一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法

一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法
【专利摘要】本发明公开了一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法，属于生物工程【技术领域】。它是通过将细菌基因组上调控类脂A脂肪酸链合成的 msbB 基因以及 pagP 基因通过自杀性质粒以及同源重组的方法敲除，从而减少类脂A的脂肪酸链的数量，达到降低其脂多糖毒性的目的，并且通过外源低拷贝表达质粒表达pagL以及lpxE蛋白，同时去除类脂A的脂肪酸链以及磷酸基团来达到降低菌株内毒素活性的目的。利用上述技术构建的低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株 Escherichiacoli BL21(DE3)S004，保藏号为CCTCCNO.M2014473，保藏时间为2014年10月14日，其产生的脂多糖刺激细胞表现明显的内毒素活性下降，能够为后续用该工程菌表达用于治疗的外源蛋白和靶向药物打下基础。CCTCC NOM201447320141014
【专利说明】一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法

【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法。

【背景技术】
[0002]脂多糖是革兰氏阴性菌细胞膜中大量存在的结构组份，它由疏水的类脂A，短链不重复的核心多糖以及长链的O抗原多糖组成，其中的活性成分类脂A会激活机体TLR4/MD2/⑶14通路，刺激肿瘤坏死因子和白介素6等细胞因子的分泌，从而导致免疫炎症反应，过多的免疫炎症反应会引起机体的组织损伤，休克甚至死亡。
[0003]大肠杆菌的类脂A包括两个磷酸基团以及六条脂肪酸链，这种结构能够最有效的刺激机体产生免疫炎症反应，同时脂肪酸链的长度，数量以及结合在碳骨架上的位置和I’和4’的憐酸基团都是影响类脂A刺激TLR4/MD2通路以及caspase_ll通路的重要影响因子。Park，B.S等发现去除其中一个磷酸集团后能重构TLR4/MD2，降低细胞因子的分泌水平，但毒性还是较强(Nature 2009，458，1191-1195)。
[0004]大肠杆菌BL21 (DE3)以及其衍生物由于其高效率，大产量以及程序简便的特点被大量用于重组蛋白的表达，然而脂多糖(LPS )在纯化过后的重组蛋白中的残留，极大的限制了重组蛋白在人以及其他哺乳动物中的应用，因此在表达纯化出来的重组蛋白中需要最大限度的降低脂多糖的毒性。
[0005]而现有技术中，还未出现一种能显著降低脂多糖内毒素活性的方法。


【发明内容】

[0006]本发明的目的之一在于提供一株表现低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌Escherichia coli BL21 (DE3) S004 突变株。
[0007]所述突变株不含与脂肪酸链转移酶合成有关的基因和/7a#，同时能表达去除脂肪酸链的酶PagL以及去磷酸基团的酶ΙρχΕ。该菌株保藏于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，分类命名为coli BL21 (DE3) S004，保藏号为CCTCC N0.M2014473，保藏时间为 2014 年 10 月 14 日。
[0008]所述msbB的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示,pagP的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，pagL的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，IpxE的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0009]所述的低内毒素大肠杆菌BL21 (DE3)突变株，它缺失了转移脂肪酸链的关键基因msbB和/Λ3#，同时在菌株内表达去除脂肪酸链的脱酰基转移酶pagL和去除磷酸基团的酶IpxE,从而使突变株类脂A结构变成含有4条脂肪酸链以及一个磷酸基团的结构，能够最大限度的减低其内毒素活性。
