专利名称：一种溶菌酶检测试剂及其制备方法
技术领域：
本发明属生物化学分析领域，具体涉及一种溶菌酶检测试剂及其制备方法背景技术溶菌酶分析通常用于各种体液的检测。其意义是通过体液中溶菌酶的测定、分析，对疾病的变化、严重程度进行判断。根据Pesce A.J.和Kaplan L.A.主编的权威著作《Methods in Clinical Chemistry》(林其燧 文庆成主校译)，目前用于临床溶菌酶分析的方法的主要是平板法和比浊法。其中平板法进行试剂标准化比较困难，操作繁琐，需要经过特定的培训才能掌握，而且试验结果易受操作者主观误差的影响；比浊法全部为手工操作，手工比浊法所用菌悬液静置后菌体将下沉，因而在操作中必须不断摇动菌悬液，以保持每个测试时所吸取菌悬液浓度的一致性，增加了操作的难度，并且所得试剂稳定性不好。难以适应现代医学批量标本的检测要求和自动化分析的发展趋势，并且其灵敏度较低。
综上所述，目前临床医学检验迫切需要一种具有稳定性能的溶菌酶检测试剂，并且能方便的用于自动化分析检测的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种性能稳定的溶菌酶检测试剂，本试剂能用于全自动生化分析，实现溶菌酶活性的批量、自动化检测。
本发明的另一目的是提供所述检测试剂的制备方法。
本发明溶菌酶检测试剂含有灭活微球菌和明胶。本发明检测试剂采用新的灭活微球菌的方法，同时利用明胶作为分散菌体的介质和稳定剂，制备高度稳定的菌悬液作为溶菌酶检测试剂。本发明经过4小时以上长时间的静置，吸取的菌悬液的吸光度无明显改变，表明所得试剂具有很好的稳定性，可用于各种检测需要，使得用于自动生化分析仪成为可能。
本发明溶菌酶检测试剂通过下述方法和步骤制备，1、采用常规培养方法营养琼脂培养微球菌48～72小时，2、在无菌条件下，用生理盐水洗下菌苔，3、用活性氯进行灭活，浓度为1000～3000ppm，时间为15～30分钟，4、将灭活后的微球菌用纱布进行过滤，去除混入的琼脂碎块；用生理盐水洗涤菌体，然后用0.125～0.0625mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液洗涤，5、用含1.3～1.7‰明胶、1‰叠氮钠的磷酸盐缓冲液进行悬浮，并用相同缓冲液调整菌悬液为1cm光径、650nm波长吸光度约为1.5A，得应用菌悬液。置于4℃保存，即得本发明溶菌酶测试试剂。
所制备的试剂可供各类带试剂冷藏槽的自动生化分析仪应用，用于测试各种体液中的溶菌酶活性。本发明所能达到的最低检测限为0.5μg/ml，完全可以满足临床体液标本测试的要求。
本发明涉及的微球菌购自中科院微生物所菌种库。
所涉及的溶菌酶标准品比活性为20000u/mg蛋白(华美生物工程公司)，将此溶菌酶用含30％甘油的0.9％NaCl溶液配成浓度为1mg/ml的酶溶液，作为标准品工作液，分装后置于-40℃冰箱中保存备用。
所涉及的其它化学试剂均为AR以上纯级，购自上海化学试剂商店。
所涉及的生化分析仪为HITACHI 7060型全自动生化分析仪，(日本)。
图1 线性范围图。
图2 胸水标本测试数据分布示意图。
具体实施例方式
实施例1 制备溶菌酶测试试剂1、采用常规培养方法营养琼脂培养微球菌48小时，2、在无菌条件下，用生理盐水洗下菌苔，3、用活性氯进行灭活，浓度为1000ppm，时间为30分钟，4、将灭活后的微球菌用纱布进行过滤，去除混入的琼脂碎块；用生理盐水洗涤菌体，然后用0.125mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液洗涤，5、用含1.3‰明胶、1‰叠氮钠的磷酸盐缓冲液进行悬浮，并用相同缓冲液调整菌悬液为1cm光径、650nm波长吸光度约为1.5A，得应用菌悬液。置于4℃保存，即得本发明溶菌酶测试试剂。
实施例2 制备溶菌酶测试试剂采用常规培养方法营养琼脂培养微球菌72小时，在无菌条件下，用生理盐水洗下菌苔，用浓度为2000ppm活性氯进行灭活15分钟，将灭活后的微球菌纱布过滤，去除混入的琼脂碎块；用生理盐水洗涤菌体，然后用0.0625mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液洗涤，用含1.5‰明胶、1‰叠氮钠的磷酸盐缓冲液进行悬浮，并用相同缓冲液调整菌悬液为1cm光径、650nm波长吸光度约为1.5A，得应用菌悬液。置于4℃保存，即得本发明溶菌酶测试试剂。
