一种用基因工程大肠杆菌生产不饱和脂肪酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用基因工程大肠杆菌生产不饱和脂肪酸的方法。在含有葡萄糖的发酵培养基中对能够共表达3‐羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA和3‐酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重组工程大肠杆菌进行发酵，重组工程大肠杆菌转化葡萄糖获得不饱和脂肪酸。本发明所述生产工艺条件温和，不需要昂贵的催化剂，产物专一性好，避免了传统的化学合成途径中苛刻的反应条件和副产物生成，是一种合成不饱和脂肪酸的绿色新工艺。
【专利说明】一种用基因工程大肠杆菌生产不饱和脂肪酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种用基因工程大肠杆菌生产不饱和脂肪酸的方法。
【背景技术】
[0002]不饱和脂肪酸是一种重要的保健品，不饱和脂肪酸具有调节血脂，清理血栓，调节免疫，维持视网膜提高视力，促进脑部发育等重要作用。
[0003]传统的不饱和脂肪酸主要通过物理方法从鱼油或者植物油中提取，植物油和鱼油的产量限制了其成本的降低，不利于广大人民群众日常使用。上述瓶颈问题阻碍了不饱和脂肪酸合成的发展，因此寻找绿色合成木糖酸的途径势在必行。
[0004]生物转化是以酶为催化剂来完成的化学反应，反应条件温和，对环境友好；以可再生资源为底物的生物催化合成，是解决全球能源危机和粮食危机的有效途径，近年来研究非常活跃，特别的，采用微生物催化葡萄糖生成不饱和脂肪酸已经得到了较为广泛深入的研究。
[0005]脂肪酸去饱和酶存在于几乎所有生物中，是催化多不饱和脂肪酸生物合成的关键酶类。根据脂肪酸去饱和酶作用的底物不同可以分为3类:(1)可溶性的酰基-ACP(酰基载体蛋白)去饱和酶，能将与酰基载体蛋白相结合的脂肪酸去饱和，在其烃链上引入双键，存在于植物质体的基质中；(2)酰基-lipid去饱和酶是一类膜结合的酶，能将结合于甘油酯上的脂肪酸去饱和形成双键，或在糖脂结合的脂肪酸烃链上引入双键，存在于内质网膜、植物的叶绿体膜，一些杆菌的质膜上；(3)酰基-CoA去饱和酶，也是一种膜结合蛋白，能在与辅酶A结合的脂肪酸的烃链上引入双键，存在于动物及真菌的内质网膜上。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种生物法转化葡萄糖生成不饱和脂肪酸的方法。
[0007]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0008]一种生物催化葡萄糖合成不饱和脂肪酸的方法，在含有葡萄糖的发酵培养基中对能够共表达3-羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA和3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重组工程大肠杆菌进行发酵，重组工程大肠杆菌转化葡萄糖获得不饱和脂肪酸。
[0009]其中，所述的重组工程大肠杆菌优选将含有3-羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA和3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重组表达载体转染大肠杆菌所得；所述的大肠杆菌优选大肠杆菌BL21(DE3)。
[0010]所述的重组表达载体优选以pET30a载体为出发载体，Xba I/Nde I酶切位点间插入3-羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA，Nco I/EcoR I酶切位点间插入3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB。
[0011]所述的基因fabA优选来源于大肠杆菌，Genbank登录号为:ID6060334,或和fabA基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和fabA基因没有明显的同源性，但和fabA具有相同或相似功能的核酸序列；所述基因fabB优选来源于大肠杆菌，Genbank登录号为:ID6059208，或和fabB基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和fabB基因没有明显的同源性，但和fabB具有相同或相似功能的核酸序列。
[0012]所述的含有葡萄糖的发酵培养基配方为6g/L Na2HPO4, 3g/L KH2PO4,1g/L NH4Cl,
0.5g/L NaCl,lmM MgSO4, 2%葡萄糖。所述的发酵培养条件为:培养温度30_37°C、搅拌速度400-800rpm、pH 6.5-7.5和溶氧20%以上的条件下培养至OD6tltl约为12-20，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1-1.0mmol.L—1，两小时后收集产物。
[0013]所述的方法还包含从发酵产物中分离纯化不饱和脂肪酸。
[0014]按照本发明所述方法合成的不饱和脂肪酸。
[0015]一种用于生物发酵制备不饱和脂肪酸的重组大肠杆菌，是将含有3-羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA和3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重组表达载体转染大肠杆菌所得；所述的大肠杆菌优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0016]所述的重组表达载体优选以pET30a载体为出发载体，Xba I/Nde I酶切位点间插入3-羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA，Nco I/EcoR I酶切位点间插入3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB。
[0017]本发明所述的重组大肠杆菌在制备不饱和脂肪酸中的应用。
[0018]有益效果:
[0019]本发明中的重组菌株能够高效的转化廉价的葡萄糖生成不饱和脂肪酸，该转化过程在温和的条件下(30-37°C)即可以进行，能有效提高不饱和脂肪酸的产率，同时不需要贵金属催化剂，有效的降低了生产成本，产物专一性好(附图1)，避免了传统的化学合成途径中苛刻的反应条件和副产物生成，是一种合成不饱和脂肪酸的绿色新工艺。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1脂肪酸酸生物合成代谢途径
[0021 ] 图2 3-羟基脂酰ACP脱水酶基因(fabA)和3_酮脂酰ACP合成酶(fabB)共表达载体示意图