[0010]本发明的目的之二在于提供一株表现低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌BL21(DE3)突变株的构建方法。
[0011]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下: (1)通过同源重组的方法，将细菌基因组上调控脂肪酸链转移在类脂八的碳骨架上的酶合成的相关基因皿'站以及敲除，得到不含5？5站和的突变菌株；
(2)构建表达表达去除脂肪酸链的酶即礼和去磷酸基团的酶1與2的低拷贝质粒，并转化入步骤1)所得突变菌株，得到不含咖抑和？叫？并能表达即礼和1與2的低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株。
[0012]所述步骤1)的同源重组的方法包括如下步骤:
1)构建自杀性质粒邱价口-咖诎和叫？；
2)将步骤1)所得自杀性质粒转化入大肠杆菌，并与沙门氏菌自然接合，使同源片段导入沙门氏菌基因组，经过第一次交换和011+抗性筛选，得到阳性克隆；
3)培养阳性克隆，使其发生自发突变产生二次交换，用含有蔗糖的培养基筛选，得到对抗生素敏感而对蔗糖抗性的克隆；
4)通过筛选得到不含咖抑和？叫？的突变菌株。
[0013]所述自杀性质粒￠^￡112-1118138的构建步骤为:
1)含有5？5站基因上下游同源臂的自杀性质粒￠^￡112-1118138的构建:
根据&公布的来源于大肠杆菌 8121 (023),￡301161-10^113。。11 8121 (023)，全基因组序列，序列号为4(^012892，设计咖抑基因的左右同源臂，运用阶1软件设计下述引物:
咖诎 16代-即:5，0^61X06^0^X6X66^6^6 3，
1118138 16 代-(10师:5’ ^00X60^66^X6066006066 600X0X0606^663 ^
11181385’ 0060660060^X00X60^661 60111100^61110663 ^
11181385，6061X^X^X60^01X6060 3，
提取处于对数生长期的大肠杆菌8121 (023)基因组0嫩作为模板，分别用左右同源臂引物进行扩增，得到其左右同源臂的扩增产物，回收产物进行融合？⑶扩增，即用引物咖抑以及1118)38 1*1油卜如财1进行扩增，得到融合好的左右同源臂扩增产物，再用+八反应试剂盒在片段末端进行碱基处理，并与用八(111 I酶切后得到？即112酶切产物在14连接酶的作用下进行连接并转化入入如? 大肠杆菌受体菌株中，得到重组质粒邱2112-咖抑；将重组质粒转化至需要0八？才能生长的\口大肠杆菌中以便进行后续突变株的构建；
2)含有基因上下游同源臂的自杀性质粒的构建:
根据&公布的来源于大肠杆菌 8121 (023),￡301161-10^113。。11 8121 (023)，全基因组序列，序列号为4(^012892，设计？叫？基因的左右同源臂，运用阶1软件设计下述引物:
？叫？ 16代-即:5’3’
？叫？ 16^-(10^: 5’ 61010^00066600160^6611616^00^1^^0^111^ 3’
？邶？ 1*1 曲七-即:5’ 0^0^00160^6600066616^6^0^16^^61111^61 3’
？叫？ 1*1 曲卜(10师:5，1601600610110066^61^ 3，
提取处于对数生长期的大肠杆菌8121 (023)基因组0嫩作为模板，分别用左右同源臂引物进行扩增，得到其左右同源臂的扩增产物，回收产物进行融合？⑶扩增，即用引物？叫？160:-即以及？叫？进行扩增，得到融合好的左右同源臂扩增产物，再用+八反应试剂盒在片段末端进行从碱基处理，并与用1酶切后得到？即112酶切产物在14连接酶的作用下进行连接并转化入受体菌株中，得到重组质粒pRE112-pagP;将重组质粒转化至需要DAP才能生长的Xpir大肠杆菌中以便进行后续突变株的构建。
[0014]重组自杀质粒由于不能在沙门氏菌复制存活，将转入有重组质粒的入如> 大肠杆菌菌株与沙门氏菌自然接合，使同源片段导入沙门氏菌基因组，并且通过同源重组，经过第一次交换和抗性筛选(Cm+抗性)，得到阳性克隆，然后培养阳性克隆，使其发生自发突变产生二次交换，用含有蔗糖的培养基筛选，得到对抗生素敏感而对蔗糖抗性的克隆，最后PCR的方法筛选得到突变菌株。运用同源重组的方法我们构建得到大肠杆菌突变株BL21 (DE3)AmsbB !^pagP ο
