专利名称：溶菌酶生产方法
技术领域：
本发明是涉及溶菌酶的生产方法，对现有技术的改进。溶菌酶是专门溶解细菌的酶类。目前，溶菌酶的制备采用鸡蛋清为原料，在生产过程中采用盐析法或酒精沉淀除去蛋白，或用树脂层析纯化技术。因此，增加了脱盐工序及在洗脱过程中将蛋清大量稀释，使干燥时耗费能源。
本发明以柞蚕蛹为原料，蚕蛹经人工诱导提高溶菌酶的活力;加热除蛋白，DEAE-纤维素层析分离，甲壳质包裹的纤维素层析纯化，真空干燥而成。溶菌酶得率高，工艺简单，成本低廉，纤维素层析可半自动化调控，纤维素可再生使用。柞蚕蛹除提取溶菌酶外，还可生产大量有经济价值的产品，如蛹油、蛹蛋白等，其工艺互相衔接。
生产流程如框
图1生产流程的实施一、柞蚕蛹的收集用活蛹缫丝后的蚕蛹，剔除死、破蛹体后供用;削茧蛹应保持蛹体完好，受伤或损破者弃去。
二、人工诱导诱导方法有三种。
1、注射大肠杆菌菌种分别为E.coli K12D31或HB101，剂量为108菌/ml，每蛹注射50μl，注射后在25℃放置72小时以上供用。
2、热空气诱导将活蛹置50℃～55℃热空气箱中处理30～60分钟，处理后在25℃放置48～72小时供用。
3、超声波诱导将活蛹浸入流水中，用超声波发生器处理，频率20仟赫兹，功率150瓦，时间5-10分钟。处理后在25℃放置72～96小时供用。
三、收集蛹血用刺辊将蛹体刺破，投入篮式离心机中，3000转/分离心，收集蛹血，残余蛹体供综合利用。
四、蛹血除蛋白加入苯基硫脲0.02%～0.05%，水浴中快速拌搅加热至60℃，并速冷至室温，离心除去蛋白沉淀，收集清液即溶菌酶组分。剩余的蛹血残渣供综合利用。
五、调整pH溶菌酶组分加入等体积0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后进行柱层析。
六、DEAE-纤维素柱层析DEAE-纤维素离子交换层析，按常规活化，装柱。柱直径与高比例为1∶10～12，柱内先用碱性缓冲液使柱内充分饱和，可选用0.1M，pH8.0磷酸盐，将上述溶菌酶组分注入柱内作离子交换，控制流速2ml/cm2·分钟，用0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液洗脱溶菌酶组分。DEAE-纤维素柱回收蛹血蛋白后再生供用。
七、甲壳质包裹纤维素柱层析甲壳质包裹纤维素活化后装柱，先用0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液将柱内充分饱和后，再用无离子水洗至微碱性，将DEAE-纤维素柱层析后洗脱的溶菌酶组分注入甲壳质包裹纤维素柱内作亲和层析，控制流速2ml/cm2·分钟，待充分亲和吸附后，用0.1M，pH2～2.5乙酸缓冲液洗脱溶菌酶组分，甲壳质包裹纤维素再生供用。
八、真空浓缩、透析及干燥收集溶菌酶组分，在60℃600mmHg下用真空薄膜浓缩器浓缩到粘稠状，移入透析袋中，在4℃下流水透析除去盐分，内容物在60℃600mmHg下真空干燥，即为溶菌酶制品。
实例一活柞蚕蛹1kg作原料，将大肠杆菌K12D31接种于液体LB培养基(蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，加水至1升，pH7.2)中，37℃振荡培养过液，达到108菌/ml的水平，每蛹注射50μl，放置于25℃72小时。
蚕蛹穿刺后离心取蛹血，篮式离心机3000转/分钟，离心10分钟，收集蛹血约150ml。加入0.02%苯基硫脲，在水浴中搅拌加热至60℃，速冷至室温，离心3000转/分钟。10分钟以除去蛋白，清液为溶菌酶组分。
溶菌酶组分中加入等体积0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液，用DEAE-纤维素柱层析，收集流出的溶菌酶组分，约250ml，用甲壳质包裹纤维素作亲和层析，柱内用0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液饱和。吸附层析后，用0.1M，pH2.0～2.5乙酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱的溶菌酶组分，约150ml。
将溶菌酶组分在60℃600mmHg真空浓缩至粘稠状，用半透膜透析去盐，内容物在60℃，600mmHg下抽干，即为成品，约100mg，酶活力达到20000单位/mg蛋白水平。
