专利名称：一种大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统及其构建方法。
背景技术：
随着石油资源的紧缺以及环境的日益恶化，对环保且可再生能源的需求变得越来越迫切，而生物能源便能很好地解决此问题。目前，可利用的商业化生物燃料包括来自于玉米和蔗糖的短链的醇类以及来自于油菜和动物油脂的脂肪酸甲酯衍生物，但这些却存在着生物燃料原料与人类本身需求相矛盾的问题。为了克服这些限制，最好的方法便是利用发酵法生产生物燃料，主要包括短链的醇类、类异戊二烯合成途径中的碳氢化合物以及微生物脂肪酸衍生物。目前为止，能生产生物柴油的微生物主要包括细菌、真菌、酵母、微藻，但由于天然菌株不能高效合成脂肪酸，油脂产量有限，且天然脂肪酸多为胞内分泌，必须从组织、细胞中分离后，才能应用于生物柴油生产，这一过程关系到生物柴油的质量、成本以及·对环境的污染。而与天然菌株相比，大肠杆菌具有遗传背景清楚，易于工程调控，可高密度发酵，生长速度快等诸多优点，已经成为微生物催化合成化学品和燃料的理想受体菌，近年来通过对大肠杆菌的改造生产生物柴油已取得一定的成果。因此本文以大肠杆菌为出发菌株，利用基因工程手段来提高其胞外脂肪酸的产量。大肠杆菌脂肪酸生物合成与调控机制已得到广泛的研究。人们对大肠杆菌的脂肪酸合成途径已有了深入的研究，往往把大肠杆菌的脂肪酸合成途径当做类型II脂肪酸合成酶系的模型。大肠杆菌饱和脂肪酸的合成可分为三步进行。第一步是原料合成，由丙二酸单酰CoA = ACP转酰基酶(FabD)催化，将丙二酸单酰CoA转变成丙二酸单酰ACP。第二步为起始反应，由酮脂酰ACP合成酶III (FabH)将丙二酸单酰ACP与乙酰CoA缩合成乙酰乙酰ACP。第三步为循环反应，有多种酶催化，依次进行。每一次循环脂酰碳链增加两个CH2基团，直到形成棕榈脂酰ACP。循环反应首先由NADPH依赖的β-酮脂酰ACP还原酶(FabG)催化β-酮脂酰ACP还原，生成β-羟脂酰ACP。接着产物脱水，生成反-2-烯酰ACP。这一反应β -羟脂酰ACP脱水酶(FabZ或FabA)催化。循环反应的最后一步是反_2_烯酰ACP还原，由NADPH依赖烯酰ACP还原酶(FabI)催化，生成脂酰ACP。接着开始下一循环，丙二酸单酰ACP和脂酰ACP在β -酮脂酰ACP合成酶I或II (FabB或FabF)缩合成β -酮脂酰ACP，然后依次被还原(FabG)Jj^jC (FabZ或FabA)和再还原(FabI)。大肠杆菌不饱和脂肪酸的合成是按以下方式进行当脂酰链延伸至10个碳时，即形成β_羟基癸脂酰ACP时，该产物经FabA或FabZ脱水，生成反_2_癸烯酰ACP，由于FabA还具有异构酶活性，2-反式-癸烯酰ACP同时被异构化，产生顺-3-癸烯酰ACP，该产物不能被FabI还原，只能作为FabB的底物，与丙二酸单酰ACP缩合成顺-5- β -酮基十二碳烯酰ACP，然后，该产物进入脂肪酸合成的循环反应，最终产生棕榈油酰ACP。在大肠肝菌脂肪酸合成途径中，硫酯酶基因(TesA)可催化水解脂酰基ACP生成游离脂肪酸和ACP，解除由脂酰ACP导致的脂肪酸生物合成调节机制中的反馈抑制作用，释放游离脂肪酸。有关文献报道在大肠杆菌内过表达内源或植物硫酯酶基因，可产生游离脂肪酸。大肠杆菌中脂肪酸合成途径如下所示。
权利要求
1.一种大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统，包括大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌携带有质粒系统，所述质粒系统包括大肠杆菌脂肪酸代谢途径的融合蛋白。
2.如权利要求I所述的大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统，其特征在于，所述融合蛋白中包括若干大肠杆菌脂肪酸代谢途径关键蛋白，通过膜蛋白将该些蛋白锚定在膜上并通过异源二聚体将大肠杆菌脂肪酸代谢途径关键蛋白按照代谢顺序串联在一起。
3.如权利要求2所述的大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统，其特征在于，所述大肠杆菌脂肪酸代谢途径关键蛋白选自酶FabI、FabG, FabZ, TesA中的一种或几种，膜蛋白为膜蛋白Lgt,异源二聚体选自二聚体蛋白 GBD Domain、GBD Ligand、SH3Domain、SH3Ligand 的一种或几种。
4.一种权利要求I或2或3所述的大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统的构建方法，其特征在于，通过膜蛋白将大肠杆菌脂肪酸代谢途径关键蛋白锚定在膜上并通过异源二聚体将所述大肠杆菌脂肪酸代谢途径关键蛋白按照代谢顺序串联在一起，之后将其构建在质粒中形成质粒系统，将所述质粒系统在大肠杆菌中共表达使其定位并聚集于大肠杆菌细胞膜上，即得到大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统。
5.如权利要求4所述的大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统的构建方法，其特征在于，构建多个质粒系统，将该些质粒系统在大肠杆菌中共表达。
6.如权利要求4所述的大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统的构建方法，其特征在于，所述方法还包括，首先，分别制备大肠杆菌脂肪酸代谢途径关键蛋白、膜蛋白和异源二聚体片段。
7.如权利要求6所述的大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌脂肪酸代谢途径关键蛋白选自酶FabI、FabG, FabZ, TesA中的一种或几种，膜蛋白为膜蛋白Lgt,异源二聚体选自二聚体蛋白GBD Domain> GBD Ligand、SH3Domain、SH3Ligand的一种或几种。
8.如权利要求7所述的大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统的构建方法，其特征在于，所述片段的制备方法为以大肠杆菌基因组或大鼠cDNA或小鼠cDNA为模板，用引物进行PCR扩增或PCR扩增后再进行重叠PCR。
9.一种权利要求I或2的系统用于大肠杆菌生产脂肪酸的用途。
10.一种使用权利要求I或2的系统生产脂肪酸的方法，其特征在于，将携带有质粒系统的大肠杆菌于一 LB培养基中培养,得到种子液，之后将该种子液接种到另一 LB培养基中培养，然后加入诱导剂进行诱导表达。
全文摘要
本发明公开了一种大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统及其构建方法和应用。本发明提供的大肠杆菌高效生产脂肪酸的系统的构建方法是，构建大肠杆菌脂肪酸代谢途径关键蛋白FabI、FabG、FabZ、TesA与膜蛋白Lgt、二聚体蛋白GBD Domain、GBD Ligand、SH3Domain、SH3Ligand的融合蛋白，将该系列蛋白在大肠杆菌中共表达使其定位并聚集于细胞膜上，利用该系统进行发酵培养可使大肠杆菌菌体以及培养基中的棕榈酸(C-16)产量及总脂肪酸产量相较于野生型大肠杆菌有显著提高。
文档编号C12R1/19GK102899281SQ201210376058
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者马钢, 贺林, 王右, 吴宇奇, 郭华庆, 尹若楠, 索洋, 奚瑞, 于一能, 吴佳杰, 华楠, 张悦涵, 靳振明, 张少博 申请人:上海交通大学