[0015]降低大肠杆菌内毒素活性可以通过减少脂肪酸链的数量以及去除磷酸基团来改造类脂A的结构。这里就必须提到一些能够改变脂肪酸链数量的蛋白，包括HtrB (LpxL),MsbB (LpxM), PagP和PagL，LpxR，前面三个蛋白是在类脂A合成途径中与加入脂肪酸链有关的蛋白，后两个蛋白是与去除脂肪酸链有关的蛋白。基因编码类脂A合成途径最后一步将脂肪酸链加上的一个连接酶，它的去除不会影响细菌生长但能够产生低内毒素的脂多糖。PagP能够催化磷酸化的棕榈酸酯链连入碳骨架中，LpxR则是能够去掉类脂A碳骨架3’的脂肪酸链。
[0016]所述步骤2)中低拷贝质粒的制备方法包括如下步骤:
1)以质粒pYA4295为模板,运用弓I物pagPscreenF和pagPscreenR扩增片段pagPU-PlpplpxE-pagPD,并+A连接至表达质粒pl5a,获得表达去磷酸基团的酶IpxE的低拷贝质粒；
2)对步骤I)所得质粒通过I处理，并以质粒pYA4291为模板，运用引物IpxRscreenF和IpxRscreenR将片段IpxRU-Plpp pagL-lpxRD扩增出来，插入至表达去磷酸基团的酶IpxE的低拷贝质粒中，得到表达去除脂肪酸链的酶pagL和去磷酸基团的酶IpxE的低拷贝质粒。
[0017]所用引物如下所示: pagPscreenF:5’ AAACGCCGTTAACCCGATA 3’ pagPscreenR:5’ TAGACACAAATGCTGCTGTGTCG 3’
IpxRscreenF:5’ CAGGGGGTGTCAGTATTTGGCG 3’
IpxRscreenR:5’ CGTGAAGCCAATAATTTCTCGCAC 3’
将所得低拷贝质粒通过电转化的方法转入BL21(DE3) AmsbB菌株中，利用Cm+
进行转化后筛选，并用对应引物进行鉴定，鉴定正确的菌株，命名为大肠杆菌原核表达工程菌突变株S004。
[0018]改变类脂A的磷酸集团也是一种有效的降低内毒素的策略，与减少脂肪酸链类似，碳骨架上I位和4位上的磷酸基团也能够被去除和改造，LpxE，一个来自土拉弗朗西斯麗{Franc i se I la tularensis)内膜上的磷酸激酶,能够选择性的去除I位的磷酸基团，能够产生去磷酸基团化(MPL)的类脂A结构从而降低脂多糖的内毒素活性。
[0019]所述转化可以为化学转化和电转化。
[0020]本发明的主要优点是:
1、大肠杆菌BL21 (DE3)作为一种运用最为广泛的表达宿主菌，其表达的重组蛋白中残留有会引起机体炎症反应的脂多糖的问题亟待解决，本发明即从基因工程的角度入手，对脂多糖的关键成分类脂A的结构进行改造，使其刺激机体产生炎症反应的能力显著降低，在源头上降低脂多糖对重组蛋白的污染，从而不需要再次对重组蛋白进行二次纯化，从而为更好的运用该表达菌表达用于治疗疾病以及药物的重组蛋白提供坚实的基础，具有广阔的市场应用前景。
[0021]2、本发明提供的低内毒素活性的大肠杆菌原核表达工程菌突变株的构建方法通过改变类脂4脂肪酸链数量以及磷酸基团的数量来降低脂多糖毒性，从而降低细菌对机体的毒性，能够为研发弱毒疫苗提供一定的借鉴意义，并且此种方法不含有任何抗性标记，完全符合我国疫苗生物安全的要求。
[0022]3、本发明提供的低内毒素活性的大肠杆菌原核表达工程菌突变株3004与亲本株比较，基因的缺失以及外源基因的表达对其生长影响不大，同时将其用于表达蛋白，其表达蛋白的能力与亲本株比较也无差异。

【专利附图】

【附图说明】
[0023]图1:是本发明中用于构建低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌8121 (023)突变株的基因敲除不意图；
图 2:是八 7/7x7？:::？11551與2 质粒图谱；
图3:是1)158-厶押#::？11551與5:质粒图谱；
图 4:是八 7/7x7？::质粒图谱；
图5:是本发明中大肠杆菌8121(023)突变株八仿5站的鉴定电泳结果，图中1:0嫩
III，八5？5站:突变株，8121 (023):亲本株；
图6:是本发明中大肠杆菌8121 (023)突变株么的鉴定电泳结果，
图中1:0嫩胍1^61~ III，厶/73幻0:突变株，8121 (023):亲本株；
图7:是本发明中大肠杆菌8121 (023)突变株提取的类脂八进行嫩0)1-10？ 13分析，确定其类脂八结构的结果；
图8:是本发明中大肠杆菌8121 (023)突变株的脂多糖刺激细胞产生细胞因子水平检测的结果；
图9:是本发明中大肠杆菌8121 (023)突变株的生长特性以及表达蛋白能力检测的结果。

【具体实施方式】
[0024]下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0025]实施例1
