专利名称：一种生产药用重组人溶菌酶的方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种药用蛋白质的制备方法，具体的说是涉 及以马铃薯为生物反应器生产人溶菌酶蛋白的方法。
背景技术：
溶菌酶(lysozyme)学名N-乙酰己糖胺酶，属于胞壁质酶。溶菌酶广泛存在于自 然界的各种微生物、原生动物、人和动植物组织中。但不同来源的溶菌酶其抗菌谱也不尽 相同。溶菌酶在临床上具有很高的实用价值，它可与血液中的病菌和病毒结合，具有抗菌、 抗病毒止血、消肿、加快组织恢复等作用。临床上可用于慢性鼻炎、急性慢性咽喉炎、口腔溃 疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等的治疗。溶菌酶还是人体内的非特异免疫因子，可提高肌体 免疫力。近年来，有关溶菌酶抗肿瘤、抗艾滋病毒的药理研究也表明，溶菌酶可作为一种较 强的免疫调节因子用于预防和治疗恶性肿瘤，以及作为一种有效的抗HIV物质用于艾滋病 的治疗。但是目前人溶菌酶只要从人奶和胎盘组织中提取，不仅来源有限，而且提取复杂， 产量低，还容易受到人疾病的病原菌污染，所以至今仍主要用于科学研究，无法工业化生产 供应临床应用。另外从鸡蛋中提取的鸡溶菌酶，产量高，来源容易，但由于异种蛋白有较强 的过敏反应，不适合用于人体，目前仅限于用做化妆品使用。通过基因工程的技术手段，利用植物作为生物反应器，大规模生产外源药用蛋白 具有自身的优势。现有研究表明植物生物反应器生产的外源蛋白产量高，能达到可溶性蛋 白的4-5%;生产过程简单、快速、灵活、成本低；对生产的材料收获、储存、运输方便，无需特 殊管理和监控；植物生物反应器生产的外源蛋白能进行正确的转录、翻译和加工，保证了蛋 白的功能不受影响；一些植物材料可以直接食用，便于外源蛋白的有效利用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，利用植物生物反应器的优势，提供了一种以马铃薯 为生物反应器大规模生产人溶菌酶的方法。本发明通过以下技术方案实现1.获取人溶菌酶基因从人白细胞中提取RNA，反转录为cDNA，经PCR反应扩增出 人溶菌酶基因。2.构建植物表达载体利用PBI121植物表达载体，构建含有人溶菌酶基因的植物 表达载体(图1)。3.转化马铃薯通过根癌农杆菌介导的方法将含有人溶菌酶基因的植物表达载 体导入马铃薯中，得到表达人溶菌酶蛋白的转基因马铃薯植株。本发明所构建的人溶菌酶基因植物表达载体中，人溶菌酶基因在植物组成型启动 子CaMV 35S启动子下游，同时包含了来自于细菌的NPTII抗性基因，能赋予转基因植株卡 那霉素抗性。
图1.人溶菌酶基因hLY植物表达载体图2马铃薯表达人溶菌酶hLY蛋白SDS-PAGE电泳结果及wenstern杂交结果
具体实施例方式实施例1分离人溶菌酶基因从人外周白细胞中提取细胞总RNA，进行RT-PCR反应。根据GenBank公开的溶菌 酶基因序列(HSU25677)设计特异性引物引物 1 :5，-GCGGATCCATGAAGGCTCTCATTGTTCT-3‘引物 2 5，-GCGAGCTCGCTTACACTCCACAACCTTGA-3，经94°C 4min 变性，25 个循环 94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin30sec, 72°C 7min 延伸；PCR扩增得到人溶菌酶成熟蛋白的cDNA片段，PCR扩增片段与pGEM_T载体连接并转 化大肠杆菌(ToplO)，酶切验证为阳性的pGEM-hLY克隆送样测序，经测序分离的hLY偏单序 列与公布的人溶菌酶基因序列一致。实施例2人溶菌酶基因植物表达载体的构建用BamHI/&icI双酶切pBI121和pGEM_hLY质粒，分别电泳回收酶切的pBI121载 体和hLY外源片段，通过T4DNA连接酶将人溶菌酶基因hLY连入pBI121载体中，得到人溶 菌酶的植物表达载体pBI-hLY。实施例3pBI_hLY质粒转入农杆菌采用冻融法转化农杆菌，取5μ 1 pBI-hLY质粒加入到200μ 1 LBA4404农杆菌感 受态细胞中，冰浴30min，液氮速冻5min，37°C融化5min。