专利名称：一株生产莽草酸的重组大肠杆菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种莽草酸生产菌株及其构建方法。
背景技术：
莽草酸(shikimic acid)是生物合成芳香族氨基酸的通路即莽草酸途径的重要中间体，已报道的生理功能有通过影响花生四烯酸代谢来抑制血小板聚集，从而可以抑制动、静脉血栓及脑血栓形成；具有抗炎、镇痛作用；还可作为抗病毒和抗癌药物的中间体， 有广泛的药用价值等等。其化学名称为3，4，5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，化学结构式如下
HO目前用以治疗H5m型禽流感病毒的特效药物为磷酸奥司他韦(oseltamivir phosphate)，商品名为达菲，而莽草酸正是抗禽流感药物“达菲”合成的关键手性起始原料。 目前生产所需莽草酸大部分来自于中国广西的木兰科植物一八角，但是此种生产工艺复杂，得率较低，且原料易受季节、气候等因素限制，难以满足大规模生产所需，瑞士罗氏公司拥有此种达菲生产的专利权，价格昂贵。因此，对微生物芳香族氨基酸代谢流改造以提高莽草酸产量具有广阔前景。微生物生长所需的原材料如葡萄糖等随时可获得，其繁殖速度快，代谢能力强，故而周期短，且生产过程对环境污染小，成本低廉，相比于植物提取具有很大的优势。故而通过生物手段改造工程菌从而使之大量生产莽草酸具有很重要的经济、社会效益。
发明内容
本发明的目的在于通过基因工程的方法对大肠杆菌CCM(central carbon metabolism)及莽草酸途径进行改造，从而提供一种新的莽草酸的生产菌株。本发明的另一个目的在于提供所述的莽草酸生产菌株的构建方法。本发明的莽草酸生产菌株的构建方法包括以下步骤(1)、构建敲除ptsHIcrr操纵子、ydiB、shiA、aroL和aroK基因以及整合T7RNA聚合酶的大肠杆菌DHPYASA-T7。(2)、构建含有T7启动子的莽草酸代谢途径中的关键基因tktA、glk、aroE、aroF以及aroB的重组表达质粒pAOC-TGEFB。
(3)、将重组表达质粒pAOC-TGEFB转化改造菌株DHPYASA-T7获得莽草酸的生产菌株DHPYAS-T7。本发明所述菌株与国内外现有专利相比，创新之处在于以下两点(1)、敲除ptsHIcrr操纵子基因，提高莽草酸途径前体PEP的供给。ptsHIcrr基因敲除或突变解除了 “分解物代谢阻遏现象”，能更有效地利用复合培养基水解产物来维持菌体生长，PTS系统缺失菌株依赖feilP及Glk以ATP提供的磷酸基进行葡萄糖磷酸化转运， 该葡萄糖转运系统提高胞内PEP的利用率，有利于增加碳流进入芳香族氨基酸途径；(2)、敲除ydiB基因提高莽草酸产量。YdiB是一种双功能酶(奎尼酸/莽草酸脱氢酶)，与奎尼酸(QA)代谢紧密相关，ydiB基因敲除后菌株缺乏奎尼酸脱氢酶活性，三脱氢奎尼酸(DHQ)合成QA途径受阻，副产物QA产量下降，DHQ得到积累并在脱氢奎尼酸脱水酶催化下合成大量三脱氢莽草酸(DHS)；而莽草酸脱氢酶活性可以通过aroE基因的过表达得到补偿，高浓度的DHS作为莽草酸脱氢酶的底物，高效合成莽草酸，目的产物产量显著提尚；本发明所构建的莽草酸生产菌株DHPYAS-T7已于2011年03月03日提交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 4631。利用本发明所获得的基因工程菌株DHPYAS-T7进行发酵，可以有效获得目的产物莽草酸的积累，从而为莽草酸生物合成的产业化奠定了基础。
