一种大肠杆菌突变株及利用该菌生产手性天冬氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一株用于废水回用工艺生产天冬氨酸的大肠杆菌菌株HT-ME，保藏编号为CGMCC?No.9288。由于现有天冬氨酸生产工艺中的大肠杆菌均不耐盐，耐盐菌HT-ME为天冬氨酸生产工艺改良提供了一个理想的菌种资源。利用HT-ME菌株对现有天冬氨酸生产工艺进行废水回用改造，可以使发酵废水排放量下降三分之二，能减少污染和降低生产成本。
【专利说明】一种大肠杆菌突变株及利用该菌生产手性天冬氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术和发酵工程领域，具体的说，涉及一种大肠杆菌突变株及 利用该菌株进行废水回用工艺生产手性天冬氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 天冬氨酸（Aspartic acid)又称氨基丁二酸，是构成机体蛋白质的主要氨基酸之 一。结构式为：H00C-CH2-CH(NH2)-C00H，分子量133. 10。它有两种旋光异构体：D型和L 型。通常所说的天冬氨酸是指等量的D型和L型的混合物，为无色单斜棱柱形结晶，溶于 水，微溶于75% (质量分数）乙醇，不溶于乙醚。
[0003] 天冬氨酸为酸性氨基酸之一，属非必需氨基酸，在体内由谷氨酸转氨给草酰乙酸 而得，分解则通过脱氨基生产草酰乙酸或经天冬氨酸酶的作用脱氨生成丁烯二酸进入三羧 酸循环。它是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸以及嘌呤、嘧啶碱基的合 成前体。它可作为钾离子、镁离子的载体向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时 降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用。它参与鸟氨酸循环，促使氨 和二氧化碳生成尿素。降低血液中氨和二氧化碳的含量，增强肝脏功能，消除疲劳。
[0004] 目前天冬氨酸的合成主要有化学法和酶法合成两种。化学法主要用于生产天冬氨 酸的外消旋体DL-天冬氨酸。近年来，波兰、日本、德国用经顺丁烯二酸酐（马来酸酐）和 氨化剂直接进行加成反应合成出天冬氨酸。这种方法具有原料易得、过程简单、反应条件温 和及产物易分离等特点，适合于大规模生产。
[0005] 波兰的Machowski S等人用顺丁烯二酸酐和过量氨水与NH4C1反应，反应在一间 歇反应釜中，于140°C、0. 4MPa下反应2. 5h。将得到的混合物冷却至70°C后用盐酸酸化至 pH2. 5,再冷却至室温，此时天冬氨酸沉淀析出，将沉淀过滤，4°C下水洗后得到产品，产率为 55%。
[0006] 2002年，浙江大学的邢亚军等在一钛材高压釜中，对顺丁烯二酸酐）进行氨化反 应合成了 DL-天冬氨酸。通过实验研究对原有合成工艺作出了改进，使产品收率提高到 70%以上，并且对产品的分离提纯采用顺丁烯二酸（马来酸）代替盐酸进行酸化结晶从而 提高了反应物的利用和减少反应剩余物的污染。
[0007] 2003年天津大学的王亚权等提出了一种简便的、不使用任何催化剂的化学合成 法。实验在聚四氟衬里的250ml高压釜中进行。实验步骤如下：将32. 5g顺丁烯二酸酐（分 析纯）溶于7〇ml水中，加入氨水（分析纯）至pH8,充IMPa氮气，然后在电磁搅拌下加热至 453K，反应6h，反应后冷却至室温，过滤后得无色晶体，收率63. 1 %，熔点338°C。产物的红 外光谱与DL-天冬氨酸的标准谱图吻合，容量分析表明天冬氨酸含量> 98%。
[0008] 而酶法合成是目前工业上合成天冬氨酸左旋单体的主要方法，这种方法不仅收率 高而且光学纯度高。酶法是用天冬氨酸酶催化氨与富马酸发生加成反应而得，其反应式如 下所示：
[0009]
【权利要求】
1. 一种耐盐大肠杆菌突变株，保藏编号为CGMCC No. 9288。
2. 根据权利要求1所述的耐盐大肠杆菌突变株，其特征在于，所述菌株16S rRNA基因 部分片段序列与Seq ID No. 1所述一致。
3. -种利用权利要求1所述大肠杆菌突变菌株生产手性天冬氨酸的方法，包括如下的 步骤： (1) 、以顺丁烯二酸为原料，在溴化钠与过硫酸铵的催化作用下生成反丁烯二酸沉淀， 加氨后使沉淀溶解； (2) 、将CGMCC No. 9288菌株发酵培养后获得的具有天冬氨酸酶活性发酵液作为酶源与 步骤（1)的溶液混合，经过酶促反应生成L-天冬氨酸； (3) 、调节pH至酸性，回收目标产物L-天冬氨酸。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法步骤（1)中反应条件为温度控制 在50-80°C，溴化钠投加量为顺丁烯二酸质量的0. 5-5 %，过硫酸铵的投加量为顺丁烯二酸 的 0· 5-5%。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法步骤（2)中，CGMCC No. 9288菌 株接种于pH值为6 -8的发酵培养基中，在15 -35°C温度下培养12-36小时，获得具有天冬 氨酸酶活性的发酵液。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法步骤（3)中，反应条件为将溶液 pH调节至1. 0-6. 0,待沉淀完全后过滤得到L-天冬氨酸粗产物。
7. -种利用权利要求1所述大肠杆菌突变菌株进行废水回用工艺生产手性天冬氨酸 的方法，包括如下步骤： (1) 、回收利用酶法合成天冬氨酸产生的废液，补加顺丁烯二酸，以及催化剂溴化钠与 过硫酸铵生成反丁烯二酸沉淀，加氨后使沉淀溶解； (2) 、将CGMCC No. 9288菌株发酵培养后获得的具有天冬氨酸酶活性的发酵液作为酶源 与步骤（1)的溶液混合，经过酶促反应生成L-天冬氨酸； ⑶、用顺丁烯二酸调节pH至酸性，回收目标产物L-天冬氨酸。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，该工艺产生的废液可继续采用上述方法 步骤进行循环废水回用，直至废水累积的盐浓度不再适合CGMCC No. 9288生长为止。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法步骤（1)中，补加的顺丁烯二酸 终浓度至l〇〇g/L以上。
10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法步骤（3)中，反应条件为用顺丁 烯二酸调节pH至1.0-6. 0。
【文档编号】C12P13/20GK104120101SQ201410339311
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】王开彬, 张文武, 蔡益峰, 熊轶, 王成, 沈豪 申请人:杭州临安冰峰科技有限公司