抗菌肽Hclocidin18在大肠杆菌中的表达方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术及生物医药【技术领域】，特别涉及一种抗菌肽Hclocidin18在大肠杆菌中的表达方法.一种抗菌肽Hclocidin18在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于包括如下步骤：a、质粒构建：采用大肠杆菌进行重组质粒构建，以家蚕质型多角体病毒BmCPV的多角体蛋白作为融合伴侣；b、诱导表达；c、重组质粒编码的融合蛋白的纯化；d、融合蛋白的裂解和抗菌肽Hclocidin18的收集。本发明以家蚕质型多角体病毒（BmCPV）的多角体蛋白作为融合伴侣在大肠杆菌中成功表达了抗菌肽Hclocidin18，同时利用多角体蛋白的碱溶解特性实现了抗菌肽Hclocidin18的高效回收。
【专利说明】抗菌肽He1cidinl8在大肠杆菌中的表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术及生物医药【技术领域】，特别涉及一种抗菌肽HclocidinlS在大肠杆菌中的表达方法。
【背景技术】
[0002]Halocidin是一类来源于海鞘iHalocynthia aurantium)的抗菌肽，天然Halocidin含有两个亚单位，18个氨基酸残基的亚单位(Hclocidin 18)和15个氨基酸残基的亚单位(Hclocidin 15)由二硫键结合在一起。Hclocidinl8具有良好的抗菌活性，因其对畜禽肠道中许多致病革兰氏阳性菌有很强杀伤作用而备受关注。其抗菌作用与抗生素相当，是最有前景的抗生素替代物质。抗菌肽的生物合成也是目前很多研究人员的热门研究课题。因抗菌肽对细菌的抗菌活性，很难在大肠杆菌表达系统中得到表达。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种用于抗菌肽Hclocidinl8表达的Hclocidinl8基因。
[0004]本发明还提供一种抗菌肽HclocidinlS在大肠杆菌中的表达方法，该方法可以使抗菌肽Hcl0cidinl8在大肠杆菌中进行高效表达。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种Hclocidinl8基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0006]—种抗菌肽Hclocidinl8在大肠杆菌中的表达方法,其特征在于包括如下步骤:
a、质粒构建:采用大肠杆菌进行重组质粒`构建，以家蚕质型多角体病毒BmCPV的多角体蛋白作为融合伴侣；b、诱导表达；c、重组质粒编码的融合蛋白的纯化；d、融合蛋白的裂解和抗菌肽Hclocidinl8的收集。抗菌肽Hclocidinl8的氨基酸序列为WLNALLHHGLNCAKGVLA(SEQ ID N0.1)。
[0007]作为优选，质粒构建中具体过程如下:
首先，在HclocidinlS基因前加上羟胺裂解位点编码序列，基因片段5’端加入EcoR I，3，端加入Xho I，合成后克隆入pUC18中，构建重组质粒pUC18- Hclocidinl8 ；
其次，以BmCPV基因组为模板，利用PCR扩增得到多角体蛋白基因，采用的上游引物具有如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，将polh片段克隆入Pucl8- Hclocidinl8中Hclocidinl8基因的前面,得到重组质粒pUC18-polh- Hclocidinl8，然后将其中的polh- Hclocidinl8融合基因片段克隆入pET30a中，得到的重组质粒命名为pET30a-polh_ Hclocidinl8。
[0008]作为优选,重组质粒pET30a-polh_ Hclocidinl8编码的融合蛋白在N末端带有His标签，以利于蛋白纯化，其表达在IPTG诱导下完成。
[0009]作为优选，步骤d具体如下:将融合蛋白溶液与羟氨裂解反应缓冲液混合，55°C孵育24h，polh- Hclocidinl8融合蛋白成功裂解，然后裂解反应样品用20mM pH7.8 PBS透析、离心,获得含有Hclocidinl8的上清,保存并冻干后得到Hclocidinl8的粗制品。进一步的，轻氨裂解反应缓冲液的组分如下:0.22 M Tris base, 1.7 M hydroxylamine-HCl,
4.5 M gua-nidine-HCl和1% 1-propanol, pH 9.0 ;融合蛋白溶液与轻氨裂解反应缓冲液的体积比为1:3。
[0010]本发明以家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体蛋白作为融合伴侣在大肠杆菌中成功表达了抗菌肽Hcl0cidinl8，同时利用多角体蛋白的碱溶解特性实现了抗菌肽Hclocidinl8的高效回收。