图1为ptsHIcrr基因敲除策略，其中L为大肠杆菌中ptsHIcrr上游同源基因，R 为ptsHIcrr下游同源基因。图2为DH5a Δ ptsHIcrr敲除菌DHP的PCR鉴定，显示ptsHIcrr基因已被成功敲除；其中M为DNA marker ;1，2为野生型大肠杆菌DH5 α ；3为ptsHIcrr敲除菌。图3为pET48a-YLR/DH5 α阳性菌鉴定结果；其中M为DNA Marker, 11-20为经 pETj8a-YLR转化后的大肠杆菌不同单菌落进行PCR鉴定的结果，结果显示11-14、16、19均为阳性条带。图4为DHP菌的ydiB基因敲除的阳性菌落鉴定结果；M为DNA Marker, 1-10均为诱导敲除ydiB基因后挑取的单菌落进行PCR鉴定的结果，结果显示1-8、10均为阴性条带， 9号为阳性条带，说明9号中ydiB基因敲除成功。图5为pET-28a_ALR/DH5 α阳性菌鉴定结果；其中M为DNA Marker, 1-10为经 pETjSa-ALR转化后的大肠杆菌不同单菌落进行PCR鉴定的结果，结果显示10为阴性条带， 1-9均为阳性条带。图6为DHPY菌的aroL基因敲除阳性菌鉴定结果；M为DNA Marker, 1-10为诱导敲除aroL基因后挑取的单菌落进行PCR鉴定的结果，结果显示1、3_10均为阴性，2号条带为阳性条带，说明2号中aroL基因敲除成功。图7为DHPYA菌的T7RNP整合鉴定结果；图中M为DNA Marker，1_5均为整合T7RNP 的菌株经PCR鉴定的结果，结果显示均为阳性条带，说明T7RNP整合成功。图8为DHPYA-T7菌株shiA基因敲除阳性菌鉴定结果；M为DNA Marker,DH5 α为阴性对照菌，1-9号，11-20号均为诱导敲除shiA基因后挑取的单菌落进行PCR鉴定的结果，结果显示除了 5号菌没生长导致无条带外，其余均为阳性条带，说明ShiA基因敲除成功。图9为DHPYAA-T7菌株aroK基因敲除阳性菌鉴定结果；M为DNA Marker, DH5 α 为阴性对照菌，1-9号，11-20号均为诱导敲除aroK基因后挑取的单菌落进行PCR鉴定的结果，结果显示均为阳性条带，说明aroK基因敲除成功。图10为pET!3b-TGEFB质粒拼接方法。图11为本实验构建菌株DHPYAS-T7和国内文献报道高水平表达莽草酸的重组菌 JDL02/pTrc-aroG-tktA 的产量对比。
具体实施例方式实施例1、构建敲除PtsHIcrr、ydiB、aroL、aroK、shiA基因以及整合T7RNA聚合酶的大肠杆菌DHPYASA-T71. 1敲除ptsHIcrr操纵子构建大肠杆菌DHP1. 1. 1质粒与菌株低拷贝辅助质粒pKDS(自行构建，含λ噬菌体重组酶和I-Sce I归巢内切酶温敏型复制子；eX0、bet、gam以及归巢内切酶均受阿拉伯糖启动子调控)；高拷贝打靶质粒PC以pET48a(+)为基础构建；大肠杆菌DH5 α。1. 1.2主要试剂和仪器限制性内切酶、DNA marker购自宝生物工程(大连) 有限公司；葡萄糖检测试剂盒及乙酸检测试剂盒分别购自中生北控生物科技有限公司、 Boehringer-Mannheim 公司；氣霄素、卡 JP 霄素购自 AMRESC0 公司；Electroporation SystemECM 399购自HARVARD APPARATUS公司，其他均为分析纯化学试剂。1.1. 3培养基及培养条件LB培养基(g/L)蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10 ;LBG 培养基(g/L)蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，葡萄糖10 ；FMG培养基(g/L) =K2HPO4 ·3Η207， NaH2PO3 ·2Η203,Νβ01 2. 5，酵母粉 12，蛋白胨 15，另加 0. 