实例二活柞蚕蛹1kg作原料，将蚕蛹置52℃烘箱内处理30分钟，置25℃48小时。
蚕蛹穿刺后离心取蛹血，收集蛹血约150ml，加入0.02%苯基硫脲，在水溶中搅拌加热至60℃，速冷至室温，离心3000转/分，10分钟以除去蛋白，清液为溶菌酶组分。
溶菌酶组分中加入等体积0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液，用DEAE-纤维素离子交换柱层析，收集流出的溶菌酶组分，约250ml。
市售甲壳质50g，用40%NaOH液充分浸泡，捣碎，37℃浸渍3小时，用水冲洗，抽滤以除去余碱，使转化为去乙酰甲壳质。在碱性(pH10)条件下，加入100g纤维素，充分拌搅，然后用冰乙酸调至酸性，使甲壳质沉淀，水洗去余酸，用0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液浸泡，装柱后将DEAE-纤维素洗脱的溶菌酶组分注入其中进行亲和层析，最后用0.1MpH2～2.5乙酸盐缓冲液洗脱溶菌酶组分，约收集150ml。
将溶菌酶组分在60℃600mmHg真空浓缩至粘稠状，用半透膜透析去盐，内容物在60℃600mmHg下抽干，即为成品，约得85mg，酶活力达到18000单位/mg，蛋白水平。
参考文献1、Emel′yanenko，P.A.，Stayukova，L.G.，1983，Extractionoflysozymefromcolostrum.USSRpatent，SU1041937A1，CA，99(25)208831y.
2、EisaiCoLtd，1986，Productionoflysozyme.Japanpatent，JP83201986A2，CA，100(15)117182k.
3、Hasegawa，Mineo，Ozaki，Kitao，1983，Apparatusforcollectinglysozymefromeggwhitebyabsorption.SouthAfricapatentZA8208806A，CA，100(15)117181j.
权利要求
1.溶菌酶的生产方法其特征在于以削茧后完好的蚕蛹为原料，于蚕蛹中注射大肠杆菌E·ColiK12D31或HB101，剂量为108菌/ml，50μl/头，在25℃下放置72小时以上，或将蚕蛹置50～55℃热空气箱内30～60分钟，在25℃下放置48～72小时，或将蚕蛹浸入流水中，用频率20～22仟赫兹，功率150瓦超声波处理5～10分钟，于25℃放置72-96小时，将人工诱导后的蚕蛹刺破收集蛹血，蛹血中加入0.02～0.05%苯基硫脲，在水浴中快速搅拌加热至60℃，速冷至室温，离心除蛋白，上清液即溶菌酶组分，用0.1M磷酸盐调整至pH8.0，将溶菌酶组分注入经用碱性溶液充分饱和后的DEAF-纤维素柱内作层析分离，离子交换完成后，用0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液洗脱溶菌酶组分并注入经用0.1M，pH8.0磷酸盐缓冲液充分饱和后，再用无离子水洗至微碱性(pH7.2)的甲壳质包裹纤维素柱内作亲和层析，用0.1M，pH2～2.5乙酸盐缓冲液洗脱溶菌酶组分，洗脱后的溶菌酶组分真空浓缩、干燥。
2.根据权利要求1所说的溶菌酶生产方法，其特征在于所说的DEAE-纤维素柱，其园柱直径与高度比例为1∶10～12，溶菌酶组分在园柱内流速为2ml/cm2·分钟。
3.根据权利要求1和2所说的溶菌酶生产方法，其特征在于所说的溶菌酶浓缩条件，在60℃600mmHg下用真空薄膜浓缩器浓缩至粘稠状，移入透析袋中，在4℃下用流水透析除去盐分，内容物在60℃600mmHg真空干燥。
全文摘要
一种以柞蚕蛹为原料生产溶菌酶的生产方法。柞蚕蛹含有丰富的溶菌酶，经人工诱导后提高酶活力10倍以上。收集蛹血、加热、直接用DEAE—纤维素及甲壳质包裹纤维素柱层析，洗脱后真空浓缩，透析，真空干燥而得到产品，酶的回收率高。有关纤维素可再生使用，本方法的工艺可与蚕蛹综合利用的其他工艺(如提取蛹蛋白等)相衔接。
文档编号C12N9/00GK1043740SQ8910880
公开日1990年7月11日 申请日期1989年11月22日 优先权日1989年11月22日
发明者黄自然, 陈夙珍, 姚汝华, 吕建秋 申请人:华南农业大学