加入Iml YEB培养基200rpm 振荡培养2-池，收集菌体涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和链霉素(125mg/L)的YEB平板， 280C暗培养2-3天。挑取单菌落，液体培养后小量制备质粒，酶切验证，确定pBI-hLY质粒 已经转入农杆菌中。实施例4农杆菌介导人溶菌酶基因hLY转化马铃薯选取健壮马铃薯无菌苗，超净工作台上将叶片切成约0. 5cmX0. 5cm的叶盘，茎切 为0. 5cm的茎段，保持湿润备用。牙签挑取YEB平板上培养的转化用农杆菌单菌落，液体培 养活化，再转入三角瓶中培养至OD6tltl = 0. 5。将切好的叶盘和茎段浸泡于MS液体基本培养 基重悬的农杆菌菌液中，轻轻振荡侵染5min-30min。倾去菌液，用无菌的吸水纸吸去叶盘表 面多余的菌液，将叶盘接入表面铺有一层滤纸的共培养基MSB1上，24°C暗培养2d。共培养完成后，将叶盘接入筛选培养基MS&中进行分化培养，培养条件为25V、 16hr光照/8hr黑暗的光周期。每2_3w继代一次。出现再生绿芽后，将2cm左右幼芽切下转入生根培养基MS 中生根。当抗性苗的根生长到2-3cm长时，洗净根部的琼脂，水培炼苗2_3d，移栽到营养 钵，于温室生长。植物培养基配方为共培养基MSB1 :MS+玉米素 Zt 4. 78mg/L+IAA 0. 01mg/L+GA30. ang/L+蔗糖 20g/L+ 琼脂 7g/L，pH 5. 7。
筛选培养MS& =MS+ 玉米素 Zt 4. 78mg/L+IAA 0. 01mg/L+GA30. 2mg/L+ 卡那霉素 Km 50g/L+ 头孢青霉素 Cef 100g/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 7g/L，pH 5. 7。生根培养基MS =MS+卡那霉素Km 50g/L+头孢青霉素Cef 100g/L+蔗糖30g/L+ 琼脂 8g/L，pH 5.8。实施例4转基因马铃薯表达hLY蛋白的检测1.从马铃薯叶片中提取表达的人溶菌酶蛋白称取马铃薯叶片0. Ig,加研磨缓冲液(IOmM Tris-Cl,0. 02NaN，0. 001 % PMSF， ρΗ8. 0)200μ 1，冰浴中研磨成勻浆，5000rpm室温下离心lOmin，收集上清。上清经SDS-PAGE 电泳检测(分离胶浓度8%，考马斯亮蓝R-250染色，甲醇-乙醇脱色，结果表明所提蛋白大 小在44KD左右，确认为目的蛋白。2. Western 杂交分析将电泳凝胶经电转移至NC膜上，做好标记并洗脱、封闭。将NC膜转入杂交袋，加 入测试抗体(兔抗人溶菌酶抗血清，由第三军医大学免疫学教研室赠送)10ml，封口，37°C 振荡结合1. ，用PBST冲洗4-5次，加入1 800稀释的兔抗羊IgG(二抗)，室温轻摇孵 育Ih,用PBST冲洗3-4次，每次IOmin0将NC膜转入底物溶液，室温避光轻摇5-lOmin，观察显色情况，等出现条带时，立 即转入PBST缓冲液终止反应。结果证实重组人溶菌酶基因确实在马铃薯中得到了表达。
权利要求
1.一种植物表达载体，其特征在于该表达载体包含人溶菌酶基因。
2.一种以马铃薯为生物反应器生产重组人溶菌酶的方法，其特征在于将权利要求1 所述的植物表达载体导入马铃薯中，使其编码产生重组人溶菌酶蛋白。
3.—种重组人溶菌酶蛋白，其特征在于通过权利要求2的方法获得。
4.一种用权利要求2所述方法获得的重组人溶菌酶蛋白的用途，该蛋白作为制备治疗 细菌、病毒引起的疾病的药物的应用。
全文摘要
本发明提供了一种以马铃薯为生物反应器生产人溶菌酶的方法。本发明将人溶菌酶基因构建到植物表达载体中，并通过根癌农杆菌导入马铃薯中，实现了重组人溶菌酶基因在马铃薯中的高效表达，得到了一种含有重组人溶菌酶蛋白的功能马铃薯。用这种方法可大量生产重组人溶菌酶，用于细菌和病毒引起的疾病治疗。
文档编号G01N33/573GK102086460SQ200910216488
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月2日 优先权日2009年12月2日
发明者黄晓川 申请人:黄晓川