5g MgSO4 ·7Η20 禾口 2g 葡萄糖；M9 修饰培养基(g/L)是在M9培养基基础上稍加修改获得，Na2HPO4 · 7H2064, KH2P0415, NaC12. 5， NH4Cl 5. 0，另加 anl lmol/1 MgSO4 和 100 μ 1 lmol/L CaCl2，再加入终浓度为 0. 2% 的葡萄糖和0. 的酵母粉。氯霉素、卡那霉素工作浓度分别为50 μ g/ml和50 μ g/ml。1.1. 4引物引物Cl及C4中带EcoR I、Xho I酶切位点。ptsHIcrr操纵子打靶 DNA线性片段以重叠PCR获得，故引物C3与C2部分序列反向互补，鉴定引物C5/C6。引物合成及相关测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。引物序列如下Cl 见序列表中序列1C2 见序列表中序列2C3:见序列表中序列3C4:见序列表中序列4C5:见序列表中序列5C6:见序列表中序列61. 1. 5PCR打靶片段及打靶质粒制备以DH5 α基因组为模板，以C1/C2为引物进行PCR扩增得到ptsHIcrr操纵子左同源臂；C3/C4为引物PCR扩增得到ptsHIcrr操纵子右同源臂，再分别以回收的左右同源臂为共同模板，以C1/C4为引物进行重叠PCR得到 ptsHIcrr基因的线性打靶DNA片段Cl。打靶片段Cl和pET载体经EcoR I、Xho I双酶切， 连接等步骤得到打靶质粒PC。1. 1. 6ptsHIcrr操纵子快速敲除及鉴定(1)电转化取1 μ 1打靶质粒和7 μ 1辅助质粒pKDS至50 μ 1电转感受态细胞并混勻，冰浴后将混合物转移至已预冷的Imm电击杯中，1. 8KV电击转化，电击完成后迅速加入Iml SOC培养基至30°C，220r/min振荡Ih后培养后涂布卡那、氯霉双抗平皿，筛选阳性转化子，最终获得“共转菌液”。( 诱导敲除 取500 μ 1 “共转菌”于50ml含有氯霉抗性的FMG液体培养基，30°C、220r/min培养至OD约 0. 2时，加入终浓度为0. 2%的L-阿拉伯糖诱导4h，诱导结束后取100 μ 1诱导菌液稀释至 10_4，再取稀释菌液(10_4)100μ1涂布氯霉抗性平皿，30°C培养。见基因敲除策略图1。(3) 敲除菌阳性菌落PCR鉴定及分离以上述氯霉平皿中单菌落为模板，以C5/C6为引物进行菌落PCR以鉴定阳性重组菌落，见图2 ；将含有辅助质粒的阳性菌落接种于液体LB、42°C培养约12h以剔除辅助质粒pKDS，随后将菌液涂布无抗平皿，37°C培养后随机挑取无抗平皿中 20个单菌接种于氯霉素抗性平皿，37°C培养1 后，不能在氯霉素抗性平皿生长的单菌落所对应的无抗平皿上的单菌落即是敲除菌。1. 2以DHP菌株为受体敲除ydiB基因构建大肠杆菌DHPY菌株1. 2. 1同源臂构建 以DH5 α基因组为模板，引物YL5/YL3，YR5/YR3，PCR扩增，经1 %琼脂糖凝胶电泳， 回收约IOOObp条带，即为YL，YR。然后以YL，YR为模板，引物YL5/YR3, PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，回收约2000bp条带，即为1R。所需引物序列15:见序列表中序列713:见序列表中序列8YR5:见序列表中序列9YR3 见序列表中序列101. 2. 2打靶质粒构建以EcoRI/BamHI双酶切pET28a和ALR，酶切产物回收，连接。取DH5 α感受态细胞，冰上融化后，取50 μ L，加入10 μ L连接产物，轻轻混勻，冰浴lOmin，42°C水浴热击90s， 冰浴2min，加入500 μ L无抗LB液体培养基，37°C，220rpm, lh,取200 μ L菌液涂卡那抗性平板，37°C培养过夜。