专利名称：一种蛋白溶菌酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备蛋白溶菌酶的方法及其在食品制造工业和医药工业中的应用。
根据离子交换色谱原理制备溶菌酶的方法已经公知，其中均匀化后的蛋白穿过带有阴离子弱酸羧基树脂的离子交换柱而后由盐溶液提取，以吸取于树脂上的酶，并得出的提洗物经过过滤并进行多次重结晶以纯化不纯物(5)。
已知方法的缺点如下-在吸取期间蛋白和阳离子树脂之间以及树脂上吸取的酶跟提洗过程中盐溶液之间，不能达到紧密接触;
-溶菌酶产量低-在原材料中蛋白含量为4.0和5.0克时，1升蛋白产约2.5克。
-原材料和其它材料的损耗相对地较大-生产1公斤溶菌酶损耗的蛋白为60公斤，阴离子树脂为0.6公斤。
-生产过程时间长，每星期仅能实现四个生产周期。
另一制备溶菌的方法也已公知，其法为将均匀化后的蛋白(预先将pH值较正到6.5-7.0范围之内)连同羧基粗孔阳离子树脂混合后连续搅拌。之后吸附在树脂上的酶以3.0%的氯化钠水溶液进行提洗，该氯化钠溶液不断地加入氢氧化钠以使最佳pH值保持在所述范围之内。为了分离出酶，将所得提洗物进行过滤(2)。
此一公知方法的缺点如下
-吸取期间在蛋白中必需有pH校正剂(盐酸)且在解吸期间，在提洗剂中必需有氢氧化钠;
-此方法的时间过长-酶的吸取要50分钟;提洗需要25分钟。
本发明的任务是创造一种方法以高产量获得高纯度溶菌酶，此方法实现时，蛋白和离子交换树脂之间的紧密接触最佳吸取时间过程缩短，毋需引用另外的pH校正剂，蛋白和树脂的损耗最小。
本发明制备蛋白溶菌酶的方法是使其吸附在弱酸粗孔树脂上，而后用氯化钠溶液提洗酶，经过过滤、干燥得出精酶，其中弱酸粗孔羧基阳离子树脂上吸取均匀化蛋白是在天然pH值9.0到11.0范围，以40-50转/分的速率连续搅拌60分钟进行的。提洗后所制得的酶溶液进行热处理。
所用弱酸粗孔羧基树脂可以是Wofafit Ca-20。
在氯化钠溶液提洗后，制得的酶溶液热处理之前，将pH值降低到3.5，该溶液经不断搅拌加热到60℃计30分钟。
根据本发明的方法，天然pH值在9.0至11.0范围的均匀化蛋白被加入到改性树脂中并在60分钟期间以40-50转/分的速率进行搅拌。蛋白经过烘干且树脂以去离子水清洗三遍。树脂上吸取酶的提洗液用的是3.5%氯化钠溶液并不断搅拌20分钟。所得酶溶液酸化到pH值3.5，并在不断搅拌下，于60℃加热30分钟。不纯的酶溶液则加以冷却、通过微过滤澄清、通过超滤浓缩并透析(diaphilated)以除去盐份。所得浓缩物经喷雾干燥或冷冻进进行干燥。
本发明的方法，其优点如下在蛋白和离子交换树脂之间实现了紧密的最佳接触，缩短了加工时间，在不加入PH校正剂的情况下避免了酶蛋白结晶和纯化的各耗时阶段;
由于对酶溶液的热处理，蛋白和树脂的损耗最小，以高产量制得了高纯度3.5克/立升蛋白溶菌酶;
萃取出溶菌酶后所得的蛋白具有持久的物理化学性质、有机体敏感性质和工艺加工性能，适合于继续制造蛋白粉。
本发明的方法可以用下列实施例予以说明。
以11∶3的比例将水加入3立升弱酸粗孔羧基阳离子树脂Wafatif CA-20，通过在不断搅拌下，加入5%氯化钠溶液使该树脂-水悬浮液pH达到8.0-8.5。接着以水清洗直到产生负碱性反应。
天然pH值9.0-11.0的均匀化蛋白10升被加入到改性树脂中，用时60分钟，并以40-50转/分速率搅拌。而后该系统静置5分钟以使多余树脂沉淀。这样得出9.9升蛋白上清液经过烘干。离子交换树脂用水清洗三次。吸取在树脂上的酶的洗脱是加入比例为1∶2的3.5%氯化钠溶液并不断搅拌20分钟进行的。烘干后的提洗物使用标准盐酸酸化到pH3.5并加热到60℃30分钟且不断搅拌。所得粗的呈乳白色的提洗物进行冷却，经过微过滤加以澄清，接着再超滤及透析过滤，而后使用冷冻干燥方法或喷雾方法使之干燥。
用10立升经过处理的蛋白，从1立升原材料中制得平均产量为3.6克的溶菌酶。
按照方法(2)，从1升蛋白中制得2.9克溶菌酶。按照方法(1)，1升蛋白所得溶菌酶平均产量为2.5克。
所制溶菌酶的特征有如下表
1.酶活性 -以糖计为25，000E2.水含量 -最多6%(105℃ 2小时)3.总含氮量 -16-17%4.氯化物 -最多3.5%5.重金属 -最多10ppm6.细菌污染 -最多100/克
权利要求
1.一种制造蛋白溶菌酶的方法，该方法是通过弱酸粗孔羧基阳离子树脂吸取蛋白溶菌酶，使用氯化钠洗提该酶溶液，然后过滤和干燥浓缩物，其特征在于用弱酸粗孔羧酸阴离子树脂上吸取天然PH值9.0～11.0。均匀化蛋白，条件是不断以40-50转/分钟的速率搅拌60分钟，提洗后所得酶溶液进行热处理。
2.根据权利要求1制造溶菌酶的方法，其中弱酸粗孔羧基阳离子树脂是Wofatif CA-20。
3.根据权利要求1和2制造溶菌酶的方法，其特征在于酶溶液的pH值降低到3.5，而后在不断搅拌下于60℃热处理30分钟，冷却后进行微过滤。
全文摘要
按照本发明的方法，将天然pH值为9.0至11.0均匀化的蛋白用弱酸粗孔阳离子树脂WofatifCA-20吸取。在不断搅拌下，用3.5％的氯化钠溶液洗提吸附的酶。所得酶溶液经过酸化、加热、而后冷却并经微过滤澄清、经超滤和透析浓缩。浓缩物通过喷洒或冷冻加以干燥。
文档编号C12N9/50GK1059559SQ9010751
公开日1992年3月18日 申请日期1990年9月6日 优先权日1990年9月6日
发明者哈里斯·马里诺·阿那多夫, 皮卡·尼克洛娃·库克娃, 米考·希米诺夫·金吉夫, 克里斯多·达雅克夫·哈里斯夫, 斯托亚·斯拉夫·斯托亚夫 申请人:阿万吉德公司