实施例3 临床检验取成人体检血清标本50例；胸水标本共44例。癌性胸水为21例，均经细胞学检查证实，其中19例为肺腺癌，1例疑为腺癌，1例为乳腺癌术后；结核性胸水23例。标本采集后，置-40℃冻存。检测时，置室温下令复融，颠倒混匀，离心取上清备检。
利用HITACHI 7060全自动生化分析仪建立溶菌酶活性的自动分析法。方法终点法；波长340/623nm；试剂量250μl；样品量30μl；测量点31点。将溶菌酶标准品配制成15.6μg/ml的溶液作为定标液，作5点定标。
将所用溶菌酶标准品在0.1μg/ml-50μg/ml之间作15个阶度稀释，作为样品上机测试，得到反应曲线。显示，上限直至50μg/ml仍保持满意的线性，可满足临床标本的测试需要。下限自0.6μg/ml以下不能有效测定(读数紊乱)；取生理盐水作为“0”标本，测试5次，计算X+3SD＝0.28+3×0.084＝0.532μg/ml，作为检测下限，所建立的检测系统的最低检测限为0.6μg/ml，检测上限至少可达50μg/ml。
用含20％混合人血清的生理盐水，添加溶菌酶标准品，配制成高、中、低三种溶菌酶浓度的样品，分装，-40℃冻存，作为重复性试验的样品。
取上述高、中、低三种浓度的样品上机连续测定，分别计算批内变异系数为1.7％，1.3％，和3.1％，天间变异系数分别为3.9％，4.7％，和8.7％。
采用2种方法进行回收试验，即不同胸水标本中添加相同量的LZM标准品和同一个胸水标本中添加不同量的LZM标准品，按公式回收率＝(回收量/加入量)×100％，计算回收率为90.4％～101.3％临床标本测试结果显示，其中50例血清标本浓度分布范围为3.1~8.8μg/ml，X±SD＝4.71±0.92(μg/ml)，44例胸水标本，其中结核性胸水23例，癌性胸水21例。
以肺癌组胸水LZM测定值X+2SD作为cut off值X+2SD＝3.94+0.93×2＝5.8μg/ml，则结核组有21例高于此值，敏感性为91.3％，癌性组仅有1例高于此值，特异性为95.2％。
上述两组资料经X2检验，P＜0.001，表明结核组与肺癌组胸水LZM活性有极显著差异，结核组胸水LZM活性高于肺癌组。
权利要求
1.一种溶菌酶检测试剂，其特征在于含有灭活微球菌和明胶，其中明胶作为分散菌体的介质和稳定剂。
2.按权利要求1所述的溶菌酶检测试剂的制备方法，其特征在于通过以下步骤制备，①采用营养琼脂培养微球菌48～72小时，②在无菌状态下，用生理盐水冲洗菌苔，③用活性氯灭活，时间为15～30分钟，④将灭活后的微球菌纱布过滤，去除混入的琼脂碎块；用生理盐水洗涤菌体后，用0.125～0.0625mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液洗涤，⑤用含1.3～1.7‰明胶、1‰叠氮钠的磷酸盐缓冲液悬浮，相同缓冲液调整菌悬液为1cm光径、650nm波长吸光度约为1.5A，得应用菌悬液，4℃保存。
3.按权利要求1或2所述的溶菌酶检测试剂，其特征在于所述灭活微球菌的活性氯浓度为1000～3000ppm。
4.按权利要求1或2所述的溶菌酶检测试剂，其特征在于所述试剂菌悬液含明胶1.5‰。
5.按权利要求2所述的溶菌酶检测试剂，其特征在于步骤④所述磷酸盐缓冲液洗涤液为0.0625mol/L pH6.0。
全文摘要
本发明属生物化学分析领域，具体涉及一种溶菌酶检测试剂及其制备方法。本发明溶菌酶检测试剂含有灭活微球菌和明胶。本发明检测试剂采用新的灭活微球菌的方法，同时利用明胶作为分散菌体的介质和稳定剂，制备高度稳定的菌悬液作为溶菌酶检测试剂。本发明经过4小时以上长时间的静置，吸取的菌悬液的吸光度无明显改变，表明所得试剂具有很好的稳定性，可用于各种检测需要，能用于全自动生化分析，实现溶菌酶活性的批量、自动化检测。
文档编号C12Q1/00GK1587994SQ20041005380
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月16日 优先权日2004年8月16日
发明者于方治, 吴京 申请人:上海市胸科医院