以平板上单菌落为模板，T7/T7t为引物进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳，2500bp条带为阳性条带，如图3，取14、19号菌液送样测序验证为目的片段。1. 2. 3共转菌液制备DH5aPTS-(DHP)电转感受态制备挑取单菌落至5mLLB液体培养基，37°C培养过夜，取500 μ L菌液接种至50mL LB液体培养基中，37°C培养至0D600约0. 6-0. 7。菌液置于冰上20-30min，充分冷却后，转至已预冷的50mL离心管中，4°C，6000rpm，离心lOmin，小心弃上清。50mL冰冷的ddH20重悬细胞，4°C，6000rpm,离心15min，小心弃上清。30mL冰冷的 10%甘油重悬细胞，4°C，6000rpm，离心15min，小心弃上清，重复此步骤。0. 5mL冰冷的10% 甘油重悬细胞，1. 5mL EP管分装，每管100 μ L。电击转化取50 μ L DHP电转感受态，加入2 μ L打靶质粒pET28a_YLR，7 μ L辅助质粒SN3，冰浴2-aiiin，将上述混合物小心转移至已预冷的Imm电击杯中，固定到电转仪， 调整电压至1. 8kv,电击转化，完成后迅速将ImL SOC培养基加入电转杯中，小心吹打混勻， 转移至1. 5mL EP管，30°C振荡培养75min，涂布Kan Cm双抗平板。挑取单菌落至Kan Cm双抗LB液体培养基，即为共转菌液。1. 2. 4ydiB基因诱导敲除及鉴定取50mL Cm LB液体培养基，加入250 μ L 20%葡萄糖，500 μ L共转菌液，30°C培养至0D6000. 552时加入500 μ L 20%阿拉伯糖诱导敲除，30°C 220rpm诱导4h，取菌液稀释涂板，30°C隔夜培养。以平板上单菌落为模板，YJ1/YJR为引物，进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳，如图4，1500bp条带为阳性条带，9号为阳性。所需引物序列YJl 见序列表中序列11YJ2 见序列表中序列12YJL 见序列表中序列13YJR:见序列表中序列14取阳性菌液稀释涂Cm平板，挑取20个单菌落鉴定，PCR体系同上，PCR结果均为阳性，取一管继续稀释传代，再次鉴定均为阳性。取50 μ L菌液接种至无抗LB液体培养基 42°C培养以剔除SN3质粒。1 后稀释涂无抗平板，并将该平板上单菌落标记20个对应挑至Cm平板上，30°C培养，Cm平板上未生长的即为质粒剔除菌株，取无抗上相应号码菌落保留菌种，即为DHP的ydiB敲除菌种，记为DHPY。取得DHPY敲除菌种后，以YJ1/YJ2为引物， 进行fesyTaqPCR，PCR原液送样测序，测序结果显示ydiB敲除成功。1. 3DHPY中aroL基因敲除构建DHPYA菌株1. 3. 1同源臂构建以DH5 α基因组为模板，引物AL5/AL3，AR5/AR3，进行PCR扩增，经1 %琼脂糖凝胶电泳，回收约IOOObp条带，即为AL, AR。以AL, AR为模板，引物AL5/AR3，再进行PCR扩增， 经琼脂糖凝胶电泳，回收约2000bp条带，即为ALR。所需引物序列AL5 见序列表中序列15 AL3 见序列表中序列16AR5 见序列表中序列17 AR3 见序列表中序列181. 3. 2打靶质粒构建经EcoRI/Hindlll双酶切pET28a和ALR，酶切产物回收，连接。然后取DH5a感受态细胞，冰上融化后，取50 μ L，加入10 μ L连接产物，轻轻混勻，冰浴lOmin，42°C水浴热击 90s，冰浴2min，加入500 μ L无抗LB液体培养基，37°C，220rpm, Ih，取200 μ L菌液涂卡那抗性平板，37°C培养过夜。