专利名称：胰岛素与胰酶联产新工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种胰岛素(insulin, INS)与胰酶联产新 工艺，具体而言就是猪胰提取INS后，将胰渣激活，用PEG(聚乙二 醇)沉淀制备胰酶的方法。
背景技术：
INS是由胰脏(3细胞分泌的一种多肽激素，应用于临床已 有70多年的历史，至今仍是治疗糖尿病(diabetes mellitus, DM)的首 选药物。INS作为DM的特效药，用药量大，用药时间长(INS依赖 型DM患者一般都终生使用INS)。目前，世界上临床使用的INS制 剂有人INS和结晶猪、牛INS。在我国以及其他发展中国家，由于受 经济水平、新药研发水平以及用药水平的限制，临床上使用的多为结 晶猪、牛INS制剂。随着单组分INS的研制成功，猪胰岛素的临床 应用在发展中国家仍将具有广阔的前景。胰酶系各国药典收载的助消化药，是从动物胰脏中提取的多种酶 的混合物，主要成分为胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，它可以用来治疗 消化不良、食欲不振及肝、胰疾患引起的消化障碍。此外，由于胰酶 中含有多种活性物质，可以作为基础原料从中提取多种生化药品，如 胰激肽酶原，弹性蛋白酶，门冬酰胺酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶，羧肽 酶等等。目前，(猪)INS和胰酶的生产均是由猪胰脏提取的。据了解， 目前国内外以胰脏为原料研制的生化药物有大约40多种，其中激素 约6种，酶约13种，是传统生化药物非常重要的一个大家族。但是，
对于传统的生化制药工艺来讲，由于其对原料的高度依赖性，再加上 现代基因工程技术的巨大冲击，使得其必须走综合利用的道路。在综 合利用胰脏的工艺上，多年来国内外都进行了许多的研究工作，有的 已取得可喜的成效。国内有INS-胰激肽释放酶联产、胰酶-弹性蛋白 酶联产、INS-胰高血糖素联产等研究报道，但除弹性蛋白酶-激肽释 放酶-(胰酶)联产获得了效益以外，其它工艺均未投入规模生产。INS和胰酶均是胰脏来源的两种大众药物，它们的联产必将给企业带来巨大的商机和经济效益。目前生产药用胰酶的传统工艺普遍采用的是有机溶剂沉淀的方法。例如，在《重庆医科大学学报》1995 (4)， 305中报道的从猪胰 脏中提取胰酶的优化工艺，工艺流程中使用的沉淀剂是乙醇。《中国 生化药物杂志》1994 (3)， 190报道的高活力胰酶生产工艺中使用的 沉淀剂是高浓度的冷乙醇。常州千红生化制药有限公司在《中国生化 药物杂志》1993 (2)， 40上报道的胰酶工艺使用的沉淀剂是乙醇。 长沙生化制药厂在《青海医药杂志》2000 (4)， 56上报道的胰酶制 备新工艺使用的沉淀剂是丙酮。综上所述，这些工艺中都使用了大量 的有机溶剂，由于有机试剂的易燃性和对工人的慢性毒性，使生产中 存在重大的安全隐患；而且由于乙醇和丙酮可能使蛋白质发生变性， 生产过程中酶活力损失较多，尤其是脂肪酶和淀粉酶的活力损失严 重，致使三酶比例不合理，收率也不尽人意。中国专利(申请号 200410081389.3)提出了用酶沉淀保护剂PEG沉淀激活的猪胰浆来制 备胰酶胰酶的方法，但该方法为胰酶单产，工艺中尚需加入促沉淀剂，