1^11181)8引物设计和？?:！？扩增
根据已报到的大肠杆菌8121 (023)序列(参照序列号为从^012892)设计两对融合？⑶引物分别扩增站基因的上游同源臂以及下游同源臂，扩增片段大小分别为450恥和380如，上述引物均由北京华大基因公司合成，引物序列如下:
咖诎 16代-即:5，0^61X06^0^X6X66^6^6 3，
1118138 16 代-(10师:5’ ^00X60^66^X6066006066 600X0X0606^663 ^
msbB right-up: 5， CCGCGGCCGCATCCTGCAGGT GCTTTTCCAGTTTCGG3，
msbB right-down: 5， GCGTTATATGCACTTGCGC 3，
2、大肠杆菌BL21(DE3)ffisM基因的上、下游同源臂的扩增以及融合
将冻干的大肠杆菌BL21 (DE3)菌株接至LB (普通肉汤)平板中过夜培养，第二天挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37°C 180 r/min培养8_12h提取细菌的基因组(提取基因组利用的是天根生化的细菌基因组抽提试剂盒，按照说明书的操作步骤进行基因组的抽提)。
[0026]PCR的扩增反应在50 μ L的体系中进行，反应体系如下:模板DNA I μ L，2Χ高保真DNA酶预混液，购自宝生物(大连)有限公司25 μ L，上游引物I μ L，下游引物I μ L，ddH2022 μ L0
[0027]扩增条件为:94°C变性5min后进入循环，循环参数为94°C 10 sec，55°C 15 sec,72°C 10 sec。35个循环后，72°C延伸lOmin。扩增的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为450bp和380bp，与预期大小相当。
[0028]上下游同源臂的融合:将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例，总模板量为2 μ L作为PCR扩增模板，利用引物msbB-lF和msbB_2R在与之前相同体系以及扩增条件下进行扩增，得到大小为800bp左右的融合片段
3、pRE112-msbB自杀质粒的构建
将之前得到的融合片段进行+A处理，利用天根生化的plus A反应试剂盒，反应体系为:模板15 μ L，plus A buffer 4 μ L，Taq酶I μ L ;反应条件为:72°C 30min，反应完成后待用。
[0029]自杀质粒pRE112酶切片段的准备:利用A*I酶切PRE112质粒，将质粒片段酶切出T克隆位点，回收载体pRE112，然后用T4 DNA Iigase连接，16°C水浴过夜，转化λ
大肠杆菌感受态细胞，待其长出后进行PCR鉴定，从而获得自杀质粒pRE112-msbB。鉴定结果证实构建的自杀质粒是正确的。
[0030]基因缺失突变株的构建与鉴定
将构建好的自杀质粒pRE112-msbB转化至大肠杆菌菌株中(该质粒缺失了 asd基因，需要DAP才能够生长，能够很好的用于后续接合转移的筛选)，将携带有自杀质粒pRE112-msbB的入如> 大肠杆菌与大肠杆菌BL21 (DE3)进行接合转移，在氯霉素抗性的LB平板上筛选阳性菌落，将阳性菌落在不含氯霉素抗性的LB液体培养基中培养增殖，在10%蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，并挑取单菌落进行PCR鉴定。
[0031]PCR鉴定:提取msbB突变菌株AmsbB-BL21(DE3)基因组DNA，用引物msbB-lF和msbB-2R扩增上下游同源臂片段，同时用引物msbB-lR和msbB-2F扩增msbB基因，看能否扩增出大小为SOObp左右的缺失了 msbB基因的上下游同源臂片段，如果能扩增出相应片段，则表明结果与预期相符，可初步鉴定突变株构建成功。
[0032]实施例2
1、ΔpagP弓I物设计和PCR扩增
根据已报到的大肠杆菌BL21 (DE3)序列(参照GenBank序列号为NC_012892)设计两对融合PCR引物分别扩增/73#基因的上游同源臂以及下游同源臂，扩增片段大小分别为350bp和280bp，上述引物均由北京华大基因公司合成，引物序列如下:
pagP left-up:5’ CCTTGATTGCATTTTGTCAT 3’
pagP left-down: 5’ GTCTCACCCGGGCCTGCAGGTTGTGACCATAAAACATTTA 3’
