专利名称：一种生产基因工程重组人溶菌酶的方法
技术领域：
本发明属于分子生物制药技术领域，是一种用基因工程重组法生产人溶菌酶的方法。
目前，人溶菌酶主要从人奶和胎盘组织中提取获得，其来源有限，提取复杂，产量很低，易受人疾病的病源菌污染，所以主要用于科学研究使用，无法供临床应用。另外从鸡蛋中提取的鸡溶菌酶，产量高，来源容易，但由于异种蛋白有较强的过敏反应，不适合用于人体，只限于做化装品使用。
本发明的目的是要提供一种能够较大批量生产纯净人溶菌酶的方法。
本发明的解决方法是运用分子生物学技术和基因工程技术，将人溶菌酶基因克隆入酵母菌体内进行表达，然后通过提取、纯化制出人溶菌酶。
具体由以下步骤完成一、获取人溶菌酶基因从人白细胞中提取RNA，经逆转录为cDNA后，进行多聚链式反应(PCR)扩增出人溶菌酶基因。
二、表达系统用真核表达载体pPIC9K与毕赤酵母宿主菌SMD1168(his4,pep4)进行人溶菌酶表达。
三、提取人溶菌酶。
本发明由于利用基因工程重组技术，发酵生产人溶菌酶，能够较大批量生产人溶菌酶，又避免了从组织中提取易受病源污染的问题，其产品具有稳定、纯净的特点。
下面的实施例，附图
可以使本专业技术人员更全面地理解本发明。
实施例一、获取人溶菌酶基因从人外围白细胞中提取细胞总RNA，根据溶菌酶基因序列合成引物，用下游引物P2、异性引物(P1P2)进行聚合酶链式反应PCR,PCR产物与pGEM-T载体在T4DNA连接酶作用下进行连接并转化大肠杆菌(Top10)感受细胞，铺在加氨苄青酶素的LB平板上，37℃生长过夜。挑取4个克隆分别接种于含有氨苄青酶素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜。收集菌体，按照常规方法小量抽提质粒，经过酶切鉴定确定阳性克隆。用双脱氧链终止法进行核甘酸序列分析，结果与发表的人溶菌序列完全一致。用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-hIy质粒，胶回收hIy基因片段。用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切pPIC9K表达载体，胶回收pPIC9K线性化质粒DNA。hIy基因片段与pPIC9K线性化质粒DNA，在T4DNA连接酶作用下进行连接并转化大肠杆菌(Top10)感受细胞，铺在加氨苄青酶素的LB平板上，37℃生长过夜。挑取4个克隆分别接种于含有氨苄青酶素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜。收集菌体，按照常规方法小量抽提质粒，经过酶切鉴定确定阳性克隆。
二、重组质粒pPIC9K-hIy构建重组质粒pPIC9K-hIy构建由附图表述。
三、重组SMD1168-hIy工程菌株的选筛将重组pPIC9K-hIy质粒经Bg/11酶切线性化后，用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内，通过0.5-5mg/ml G418(氨基糖甙类抗菌素)压力筛选5mg/ml G418的转化子被筛选出，经PCR检测人溶菌酶基因稳定整合到毕赤酵母菌染色体上，该菌株命名为Recombinant SMD1168-hIy strain简称人溶菌酶基因工程菌。
四、基因工程重组人溶菌酶生产工艺工程菌接种于BMGY培基中，在30℃条件下发酵36小时，离心收菌加入BMMY培基中，诱导表达，在30℃条件下发酵24-72小时，离心、收取上清液，截留分子量10KD超滤器、超滤收取浓缩液，经过SP离子交换层析柱，连续洗脱留取活性峰液，鉴定分装冻干，即为成品。
经过SDS-PAGE结果证明电泳是一条带，其蛋白分子量大约为15KD,western blot证实，具有天然人溶菌酶的属性，溶菌酶活力的测定是用浊度减低法，比商品鸡溶菌酶活力高1-3倍，用平板溶圈法实验，临床标本分离的对常用抗菌素耐药的细菌，均对人溶菌酶敏感，展示了具有很好的应用前景，是一种比较理想的消炎、抗菌类药物。
权利要求
1.一种生产基因工程重组人溶菌酶的方法，由以下步骤完成一、获取人溶菌酶基因从人白细胞中提取RNA，经逆转录为cDNA后，进行多聚链式反应(PCR)扩增出人溶菌酶基因；二、表达系统用真核表达载体pPIC9K与毕赤酵母宿主菌SMD1168(his4,pep4)进行人溶菌酶表达；三、提取人溶菌酶。
2.根据权利要求1所述的重组人溶菌酶的方法，获取人溶菌酶基因的步骤为从人外围白细胞中提取细胞总RNA，根据溶菌酶基因序列合成引物，用下游引物P2、异性引物(P1P2)进行聚合酶链式反应PCR,PCR产物与pGEM-T载体在T4DNA连接酶作用下进行连接并转化大肠杆菌(Top10)感受细胞，铺在加氨苄青酶素的LB平板上，37℃生长过夜；挑取4个克隆分别接种于含有氨苄青酶素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜；收集菌体，按照常规方法小量抽提质粒，经过酶切鉴定确定阳性克隆；用双脱氧链终止法进行核甘酸序列分析，结果与发表的人溶菌序列完全一致；用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-hIy质粒，胶回收hIy基因片段；用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切pPIC9K表达载体，胶回收pPIC9K线性化质粒DNA；hIy基因片段与pPIC9K线性化质粒DNA，在T4DNA连接酶作用下进行连接并转化大肠杆菌(Top10)感受细胞，铺在加氨苄青酶素的LB平板上，37℃生长过夜；挑取4个克隆分别接种于含有氨苄青酶素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜。收集菌体，按照常规方法小量抽提质粒，经过酶切鉴定确定阳性克隆。
3.根据权利要求1所述的重组人溶菌酶的方法，重组SMD1168-hIy工程菌株的选筛步骤为将重组pPIC9K-hIy质粒经Bg/11酶切线性化后，用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内，通过0.5-5mg/ml G418(氨基糖甙类抗菌素)压力筛选5mg/ml G418的转化子被筛选出，经PCR检测人溶菌酶基因稳定整合到毕赤酵母菌染色体上，该菌株命名为Recombinant SMD1168-hIy strain简称人溶菌酶基因工程菌。
4.根据权利要求1所述的重组人溶菌酶的方法，提取工艺为工程菌接种于BMGY培基中，在30℃条件下发酵36小时，离心收菌加入BMMY培基中，诱导表达，在30℃条件下发酵24-72小时，离心、收取上清液，截留分子量10KD超滤器、超滤收取浓缩液，经过SP离子交换层析柱，连续洗脱留取活性峰液，鉴定分装冻干，即为成品。
全文摘要
一种生产基因工程重组人溶菌酶的方法,是运用分子生物学技术和基因工程技术,将人溶菌酶基因克隆入酵母菌体内进行表达,然后通过提取、纯化制出人溶菌酶。本发明由于利用基因工程重组技术,发酵生产人溶菌酶,能够较大批量生产人溶菌酶,又避免了从组织中提取易受病源污染的问题,其产品具有稳定、纯净的特点。
文档编号C12N15/79GK1325958SQ0011046
公开日2001年12月12日 申请日期2000年5月26日 优先权日2000年5月26日
发明者张福琴, 安米, 安献禄, 张华 , 贾向志, 董辉, 马文煜, 李元, 李育阳, 袁汉英 申请人:长春奇龙生物技术研究所