而且酶的比活也不尽人意。发明内容针对上述情况，我们建立了完整的INS与胰酶联产工艺， 工艺中选用氯化锌为INS沉淀浓縮剂，PEG为胰酶沉淀剂。该方法具有安全性好、操作简便、生产周期短、收率和酶活力高等特点，具 有推广应用价值。本发明的INS与胰酶联产新工艺是将猪胰用中性醇提取，上清液 用于提取INS，胰渣用于制备胰酶。上清液用盐酸调pH为4.0，过滤 去沉淀后调pH为5.4-6.2，加入一定体积的2 mol/L氯化锌溶液使其 终浓度为0.05-0.2 mol/L， 2-8 。C放置10-60 min，离心收集沉淀得INS 粗品。胰渣加入氯化钙溶液至0.2-0.5 %， 25-35 。C水浴活化4-8h， 随后加入PEG使其终浓度为10-30%，搅拌15-60 min后分浆，去掉 纤维组织，然后离心收集沉淀，脱脂干燥后得胰酶成品。本发明的上述方法将INS与胰酶联产，实验结果显示，联产工艺 中INS与胰酶的回收率均能达到单产的水平。INS回收率为1300 mg INS粗品/kg胰脏左右，而胰酶重量回收率可达到15%左右，其三酶 效价分别可达5.3 Ph.Eur.U蛋白酶/mg胰酶粉，57.6 Ph.Eur.U淀粉酶 /mg胰酶粉，59.7 Ph.Eur.U脂肪酶/mg胰酶粉(Ph.Eur.U为欧洲药典 效价单位)，达到欧洲药典的标准，并接近胰脏中的天然比例。本发明的上述方法用氯化锌沉淀浓縮INS，不仅沉淀效果好，而 且利于INS粗品的锌结晶。此外，由于氯化锌用量少，产品中盐浓度 低，便于用离子交换层析的方法纯化以制备单组分INS。本发明的上述方法直接用PEG沉淀氯化钙激活的胰渣，沉淀后再
分浆， 一方面，由于单独使用PEC无须加入促沉淀剂，避开了有机 溶剂的大量使用，增加了生产安全性，同时又减少了促沉淀剂的使用所带来的操作步骤和成本；另一方面，通过激活、沉淀和分浆的有效和有序组合，既提高了胰酶的回收率，又提高了胰酶的质量。下面通过若干实例的具体实施方式
，再对本发明的上述内容作进 一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于 下述的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范 围。
具体实施方式
实例1: (1)冰冻猪胰50 g，加入85 %乙醇130 ml， 用氨水调pH为7. 0，搅拌4 h后离心，分别收集上清液和胰渣沉淀， 上清液用于提取INS，胰渣用于制备胰酶。(2) INS的提取上清液 用盐酸调pH为4.0，沉淀析出，过滤去沉淀收集清液，调pH为6.0， 加入一定体积的2 mol/L氯化锌溶液使其终浓度为0. lmol/L， 4 °C 放置30 min，离心收集沉淀即得INS粗品。回收率为1300 mg INS 粗品/kg胰脏。(3)胰酶的制备胰渣加入0.5Q/。氯化钙溶液50ml， 搅匀，30 。C水浴活化6 h，随后加入30 % PEG-6000溶液130 ml， 搅拌30 min后分浆，去掉纤维组织，然后离心收集沉淀，脱脂干燥 后得胰酶成品，重量回收率为15.3%，产品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀 粉酶的含量分别为5.30 Ph.Eur.U/mg， 39.72 Ph.Eur.U/mg， 57.60 Ph.Eur.U/mg。实例2: (1)冰冻猪胰50 g，加入85 %乙醇130 ml，用氨水调 pH为7.0，搅拌4h后离心，分别收集上清液和胰渣沉淀，上清液用
于提取INS，胰渣用于制备胰酶。(2)工NS的提取上清液用盐酸调pH为4.0，沉淀析出，过滤去沉淀收集清液，调pH为6. 1，加入一 定体积的2 mol/L氯化锌溶液使其终浓度为0. 15 mol/L， 2 。C放置 40min，离心收集沉淀即得INS粗品。回收率为1320 mg INS粗品/kg 胰脏。(3)胰酶的制备胰渣加入0.5。/。氯化钙溶液60ml，搅匀，28 。C水浴活化7h，随后加入30。/。PEG-6000溶液120ml，搅拌40min后 分浆，去掉纤维组织，然后离心收集沉淀，脱脂干燥后得胰酶成品， 重量回收率为14.3%，产品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的含量分别 为5.20Ph.Eur.U/mg， 38.76 Ph.Eur.U/mg， 55.60 Ph.Eur.U/mg。