pagP right-up: 5’ CACAACCTGCAGGCCCGGGTGAGACAAATGAAGTTTTAGT 3’
pagP right-down: 5’ TGCTGCCGTCTTCCGGAGTA 3’
2、大肠杆菌BL21(DE3)/7a#基因的上、下游同源臂的扩增以及融合
将冻干的大肠杆菌BL21 (DE3)菌株接至LB (普通肉汤)平板中过夜培养，第二天挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37°C 180 r/min培养8_12h提取细菌的基因组(提取基因组利用的是天根生化的细菌基因组抽提试剂盒，按照说明书的操作步骤进行基因组的抽提)。
[0033]PCR的扩增反应在50 μ L的体系中进行，反应体系如下:模板DNA I μ L，2Χ高保真DNA酶预混液，购自宝生物(大连)有限公司25 μ L，上游引物I μ L，下游引物I μ L，ddH2022 μ L0
[0034]扩增条件为:94°C变性5min后进入循环，循环参数为94°C 10 sec，55°C 15 sec,72°C 10 sec。35个循环后，72°C延伸lOmin。扩增的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为350bp和280bp，与预期大小相当。
[0035]上下游同源臂的融合:将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例，总模板量为2 μ L作为PCR扩增模板，利用引物msbB-lF和msbB_2R在与之前相同体系以及扩增条件下进行扩增，得到大小为600bp左右的融合片段
3、pRE112-pagP自杀质粒的构建
将之前得到的融合片段进行+A处理，利用天根生化的plus A反应试剂盒，反应体系为:模板15 μ L，plus A buffer 4 μ L，Taq酶I μ L ;反应条件为:72°C 30min，反应完成后待用。
[0036]自杀质粒pRE112酶切片段的准备:利用A*I酶切PRE112质粒，将质粒片段酶切出T克隆位点，回收载体pRE112，然后用T4 DNA Iigase连接，16°C水浴过夜，转化λ
大肠杆菌感受态细胞，待其长出后进行PCR鉴定，从而获得自杀质粒pRE112-pagP。鉴定结果证实构建的自杀质粒是正确的，自杀质粒pRE112-pagP构建流程图如图1所示。
[0037]3、BL21(DE3) AmsM八/^⑷基因缺失突变株的构建与鉴定
将构建好的自杀质粒pRE112_pagP转化至Xpir大肠杆菌菌株中(该质粒缺失了 asd基因，需要DAP才能够生长，能够很好的用于后续接合转移的筛选)，将携带有自杀质粒pRE112-pagP的大肠杆菌与大肠杆菌BL21 (DE3)AmsM菌株进行接合转移,在氯霉素抗性的LB平板上筛选阳性菌落，将阳性菌落在不含氯霉素抗性的LB液体培养基中培养增殖，在10%蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，并挑取单菌落进行PCR鉴定。
[0038]PCR鉴定:提取pagP突变菌株BL21(DE3) AmsbB ApagP基因组DNA，用引物pagP-lF和pagP-2R扩增上下游同源臂片段，看能否扩增出大小为600bp左右的缺失了PagP基因的上下游同源臂片段，如果能扩增出相应片段，则表明结果与预期相符，可初步鉴定突变株构建成功。
[0039]实施例3
1、低拷贝表达质粒的构建
以质粒PYA4291为模板，设计引物扩增出包含有pagL以及启动子Plpp的一整段序列，
将该序列运用进行+4处理,利用天根生化的？1118八反应试剂盒，反应体系为:模板15 0匕？1118 ^ 1X1打61~ 4^匕1叫酶1^1；反应条件为:721 30-11,反应完成后待用。需要将该片段连接至I末端的表达载体？153上，同时用/进行酶切处理该载体，使其有I末端，将两段片段进行连接，从而得到表达/73成的低拷贝质粒。
[0040]利用相同的策略，以质粒？％4295为模板，扩增出包含有1與2以及启动子的一整段序列，利用相同的方式将其连接至？153中，得到表达1？述的低拷贝质粒。
[0041]将扩增出来的片段1與冊-？咖押成-11^0以及表达1與2的低拷贝质粒用5似8 I进行酶切连接从而构建得到表达去除脂肪酸链的酶即礼和去磷酸基团的酶1與2的低拷贝质粒，相关的引物如下所示:
？邶？8(^6611？:5’ ^060061X^0006^1^ 3’
1)8^801-6611^:5^ 1^6^0^0^X60X60X6X6X06 3，
