离出大分子量蛋白，获得滤过液；将滤过液送入离子交换树脂层析柱中进行层析，层析时，平衡液为pH值为6.0的改良磷酸盐缓冲液PSB，层析后进行洗脱，洗脱用液为pH值为6.0的改良磷酸盐缓冲液PSB，采用梯度洗脱方式，20分钟内，改良磷酸盐缓冲液PSB中的NaCl含量从0线性增加到0.5mol/L；对洗脱所得液进行检测，波长258nm-280nm、用10％氢氧化钠溶液及10％硫酸铜溶液与洗脱所得液混合时显色呈紫红色为合格，收集合格的洗脱所得液，将洗脱所得液用截留分子量为5000D的超滤膜过滤，获得截留浓缩液，排除透过液； c、干燥对上述截留浓缩液进行喷雾干燥，进风温度为115℃，出风温度70℃，干燥后制得成品溶菌酶。
所用的灭菌方式为巴氏消毒，所述的b步骤中的离子交换树脂层析柱为D155大孔弱酸性阳离子交换树脂层析柱，所述b步骤中的超滤膜为磺化聚砜超滤膜。
权利要求
1、一种溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述的方法的步骤是，
a、预处理用流动水喷射清洗除去新鲜鸡蛋表面的杂物和污物，然后在二氧化氯含量为20-30mg/L的二氧化氯溶液中浸泡15-25分钟，浸泡后用热风吹去鸡蛋表面的水分，用打蛋机破壳并分离出蛋清和蛋黄，蛋清经灭菌后进入原料储罐；
b、分离纯化在搅拌下，将原料储罐内的蛋清用蛋清重量0.8-1.2倍的水稀释，得蛋清液，用稀盐酸溶液调整蛋清液的pH值至5.0-6.5，再用板框式压滤机除去蛋清液中的沉淀物和固体杂质，然后送入均质机中均质处理15-25分钟，均质后的蛋清液用截留分子量为30000D的超滤膜进行超滤分离，分离出大分子量蛋白，获得滤过液；将滤过液送入离子交换树脂层析柱中进行层析，层析时，平衡液为pH值为5.0-6.5的改良磷酸盐缓冲液PSB，层析后进行洗脱，洗脱用液为pH值为5.0-6.5的改良磷酸盐缓冲液PSB，采用梯度洗脱方式，20分钟内，改良磷酸盐缓冲液PSB中的NaCl含量从0线性增加到0.5mol/L；对洗脱所得液进行检测，波长258nm-280nm、用10％氢氧化钠溶液及10％硫酸铜溶液与洗脱所得液混合时显色呈紫红色为合格，收集合格的洗脱所得液，将洗脱所得液用截留分子量为5000D的超滤膜过滤，获得截留浓缩液，排除透过液；
c、干燥对上述截留浓缩液进行喷雾干燥，进风温度为110-120℃，出风温度65-75℃，干燥后制得成品溶菌酶。
2、如权利要求1所述的溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述的a步骤中的灭菌方式为巴氏消毒。
3、根据权利要求1所述的溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述的b步骤中的离子交换树脂层析柱为葡聚糖凝胶离子交换树脂层析柱、724弱酸性阴离子交换树脂层析柱、D155大孔弱酸性阳离子交换树脂层析柱中的一种。
4、根据权利要求1所述的溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述b步骤中的超滤膜为聚醚砜超滤膜、聚砜超滤膜、磺化聚砜超滤膜中的一种。
全文摘要
本发明提供了一种溶菌酶的制备方法，所述的方法的步骤包括，a.预处理分离出蛋清和蛋黄，蛋清经灭菌后进入原料储罐；b.分离纯化均质后的蛋清液用截留分子量为30000D的超滤膜进行超滤分离，获得滤过液；将滤过液送入离子交换树脂层析柱中进行层析，层析后进行洗脱，收集合格的洗脱所得液，将洗脱所得液用截留分子量为5000D的超滤膜过滤，获得截留浓缩液；c.干燥对上述截留浓缩液进行喷雾干燥，干燥后制得成品溶菌酶。这种制备方法所得产品的酶活力高，高于国内现有产品，生产周期短，收率高，既可用作医药原料和生化工具酶试剂，也可作为高档生物防腐剂和食品添加剂，产品的各项指标均达到或优于国家药品标准。
文档编号C12N9/36GK101603038SQ20091001681
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月10日 优先权日2009年7月10日
发明者王克柳, 王美海, 杨红霞, 王立军, 颜丙辉 申请人:山东鲁北药业有限公司