【具体实施方式】
[0011]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0012]在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。本发明中采用的PCR技术为常规技术，本领域技术人员根据本发明的内容结合所掌握的知识可以完成本发明中的相关过程。
[0013]实施例:
细菌株系么co7i DH5a用于重组质粒的构建，疋co7i BL21作为表达菌株。金黄色葡萄球菌作为一个典型的格兰氏阳性菌株用于抗菌活性的检测。
[0014]1、pET30a-po lh-Hclocidinl8质粒构建:本发明中用于表达的抗菌肽Hclocidinl8是一段经过分子改造的序列，以下简称Hclocidinl8基因,其核苷酸序列为tggttgaacgcacttttgcatcacggacttaattgcgctaaaggtgttcttgct (SEQ ID N0.2)0
[0015]由上海生工化学合成Hclocidinl8基因，并在Hclocidinl8基因前加上羟胺裂解位点编码序列(Asn-Gly)，基因片段5’端加入EcoR 1，3’端加入Xho I，合成后克隆到质粒PUC18 中，构建重组质粒 pUC18- Hclocidinl8。
[0016]以BmCPV基因组为模板，利用PCR扩增得到多角体蛋白基因(SEQ ID N0.5);所述PCR扩增所用的引物设计如下:上游引物为含有Nco I酶切位点的5’ - AACCCATGGATATGCCGGATTAITCATAC-3’ (SEQ ID N0.3)/ Nco I ;下游引物为含有 EcoR I 酶切位点的 5’-TCGTGAATTC ATACGCCGGACCAG TG -3’ (SEQ ID N0.4) / EcoR I。BmCPV 多角体蛋白的 PCR扩增反应为:一个循环，94° C模板变性3分钟；接着30个循环，94° C变性50秒，55° C退火30秒，72° C延伸I分钟；最后I个循环，72° C延伸10分钟。利用I %琼脂糖凝胶电泳对所述多角体蛋白基因进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Takara的PMD18-T载体，得到PMD18_T-polh，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认PMD18-T-polh克隆基因顺序的正确性。
[0017]PMD18-T-polh经限制性内切酶Nco I和EcoR I双酶切，酶切体系为:pMD18-T-polh DNA 10Pg，Nco I 和 EcoR I 各 0.5 Pl，IOXK buffer+BSA 5 Pl，加 ddH20 至总体积为50W，在37°C的条件下酶切3 h,割胶回收测序正确的polh片段，同时用同样的方法处理pUC18-Hclocidinl8。将经过同样酶切处理的polh片段和pUC18_Hclocidinl8进行连接、转化，筛选得到阳性克隆，命名为重组质粒pUC18-polh- Hclocidinl8。连接体系为 polh 片段 6 m,pUC18-Hclocidinl8 2耵，T4 连接酶 IW 和 IOXbuffer I W，混匀后于16°C条件下连接6 h。随后将10耵连接混合物加入到100耵DH5a感受态细胞中，混匀，冰上放置30min，置于42°C水浴热击45s，迅速置于冰上2min，然后加入900W LB培养基，37 °C摇床振摇lh，取200W涂布在含有氨苄青霉素的LB培养板上，37 °C培养过夜。挑取单克隆菌斑，酶切鉴定筛选得到重组质粒。
[0018]用限制性内切酶Nco I 和 Xho I 消化 pUC18-po Ih-Hc loci din 18,得到 polh-Hclocidinl8融合基因片段，然后将polh- Hclocidinl8融合基因片段克隆入质粒pET30a中，得到的重组质粒命名为pET30a-polh- Hclocidinl8,酶切、连接转化条件同上。重组质粒pET30a-polh- Hclocidinl8编码的融合蛋白在N末端带有His标签，以利于蛋白纯化，他们的表达在IPTG诱导下完成。
[0019]2、诱导表达:将步骤I中所得的表达载体pET30a-polh_ Hclocidinl8转化入万.coli BL21感受态细胞，转化条件同上所述。挑取单克隆菌斑，置于5ml LB培养试管中，37°C震荡培养10h，然后按照1:100的比例放大培养，条件为37°C，200 rpm震荡培养，0D600达到0.6时，加入终浓度为ImM的IPTG，诱导重组蛋白polh- Hclocidinl8的表达。