[0022]图3工程菌合成不饱和脂肪酸的液相色谱法检测
[0023]根据质谱数据，Retent1n time为13.4和14.2的峰为不饱和脂肪酸，液相结果显示所占比例为33.4%。
【具体实施方式】
[0024]实施例1
[0025]3-羟基脂酰ACP脱水酶基因(fabA)和3_酮脂酰ACP合成酶(fabB)共表达载体的构建，具体过程如下:
[0026]由南京金斯瑞公司全序列合成两端基因，并克隆进pET30a载体。Xba I/Nde I酶切位点间插入3-羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA，Nco I/EcoR I酶切位点间插入3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB。本发明的载体构建方法为本领域的常规方法。
[0027]实施例2
[0028]合成不饱和脂肪酸的工程大肠杆菌菌株的制备，并用该菌株发酵转化葡萄糖生成不饱和脂肪酸，其具体过程如下:
[0029]采用碱裂解法提取实施例1中构建得到的重组质粒pA-fabAB，采用热击转化法将10 μ I重组质粒pA-fabAB转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，然后取50 μ I转化后的菌液涂布于含有34 μ g.mL-1氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，长出的菌落即为共表达3-羟基脂酰ACP脱水酶基因和3-酮脂酰ACP合成酶的重组大肠杆菌菌株。
[0030]挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，37°C、180rpm振荡培养过夜，然后将菌液按体积比1%的接种量接种到添加34μ g 氯霉素的发酵培养基中进行发酵罐发酵，配方为 6g/L Na2HPO4, 3g/L KH2PO4,1g/L NH4Cl70.5g/L NaCl,lmM MgSO4,2%葡萄糖。在培养温度30°C、搅拌速度400rpm、pH 6.5和溶氧20%以上的条件下培养至OD600约为12，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1-1.0mmol.L—1，两小时后收集产物。
[0031]结果见图3,根据质谱数据，Retent1n time为13.4和14.2的峰为不饱和脂肪酸，也想结果显示，这两个峰对应的不饱和脂肪酸所占产物质量比例共计为33.4%。
【权利要求】
1.一种生物催化葡萄糖合成不饱和脂肪酸的方法，其特征在于在含有葡萄糖的发酵培养基中对能够共表达3 -羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA和3 -酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重组工程大肠杆菌进行发酵，重组工程大肠杆菌转化葡萄糖获得不饱和脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的重组工程大肠杆菌是将含有3-羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA和3 -酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重组表达载体转染大肠杆菌所得；所述的大肠杆菌优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的重组表达载体以pET30a载体为出发载体，Xba I/Nde I酶切位点间插入3 -羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA，Nco I/EcoR I酶切位点间插入3 -酮脂酰ACP合成酶基因fabB。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的基因fabA选自来源于大肠杆菌，Genbank登录号为:ID6060334的核酸序列，或和fabA基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和fabA基因没有明显的同源性，但和fabA具有相同或相似功能的核酸序列；所述基因fabB选自来源于大肠杆菌，Genbank登录号为:ID 6059208的核酸序列，或和fabB基因同源性超过70 %的核酸序列，或来源于其它生物体，和fabB基因没有明显的同源性，但和fabB具有相同或相似功能的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的含有葡萄糖的发酵培养基配方为6g/LNa2HP04，3g/L KH2PO4,1g/L NH4Cl70.5g/L NaCl，lmM MgSO4, 2%葡萄糖；所述的发酵培养条件为:培养温度30 - 37°C、搅拌速度400 - 800rpm、pH 6.5 - 7.5和溶氧20%以上的条件下培养至OD600约为12 - 20，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1 - 1.0mmol.L _ S两小时后收集产物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法还包含从发酵产物中分离纯化不饱和脂肪酸。
7.根据权利要求1?6中任一项所述方法合成的不饱和脂肪酸。
8.一种用于生物发酵制备不饱和脂肪酸的重组大肠杆菌，其特征在于所述的重组工程大肠杆菌是将含有3 -羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA和3 -酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重组表达载体转染大肠杆菌所得；所述的大肠杆菌优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
9.根据权利要求8所述的重组大肠杆菌，其特征在于所述的重组表达载体以pET30a载体为出发载体，Xba I/Nde I酶切位点间插入3 -羟基脂酰ACP脱水酶基因fabA，Nco I/EcoR I酶切位点间插入3 -酮脂酰ACP合成酶基因fabB。
10.权利要求8或9所述的重组大肠杆菌在制备不饱和脂肪酸中的应用。
【文档编号】C12P7/40GK104328145SQ201410558089
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】陈熹, 周榆, 饶兵, 朱瑞驰, 朱毅, 徐艺林, 荣慧, 秦榛, 章秋浩, 欧阳丽, 徐春晖, 杨展朝, 陈昱达, 朱琪璋, 赵奕玲, 温玉琪 申请人:南京大学