1？^1？801~6611？:5’ 0^66666X6X0^6X^X1X6606 3’
1^801-6611^:5^ 06X6^600^X^X1X0X060^0 3’
2、大肠杆菌8121 (023)突变菌株3004的构建
将构建好的表达去除脂肪酸链的酶即礼和去磷酸基团的酶1與2的低拷贝质粒利用电转化的方法，具体电转化以及制作感受态方法详见《分子生物学实验手册》，转入大肠杆菌突变菌株8121(023)八咖抑八？叫？中得到最终的大肠杆菌原核表达工程菌8121 (023)突变株3004，并运用上述引物进行鉴定，确定其构建成功。
[0042]实施例4
1、大肠杆菌8121 (023)突变菌株3004的类脂八(110(1八)的纯化将待检测细菌的过夜⑶培养液，以1:100的比例加入到新鲜的20001的⑶培养基中，180转，37 1培养至00600为0.8到0.9之间。4。0离心10分钟收集菌体，？88缓冲液冲洗一次，细菌沉淀重悬于20“的？83，然后加入氯仿甲醇，最后比例为011101~0？01~111:11161:1181101: ？88 = 1:2:0.8 ( 乂八)，形成单相 811 ^/076^ 1111X1:111-60 细菌悬浮液室温摇晃1个小时，然后25008离心20分钟，去掉含有磷脂㈧“邓“丨如丨山的上层，留下沉淀，沉淀然后重悬于40 1111的单相811^/0761'，转移到一个501111能盖紧的？口'6工1:11)36中，离心去掉上清，留沉淀，空气干燥，然后悬于251111的50禮80(1111111 3,061^16邱4.5中(震荡和超声波方法溶于溶液),如果需要，用醋酸将邱调整到4.5，然后沸水浴30分钟释放111)1(1八，震荡冷却后，将溶液转移到抗氯仿的离心管，加入氯仿和甲醇到体积比为011101~0？01~111: 11161:1181101: 8^1160118 80(1111111 3,0613,16 = 2:2:1.8，形成——个双才目0761- 1111x1:111*6，充分剧烈震荡来抽取110(1八，然后在2，500 X 8 20。0离心20111111，形成两相，小心收取下相(氯仿有机相)到一个圆形玻璃瓶中，再加入同等的氯仿到溶液中，再次形成双相 811^/0761 1111X1:111-6 (2:2:1.8, 0^101-0^01-111: 11161:1181101: 983),然后离心，小心抽取下相加入到相同的圆形玻璃瓶中，旋转蒸发去掉氯仿，样品于圆形玻璃瓶中，溶于011101~0？01~111:11161:1181101 (2:1, ^八)，转移到一个小的玻璃瓶中，再干燥，盖紧放于-80。0保存或用于分析。
[0043]2、大肠杆菌8121 (023)突变菌株3004的类脂八的嫩0)1-10？ 18分析
纯化过后的类脂八溶解于100 I 0^101-0^01-111/11161:1181101 (2:1, ^八)溶液中，并点样于 1 社!'IX ^88181:6(1 1&861- 06801-^1:1011 10111281:1011 (嫩[01)样品平台上，并点 1μ L的浓度为100 mg/mL的norharmane MALDI混合液随后进行样品分析,所用仪器为Bruker Autoflex Speed MALD1-T0F/T0F mass spectrometer (Bruker Daltonics Inc.,Billerica, MA, USA)，最终所得结果如图4所示，结果说明将msM基因以及押#基因敲除，在菌体内表达pagL和IpxE能够成功的改造大肠杆菌BL21 (DE3)的类脂A结构，为后续验证其是否能够真正引起内毒素活性的降低打下理论基础。
[0044]实施例5
1、大肠杆菌BL21 (DE3)突变菌株S004的脂多糖的纯化
大肠杆菌BL21 (DE3)以及其突变菌株S004的脂多糖的纯化方法如下所示:收集干燥菌体(500 mg)重悬于 15 mL 10 mM Tris - Cl buffer (ρΗ8.0)，其中含有 2% SDS,4% 2-巯基乙醇，2 mM MgCl2，并装入离心管中。悬液放置于65 ° C水浴直到细菌溶解。随即加Λ 100 yg蛋白酶K，并放置样品于65 ° C水浴一小时，过后放置样品于37 ° C过夜。隔日，加入2 mL 3Μ醋酸钠并与细菌悬液充分混匀，然后加入40 mL预冷的乙醇，将样品放置于-20 ° C过夜形成沉淀。隔日，样品以4000 X g离心15 min，上层悬液缓慢丢弃，用9 mL蒸馏水重悬下层沉淀，加入ImL 3 M的乙酸钠，并涡旋，随即加入20 mL预冷的乙醇再次涡旋后将样品放入-20 ° C过夜。