以平板上单菌落为模板，T7/T7t为引物，进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳，如图5，2500bp条带为阳性条带，取4、5号菌液送样测序，测序结果显示正确。1. 3. 3共转菌液制备DHPY电转感受态制备挑取单菌落至5mL LB液体培养基，37 °C培养过夜，取 50(^1^菌液接种至501^ LB液体培养基中，37 °C培养至OD6tltl约0.6-0. 7。菌液置于冰上 20-30min，充分冷却后，转至已预冷的50mL离心管中，4°C，6000rpm，离心lOmin，小心弃上清。50mL冰冷的ddH20重悬细胞，4°C，6000rpm，离心15min，小心弃上清。30mL冰冷的10% 甘油重悬细胞，4°C，6000rpm，离心15min，小心弃上清，重复此步骤。0. 5mL冰冷的10%甘油重悬细胞，1. 5mL EP管分装，每管100 μ L。电击转化取50 μ L DHPY电转感受态，加入2 μ L打靶质粒pET28a_ALR，7 μ L辅助质粒SN3，冰浴2-aiiin，将上述混合物小心转移至已预冷的Imm电击杯中，固定到电转仪，调整电压至Ukv，电击转化，完成后迅速将ImL SOC培养基加入电转杯中，小心吹打混勻，转移至1. 5mL EP管，30°C振荡培养75min，涂布Kan Cm双抗平板。挑取单菌落至Kan Cm双抗LB液体培养基，即为共转菌液。1. 3. 4aroL基因诱导敲除及鉴定取50mL Cm LB液体培养基，加入250 μ L 20%葡萄糖，500 μ L共转菌液，30°C培养至OD6tltl约0. 5时加入500 μ L 20%阿拉伯糖诱导敲除，30°C 220rpm诱导4h，取菌液稀释涂板，30°C隔夜培养。以平板上单菌落为模板，JL/J2为引物，进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳，如图6，1500bp条带为阳性条带，2号为阳性。所需引物序列Jl 见序列表中序列19J2 见序列表中序列20JL 见序列表中序列21JR 见序列表中序列22取阳性菌液稀释涂Cm平板，挑取20个单菌落鉴定，PCR体系同上，PCR结果均为阳性，取一管继续稀释传代，再次鉴定均为阳性。取50 μ L菌液接种至无抗LB液体培养基 42°C培养以剔除SN3质粒。1 后稀释涂无抗平板，并将该平板上单菌落标记20个对应挑至Cm平板上，30°C培养，Cm平板上未生长的即为质粒剔除菌株，取无抗上相应号码菌落保留菌种，即为DHPY的aroL敲除菌种，记为DHPYA0以DHPYA菌液为模板，LJ1/LJ2为引物， 进行fesyTaqPCR，PCR原液送样测序，测序结果显示aroL敲除成功。1. 4在DHPYA染色体中整合T7RNA聚合酶(T7RNP)片段构建由阿拉伯糖控制诱导表达T7RNA聚合酶的宿主DHPYA-T71. 4. 1同源臂及打靶片段构建以BL21(AI)为模板，PCR扩增包含左右同源臂及T7RNA聚合酶基因和四环素基因， 大小约5000bp，所需引物序列AT5 见序列表中序列23AT3 见序列表中序列241. 4. 2电击转化SN3/DHPYA电转感受态制备挑取单菌落至5mL LB液体培养基，30°C培养过夜，取 500 μ L菌液接种至50mL Cm LB液体培养基中，30°C培养至OD6tltl约0. 3时加入终浓度0. 4% L-阿拉伯糖诱导表达40min。菌液置于冰上20-30min，充分冷却后，转至已预冷的50mL离心管中，40C，6000rpm,离心lOmin，小心弃上清。50mL冰冷的ddH20重悬细胞，4°C，6000rpm, 离心15min，小心弃上清。30mL冰冷的10 %甘油重悬细胞，4°C，6000rpm，离心15min，小心弃上清，重复此步骤。