[0020]3、融合蛋白的纯化:收集步骤2中所得的表达polh- Hclocidinl8融合蛋白的疋coli BL21菌株(4°C，5000rpm)，用PBS (pH7.8)重悬浮，超声破碎后高速离心分离不溶性包涵体(4°C，15000rpm)。用PBS (pH9)重悬浮，震荡溶解30min，高速离心收集不溶性包涵体(4°C，15000rpm)。用PBS (pH12)重悬浮，震荡溶解30min，离心收集溶解后的蛋白。将蛋白溶液用IM盐酸调节pH至7.8，室温静置2h，离心收集沉淀的蛋白质。得到的融合蛋白样品用PBS (pH12)溶解至终浓度为15mg/ml。
[0021]4、融合蛋白的裂解和Hclocidinl8抗菌肽的收集:将融合蛋白溶液与3倍体积的轻氨裂解反应缓冲液(0.22 M Tris base, 1.7 M hydroxy lamine-HCl, 4.5 Mgua-nidine-HCl 和 1% 1-propanol, pH 9.0)混合，55°C孵育 24h。在此条件下，polh-Hcl0cidinl8融合蛋白成功裂解。然后裂解反应样品用20mM PBS (pH7.8)透析、离心。于是获得含有Hclocidinl8的上清,保存并冻干。此冻干样品作为Hclocidinl8的粗制品进行抑菌活性检测。
[0022]5、抑菌活性检测:挑取金黄色葡萄球菌单菌落接种于LB培养基中，37°C，200 r/min振荡，过夜培养至细胞密度为IO8 CFU/mL，用新鲜灭菌的LB培养基稀释IO4倍待用。取2ml备好的菌液，加入200 u I供试蛋白溶液，370C，200 r/min振荡，过夜培养约5h，测0D600。以菌液加200 u I无菌的PBS作为阳性对照。以上每个处理设置3个重复，取平均数。
[0023]Hclocidinl8粗制品的抗菌活性
从融合蛋白上裂解下来和分离离心后重新获得的重组HclocidinlS的抗菌活性用肉汤实验进行定性测定，用金黄色葡萄球菌作为一个典型的格兰氏阳性细菌，结果见表1。与标准合成的HclocidinlS相比，分离离心步骤获得的可溶性上清(S)不溶性样品(IS)没有杀菌活性。
[0024]表1
【权利要求】
1.一种Hclocidinl8基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一种抗菌肽Hclocidinl8在大肠杆菌中的表达方法,其特征在于包括如下步骤: a、质粒构建:采用大肠杆菌进行重组质粒构建，以家蚕质型多角体病毒BmCPV的多角体蛋白作为融合伴侣； b、诱导表达； C、重组质粒编码的融合蛋白的纯化； d、融合蛋白的裂解和抗菌肽Hclocidinl8的收集。
3.根据权利要求2所述的表达方法，其特征在于质粒构建中具体过程如下: 首先，在HclocidinlS基因前加上羟胺裂解位点编码序列，基因片段5’端加入EcoR I，3，端加入Xho I，合成后克隆入pUC18中，构建重组质粒pUC18- Hclocidinl8 ； 其次，以BmCPV基因组为模板，利用PCR扩增得到多角体蛋白基因，采用的上游引物具有如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，将polh片段克隆入Pucl8- Hclocidinl8中Hclocidinl8基因的前面,得到重组质粒pUC18-polh- Hclocidinl8，然后将其中的polh- Hclocidinl8融合基因片段克隆入pET30中，得到的重组质粒命名为pET30a-polh_ Hclocidinl8。
4.根据权利要求3所述的表达方法，其特征在于:重组质粒pET30a-polh-Hclocidinl8编码的融合蛋白在N末端带有His标签，其表达在IPTG诱导下完成。
5.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于:步骤d具体如下:将融合蛋白溶液与羟氨裂解反应缓冲液混合，55°C孵育24h，polh- HclocidinlS融合蛋白成功裂解，然后裂解反应样品用20mM pH7.8 PBS透析、离心，获得含有Hcl0cidinl8的上清，保存并冻干后得到Hclocidinl8的粗制品。`
6.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于:羟氨裂解反应缓冲液的组分如下:0.22 M Tris base, 1.7 M hydroxyIamine-HCl, 4.5 M gua-nidine-HCl 和 1%1-propanol, pH 9.0 ;融合蛋白溶液与轻氨裂解反应缓冲液的体积比为1:3。
【文档编号】C12N15/12GK103667303SQ201310639841
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】相兴伟, 周宇芳, 江玲丽, 杨会成, 孔寅飞, 郑斌 申请人:浙江省海洋开发研究院