隔日再次离心丢弃上层悬液，加入9 mL 10 mMTris - Cl (pH7.4)重悬沉淀，并加入50 μ g DNase I和12.5 μ g Rnase0样品放置于37 ° C 4小时，消化掉残留的核酸。并再次进行乙醇沉淀，混合样品放置于65 ° C水浴30分钟，加入等体积的90%苯酚，于65 ° C放置15 min。时间到后，立即将样品放置于4° C迅速冷却，随机离心6000 X g 15 min。上层的水层收集在一个新的管子中，下层的苯酚层再次加入相同体积的水再次放置于65 ° C 15 min，并冷却于冰水混合物的环境中，离心过后，上层的水层加入到第一次收集出来的水层中，将水层透析出去残留的苯酚，并将样品干燥，所得样品即为脂多糖，用蒸馏水溶解备用。
[0045]2、大肠杆菌BL21 (DE3)突变株S004脂多糖刺激鼠巨噬细胞RAW264.7以及人单核细胞系THPl
鼠巨噬细胞RAW264.7以及人单核细胞系THPl均购买于中国科学院细胞库(上海，中国)，RAW264.7 细胞培养于 37。C，5% CO2，培养基为 DMEM (Gibco BRL, USA)并加入 10%FBS (Hyclone Logan, UT, USA)，THPl 细胞培养于 RPM1-1MO Medium (Gibco BRL, USA),并加入10% FBS (Hyclone Logan, UT, USA)。细胞培养好后，按15/孔的量分装于96孔板中，18小时过后，向板中加入不同溶度的脂多糖对其进行刺激(104，15, 16 and 17 fM),24小时过后，收集细胞培养上清，离心去除细胞碎片，进行检测其细胞因子的表达水平。TNF-α以及IL-12的含量均是用购买于R&D Systems, Inc.的ELISA试剂盒进行，步骤都严格按照说明书进行，所检测到的TNF-α水平以及IL-12水平如图5所示，刺激RAW264.7细胞产生TNFa水平由20，904 pg/mL降低至4，427 pg/mL，刺激THPl细胞则不产生炎症因子，通过细胞刺激试验可以得知改造过后的大肠杆菌突变株的脂多糖刺激细胞产生炎症反应的能力得到了极大的降低。
[0046]实施例6
1、大肠杆菌BL21 (DE3)突变菌株S004的生长特性分析
将10 yL的BL21 (DE3)亲本株以及突变株加入到含有2 mL LB液体培养基的小管中放置于37 ° C培养箱中过夜，隔日，在装有100 mL的三角瓶中加入I mL过夜孵育的细菌，并放置于37。摇床中培养，每个一小时测定其006。。值并记录，所有统计分析重复三次，所得结果如图6所示，结果说明对大肠杆菌表达菌株8121 (023)的基因工程改造对其正常生长影响不大。
[0047] 2、大肠杆菌8121 (023)突变菌株3004表达蛋白能力检测
将已构建好的原核表达质粒邱128-1*0？转化入大肠杆菌8121 (023)以及其突变菌株中，将含有质粒的菌株培养至006。。值达到0.6，往其中加入终浓度为1禮的1？%对其进行诱导表达，4小时过后，收集细菌菌体，使其溶解于25禮11-18-1101邱8.0，1.15禮20丁八，1 1118/1111 17802,6中，离心除去不溶组份，将上清进行303-？八⑶电泳，待电泳完成后进行考马氏亮蓝染色分析结果，结果如图6所示，结果说明以上所述的对大肠杆菌表达菌株的基因工程改造对其表达蛋白的功能没有影响。
【权利要求】
1.一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株，其特征在于:所述突变株不含与脂肪酸链转移酶合成有关的基因咖抑和？叫?，同时能表达去除脂肪酸链的酶即礼以及去磷酸基团的酶 1與2⑶ 11 8121 (023) 3004，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为￠^1(^勵.12014473，保藏时间为2014年10月14日。
2.根据权利要求1所述的突变株，其特征在于:所述咖抑的核苷酸序列如3即10^0.1所示，￠1叫？的核苷酸序列如320 10 ^0.2所示，1)3,^1的核苷酸序列如3即10 ^0.3所示，1邮的核苷酸序列如卿10 ^0.4所示。
3.—种低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株的构建方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤: 1)通过同源重组的方法，将细菌基因组上调控脂肪酸链转移在类脂纟的碳骨架上的酶合成的相关基因咖抑以及￠1叫？敲除，得到不含1118)38和￠1叫？的突变菌株； 2)构建表达去除脂肪酸链的酶即礼和去磷酸基团的酶1與2的低拷贝质粒，并转化入步骤1)所得突变菌株，得到不含111必8和？叫？并能表达即礼和1與2的低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株。