150 μ L冰冷的10%甘油重悬细胞，1.5mLEP管分装，每管100 μ L。立即电击转化取50 μ L电转感受态，加入7 μ L打靶片段冰浴2_;3min，将上述混合物小心转移至已预冷的Imm电击杯中，固定到电转仪，调整电压至1. 8kv,电击转化，完成后迅速将ImL SOC培养基加入电转杯中，小心吹打混勻，转移至1. 5mL EP管，30°C振荡培养 75min，涂布Tet平板。1. 4. 3整合鉴定所需引物序列Zl 见序列表中序列25Z2 见序列表中序列26引物Z1/Z2鉴定，如图7，PCR产物约5000bp为阳性条带，取阳性菌株42°C剔除质粒。1. 5在DHPYA-T7染色体上敲除shiA基因构建DHPYAA-T71. 5. 1打靶质粒PKSMN-LR的构建所需序列Si:见序列表中序列27S2:见序列表中序列观
S3 见序列表中序列29S4 见序列表中序列30分别用引物Sl和S2，引物S3和S4，primerSTAR酶，从模板中PCR扩增出shiA基因左同源臂L片段和右同源臂R片段；再以用引物Sl和S4, primerSTAR酶，以L和R片段为模板，重叠PCR扩增出LR片段，将重叠片段LR用T4DNA聚合酶处理，质粒I3KSMN用NotI/ MluI双酶切；将处理过的片段和双酶切的质粒用快速连接酶连接；转化连接产物到感受态细胞，PCR验证阳性克隆子，送交测序，完成质粒I3KSMN-LR的构建。1. 5. 2 一步法直接敲除shiA基因所需序列S5 见序列表中序列31S6 见序列表中序列32将打靶质粒I3KSMN-LR和pK0BEGA_SEC共转化DHPYA-T7宿主感受态细胞，以Amp/ Kan双抗筛选，挑取双抗板上的单克隆接种于5ml Amp/Kan双抗液体LB培养基中培养0D_ 约为0. 3-0. 4，加入终浓度0. 2% L-阿拉伯糖以诱导打靶质粒切割和重组的进行；诱导证后，将菌液稀释10_7，取IOOul涂布于Tet抗性的LB平板，37°C过夜培养；挑取40个单克隆， 用同源臂外引物S5和S6进行PCR验证重组子，结果有7个阳性重组子，将7个阳性重组子点板于Kan抗性的LB平板，除了 40号阳性重组子外，其他的几个在Kan板上都不长；取剩余6个阳性克隆子之一，划线于Tet抗性LB平板，传代培养，37°C过夜培养；挑取20个单克隆，用同源臂外引物S5和S6菌液PCR验证重组子，取阳性克隆子，继续划线于Tet抗性 LB平板，传代培养，42°C培养12h以上；然后再挑取20个单克隆，用同源臂外引物S5和S6 菌液PCR验证重组子，结果如图8所示。将16号菌液PCR产物，送交测序，测序结果显示， shiA已成功敲除；将16号菌液稀释10_7，涂布于无抗LB平板，37°C过夜培养；挑取无抗LB 平板上的20个单菌落点板于Amp抗性LB平板，30°C过夜培养；20个单菌落在Amp板上都不长，则辅助质粒pKOBENGA-SEC剔除干净，保存shiA基因敲除菌，命名DHPYAA-T7。1. 6在DHPYAA-T7染色体上敲除aroK基因构建DHPYASA-T71. 6. 1打靶质粒PKSMN-LR的构建所需序列Arol 见序列表中序列33Aro2 见序列表中序列34Aro3 见序列表中序列35Aro4 见序列表中序列36分别用引物Arol和Aro2，引物Aro3和Aro4，primerSTAR酶，从模板中PCR扩增出aroK基因左同源臂L片段和右同源臂R片段；再以用引物Arol和Aro4，primerSTAR酶， 以L和R片段为模板，重叠PCR扩增出LR片段，将重叠片段LR用T4DNA聚合酶处理，质粒 I3KSMN用Notl/Mlul双酶切；将处理过的片段和双酶切的质粒用快速连接酶连接；转化连接产物到感受态细胞，PCR验证阳性克隆子，送交测序，完成质粒I3KSMN-LR的构建。