实例3: (1)冰冻猪胰50 g，加入85 。/。乙醇130ml，用氨水调pH 为7.0，搅拌4h后离心，分别收集上清液和胰渣沉淀，上清液用于 提取INS，胰渣用于制备胰酶。(2) INS的提取上清液用盐酸调pH 为4.0，沉淀析出，过滤去沉淀收集清液，调pH为5.9，加入一定体 积的2 mol/L氯化锌溶液使其终浓度为0. 08 mol/L， 5。C放置50 min， 离心收集沉淀即得INS粗品。回收率为1280 mg INS粗品/kg胰脏。 (3)胰酶的制备胰渣加入0.5%氯化钙溶液45ml，搅匀，33 °〇水 浴活化5 h，随后加入30 %PEG-6000溶液140 ml，搅拌50 min后分 浆，去掉纤维组织，然后离心收集沉淀，脱脂干燥后得胰酶成品，重 量回收率为15.7%，产品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的含量分别为 4.90 Ph.Eur.U/mg， 56.92 Ph.Eur.U/mg， 61.60 Ph.Eur.U/mg。胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活力测定参照第五版欧洲药典。
权利要求
1.胰岛素与胰酶联产新工艺，猪胰提取胰岛素后，将胰渣激活，用PEG(聚乙二醇)沉淀的方法制备胰酶，其特征在于将猪胰用中性醇提取，上清液用于提取胰岛素，胰渣用于制备胰酶。上清液用盐酸调pH为4.0，过滤去沉淀后调pH为5.4-6.2，加入一定体积的2 mol/L氯化锌溶液使其终浓度为0.05-0.2mol/L，2-8℃放置10-60min，离心收集沉淀得胰岛素粗品。胰渣加入氯化钙溶液至0.2-0.5％，25-35℃水浴活化4-8 h，随后加入PEG使其终浓度为10-30％，搅拌15-60min后分浆，去掉纤维组织，然后离心收集沉淀，脱脂干燥后得胰酶成品。
2. 如权利要求1所述的胰岛素与胰酶联产新工艺，其特征在于使用的胰岛素沉 淀浓縮剂是氯化锌。
3. 如权利要求1所述的胰岛素与胰酶联产新工艺，其特征在于氯化锌的终浓度 为0. 05-0. 2 mol/L，沉淀时的pH为5. 4-6. 2。
4. 如权利要求1所述的胰岛素与胰酶联产新工艺，其特征在于氯化锌沉淀时的 温度为2-8 °C，时间为10-60 min。
5. 如权利要求1所述的胰岛素与胰酶联产新工艺，其特征在于胰酶的制备方法 是直接用PEG沉淀氯化钙激活的胰渣，沉淀后再分浆。
6. 如权利要求1所述的胰岛素与胰酶联产新工艺，其特征在于胰酶活化使用的 氯化钙浓度为0. 2-0. 5 %，温度为25-35 。C ，时间为4-8h。
全文摘要
本发明涉及胰岛素与胰酶联产新工艺，将猪胰用中性醇提取，上清液用于提取胰岛素，胰渣用于制备胰酶。上清液用盐酸调pH为4.0，过滤去沉淀后调pH为5.4-6.2，加入一定体积的2mol/L氯化锌溶液使其终浓度为0.05-0.2mol/L，2-8℃放置10-60min，离心收集沉淀得胰岛素粗品。胰渣加入氯化钙溶液至0.2-0.5％，25-35℃水浴活化4-8h，随后加入聚乙二醇使其终浓度为10-30％，搅拌15-60min后分浆，去掉纤维组织，然后离心收集沉淀，脱脂干燥后得胰酶成品。该方法具有安全性好、操作简便、生产周期短、收率和酶活力高等特点，具有推广应用价值。
文档编号C12N9/94GK101125885SQ20071004860
公开日2008年2月20日 申请日期2007年3月13日 优先权日2007年3月13日
发明者蓉 余, 李晓红, 杨继虞 申请人:四川大学