4.根据权利要求3所述的突变株的构建方法，其特征在于:所述步骤1)的同源重组的方法包括如下步骤: 1)构建自杀性质粒邱…口-咖诎和叫？； 2)将步骤1)所得自杀性质粒转化入大肠杆菌，并与沙门氏菌自然接合，使同源片段导入沙门氏菌基因组，经过第一次交换和&11+抗性筛选，得到阳性克隆； 3)培养阳性克隆，使其发生自发突变产生二次交换，用含有蔗糖的培养基筛选，得到对抗生素敏感而对蔗糖抗性的克隆； 4)通过筛选得到不含咖抑和？叫？的突变菌株。
5.根据权利要求3所述的突变株的构建方法，其特征在于:所述步骤2)中低拷贝质粒的制备方法包括如下步骤: 1)以质粒於八4295为模板,运用弓|物和扩增片段^1叫？11-1與5:11叫?0，并+八连接至表达质粒1)1521，获得表达去磷酸基团的酶1與2的低拷贝质粒； 2)对步骤1)所得质粒通过I处理，并以质粒？％4291为模板，运用引物1與1？8。1~6611？和1與1？8。1~66111？将片段1與冊￠￡1此-1與1？0扩增出来，插入至质粒表达去磷酸基团的酶1與2的低拷贝质粒中，得到表达去除脂肪酸链的酶即礼和去磷酸基团的酶113x2的低拷贝质粒。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于:所述自杀性质粒￠^￡112-1118138的构建步骤为: 1)引物设计: 咖诎 16代-即:5，0^61X06^0^X6X66^6^6 3，
1118138 16 代-(10师:5’ ^00X60^66^X6066006066 600X0X0606^663 ^ 11181385，0060660060^100160^66160111100^61110663 ^ 11181385，6061X^X^X60^01X6060 3， 2)提取处于对数生长期的大肠杆菌8121(023)基因组0嫩作为模板，分别用左右同源臂引物进行扩增，得到其左右同源臂的扩增产物，回收产物进行融合扩增，即用引物msbB left-up以及msbB right-down进行扩增，得到融合好的左右同源臂扩增产物； 3)再用+A反应试剂盒在片段末端进行+A碱基处理，并与用Adh I酶切后得到pRE112酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接并转化入受体Xpir大肠杆菌菌株中，得到重组质粒 pRE112-msbB。
7.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于:自杀性质粒pRE112-pagP的构建步骤为: 1)引物设计
pagP left-up:5’ CCTTGATTGCATTTTGTCAT 3’
pagP left-down: 5’ GTCTCACCCGGGCCTGCAGGTTGTGACCATAAAACATTTA 3’
pagP right-up: 5’ CACAACCTGCAGGCCCGGGTGAGACAAATGAAGTTTTAGT 3’
pagP right-up: 5’ TGCTGCCGTCTTCCGGAGTA 3’ 2)提取处于对数生长期的大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA作为模板，分别用左右同源臂引物进行扩增，得到其左右同源臂的扩增产物，回收产物进行融合PCR扩增，即用引物msbB left-up以及msbB right-down进行扩增,得到融合好的左右同源臂扩增产物； 3)再用+A反应试剂盒在片段末端进行+A碱基处理，并与用AdhI酶切后得到pRE112酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接并转化入Xpir大肠杆菌受体菌株中，得到重组质粒 pRE112-pagP。
8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于:所述转化可以为化学转化或电转化。
【文档编号】C12N15/70GK104388368SQ201410592119
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】孔庆科, 刘琼, 刘青, 赵新新 申请人:四川农业大学