1. 6. 2 一步法直接敲除aroK基因所需序列Aro5 见序列表中序列37Aro6 见序列表中序列38将打靶质粒I3KSMN-LR和pK0BEGA_SEC共转化DHPYAS-T7宿主感受态细胞，Amp/ Kan双抗筛选；挑取双抗板上的单克隆接种于5ml Amp/Kan双抗液体LB培养基中培养0D_ 约为0. 3-0. 4，加入20% L-阿拉伯糖至终浓度0. 2%诱导打靶质粒切割和重组的进行；诱导证后，将菌液稀释10_7，取IOOul涂布于Tet抗性的LB平板，37°C过夜培养；挑取40个单克隆，用同源臂外引物Aro5和Aro6菌液PCR验证重组子，结果有3个阳性重组子，将3个阳性重组子点板于Kan抗性的LB平板，在Kan板上都不长，则说明打靶质粒切割干净；取其中一个阳性克隆子，划线于Tet抗性LB平板，传代培养，37°C过夜培养；挑取20个单克隆， 用同源臂外引物Aro5和Aro6菌液PCR验证重组子，取其中一个阳性克隆子，继续划线于 Tet抗性LB平板，传代培养，42°C培养12h以上；挑取20个单克隆，用同源臂外引物Aro5和 Aro6菌液PCR验证重组子，结果如图9所示，将1号菌液PCR产物，送交测序，测序结果显示， aroK已成功敲除，之后，将1号菌液稀释10_7，涂布于无抗LB平板，37°C过夜培养，挑取无抗 LB平板上的20个单菌落点板于Amp抗性LB平板，30°C过夜培养；20个单菌落在Amp板上都不长，则辅助质粒pKOBENGA-SEC剔除干净，保存aroK基因敲除菌，命名DHPYASA-T7。实施例2、构建由T7启动子控制表达的tktA、glk、aroE、aroF、aroB载体2. 1以pET载体构建的高拷贝质粒pET-TGEFB2. 1. 1基因定点突变及质粒构建设计引物进行同义突变，消除tktA、glk、aroF基因中存在的部分常见酶切位点。 测序正确后，获得 pET3b-tktAt，pET22b-glkt，pET22b-AaroFft :tktAt 以 Nde I/BamH I 双酶切后连接到pET3b载体；glkt以Xho I/BamH I双酶切连接到pET22b载体；aroF以Xho I/BamHI双酶切连接到pET22b载体；aroE以Nde I/BamH I双酶切连接到pET3b载体；aroB 以NcoI/BamH I双酶切连接到pET28a载体。测序正确后，获得pET3b_tktAt，pET22b_glkt， pET22b-AaroFft, pET3b-aroE, pET28a-aroB 质粒。2. 1.2质粒拼接如图8所示进行质粒的酶切连接，酶切连接均为常规方法，同前。通过酶切连接获得 pET3b-TGEFB 质粒。2. 2以pACYC载体构建低拷贝质粒pAOC-TGEFBpAOC质粒以pACYCDeut为模版扩增P15Aori及CmR片段与上面的Sphl/EcoRI酶切片段(约500bp)连接，酶切产物回收，进行回收pAOC片段和TGEFB片段的快速连接，转化至DH5 α，引物鉴定正确后提质粒即得到pAOC-TGEFB。实施例3、莽草酸表达菌株DHPYAS-T7的获得将实施例1获得的菌株DHPYASA-T7制成感受态细胞，然后用化学方法将实施例2 中获得的重组质粒pAOC-TGEFB转入所述感受态细胞，从而获得莽草酸生产菌株。以上获得的莽草酸表达菌株DHPYAS-T7已于2011年3月3日提交至位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0. 4631。实施例4、大肠杆菌DHPYAS-T7表达莽草酸4.1培养基及培养条件LB培养基(g/L)蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10 ；FMG 培养基(g/L) =K2HPO4 · 3H20 7，NaH2PO3 · 2H20 3，NaCl 2. 5，酵母粉 15，蛋白胨 10，另加 0. 5g MgSO4 · 7H20 和 25g 葡萄糖；氯霉素工作浓度25mg/L ；四环素工作浓度10mg/L。4. 2培养方法将实施例1中的大肠杆菌重组菌DHPYAS-T7，挑取单菌落接种于含3ml双抗LB 液体培养基的试管，37°C过夜培养他，然后按接种量接种于含50ml FMG培养基的250ml摇瓶中，培养6 8小时至OD6tltl约为0. 6左右时，加入终浓度为0. 2 %的L-阿拉伯糖进行诱导，继续培养48小时，让莽草酸充分表达积累，重组菌DHPYAS-T7在摇瓶培养 4 后积累量达到了最大的920mg/L，如图9，与国内杨捷等人报道的莽草酸产生菌JDL02/ pTrc-aroG-tktA摇瓶中产量比较，是后者的(94. 33mg/L)的9. 8倍。
权利要求
1.一种生产莽草酸的重组大肠杆菌的构建方法，其特征首先在于敲除了 ydiB基因。
2.如权利要求1所述，此种生产莽草酸重组大肠杆菌的构建方法，其特征还在于敲除了 ptsHIcrr 操纵子。
3.如权利要求1-2所述，此种生产莽草酸重组大肠杆菌的构建方法，其特征还在于敲除aroL基因。
4.如权利要求1-3所述，此种生产莽草酸重组大肠杆菌的构建方法，其特征还在于敲除aroK基因。
5.如权利要求1-4所述，此种生产莽草酸重组大肠杆菌的构建方法，其特征还在于敲除shiA基因。
6.如权利要求1-5所述，此种生产莽草酸重组大肠杆菌的构建方法，其特征还在于其染色体上整合了由L-阿拉伯糖调控表达的T7RNA聚合酶基因。
7.如权利要求1-6所述，此种生产莽草酸重组大肠杆菌的构建方法，其特征还在于其菌体内转化了重组表达低拷贝质粒pAOC-TGEFB。
8.如权利要求7所述，重组表达质粒pAOC-TGEFB包含有莽草酸代谢途径中的关键基因 tktA、glk、aroE、aroF 以及 aroB。
9.如权利要求8所述，其特征在于，所述重组表达低拷贝质粒pAOC-TGEFB所含的 tktA、glk、aroE、aroF以及aroB基因均带有T7启动子。
10.如权利要求1-7所述，以此方法构建获得生产莽草酸的重组大肠杆菌菌株，其特征在于，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.4631。
11.如权利要求10所述重组工程菌，其特征在于该工程菌为大肠杆菌DH5α。
全文摘要
本发明涉及一株生产莽草酸的重组大肠杆菌及其构建方法。本发明涉及了一种构建莽草酸生产菌株的新策略，本发明首次发现敲除ydiB基因可以提高莽草酸产量。通过敲除ptsHIcrr操纵子、ydiB基因、shiA基因以及aroL基因或aroL基因和aroK基因，同时在染色体上整合了T7RNA聚合酶基因，得到改造过的宿主菌DHPYASA-T7，并自行构建了含有T7启动子的莽草酸途径中相关关键酶基因aroB、aroE、aroF以及glk和tktA的重组低拷贝表达质粒pAOC-TGEFB，然后将重组表达质粒转入改造宿主菌株中，得到莽草酸产生菌株DHPYAS-T7。本发明获得的莽草酸产生菌株，摇瓶生产中已经能够实现莽草酸的有效积累，从而为工业化生产莽草酸奠定了基础。
文档编号C12N1/21GK102250874SQ20111016336
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者周长林, 孙旭, 戴红梅, 方宏清, 李树龙, 蔡钒, 邹永康, 陈凯 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所, 中国药科大学