树干毕赤酵母基因表达系统及其构建与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis)的表达系统及其构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学理论研宄的不断深入和分子生物学手段的不断创新，基因工程技 术得以迅速发展，取得了令人瞩目的成绩。作为基因工程技术的重要内容，基因表达技术渗 透到了工业、农业以及生命科学的各个领域，受到人们的广泛重视。根据外源基因表达宿主 的不同，目前，已发展的基因表达系统有大肠杆菌表达系统、哺乳动物表达系统、酵母表达 系统等。其中酵母表达系统具有操作简单、易于培养、生长速度快、成本低等优点，还具有 大肠杆菌表达系统所不具备的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，因此得到越来越广泛的应 用。
[0003] 酿酒酵母是研宄最多的酵母表达系统，然而酿酒酵母在表达外源基因方面还存在 一些缺点，如缺少易于调控外源蛋白表达的强启动子，缺少恰当的外源蛋白转录后修饰系 统，外源蛋白分泌效率不理想等。因此需要寻找可替代的酵母表达系统来克服现有表达系 统的缺陷，从而进一步扩大酵母表达系统在基因工程中的应用范围，更有效的促进蛋白的 工业化生产。
[0004] 树干毕赤酵母（Scheffersomycesstipitis)因具有降解木聚糖，生成并发酵木糖 生产酒精、乳酸等工业产品的能力而成为研宄的热点，被认为是极具有工业应用前景的半 子囊菌类酵母。木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素重要组成部分，而秸杆半纤维素 中木聚糖含量更是占到90%以上。随着全球资源的不断消耗，开发利用木聚糖等丰富的可 再生资源并生产人类期望的产品成为人们共同关注的焦点。
[0005] 自20世纪80年代起，人们逐渐认识到树干毕赤酵母代谢木糖生产工业产品的潜 在优势，开始对其木糖发酵的传统发酵工艺进行优化。同时，随着基因改良手段的兴起， 尤其在树干毕赤酵母全基因组测序工作（JEFFRIESTW，GRIGORIEVIV，GRIMW00DJ，et al.Genomesequenceofthelignocellulose-bioconvertingandxylose-fermenting yeastPichiastipitis[J].Naturebiotechnology，2007, 25 (3): 319-326)完成后，人们 逐渐将研宄方向转向分子领域。
[0006] 树干毕赤酵母自身的一些特点使其作为基因工程表达宿主具有很大的应用 潜力，如：⑴不具有酵解抑制有氧氧化效应（Crabtree-negative)(PRIORB，KILIAN S，PREEZJC.FermentationofD-xylosebytheyeastsCandidashehataeand Pichiastipitis[J] ?Processbiochemistry，1989, 24 (1) : 21-32)，在严格好气条件 下能够有效转化碳源用于细胞生长，并且不会产生乙醇（GRGENSJF，PASS0THV，ZYL WH，etal.Aminoacidsupplementation,controlledoxygenlimitationand sequentialdoubleinductionimprovesheterologousxylanaseproductionby Pichiastipitis[J].FEMSYeastRes，2005, 5(6-7) :677-683)，有利于后期外源蛋白的高 效生产；（2)酵母为单倍体，较易分离特定突变株（HONWY，PETROSD，DENGX.Genetic transformationofxylose-fermentingyeastPichiastipitis[J].ApplBiochem Biotechnol，1991，28 (1) : 369-375)，在筛选营养缺陷型宿主菌株并构建有效转化系统方面 具有较好优势；（3)具有降解廉价木聚糖并利用生成的木糖进行发酵生产的能力。然而，研 宄发现，树干毕赤酵母在基因表达过程中使用特殊的基因编码系统，密码子CUG编码的亮 氨酸被替换为丝氨酸（LAPLAZAJM,TORRESBR,JINYS,etal.ShbleandCreadapted forfunctionalgenomicsandmetabolicengineeringofPichiastipitis[J].Enzyme andmicrobialtechnology, 2006, 38(6) :741_747)。同时由于对其研宄与应用开展的较 晚，树干毕赤酵母作为外源基因表达系统的发展比较缓慢，远不及酿酒酵母和巴斯德毕赤 酵母。
[0007] 目前，对构建树干毕赤酵母表达系统的研宄仅停留在探索阶段。现在发展的可利 用载体元件，如启动子、筛选标记等还很少，无法满足高效表达载体的构建与应用。因此，有 必要寻找高效的新型载体元件来构建适用于树干毕赤酵母自身的基因表达系统，在此基础 上，可采用该基因表达系统对树干毕赤酵母进行基因工程改造，为构建新型酵母基因工程 菌奠定基础，同时基因表达技术的应用以及有效基因表达系统的构建使树干毕赤酵母利用 木糖转化生产人类有用产品，建立可再生资源循环利用的生物加工工艺成为可能。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种树干毕赤酵母基因表达系统 及其构建与应用。本发明的表达载体可实现在树干毕赤酵母中的整合型或游离型表达，对 树干毕赤酵母的基础理论研宄及产品开发具有重要的意义。
[0009] 本发明的技术方案如下：
[0010] 本发明一方面涉及一种新型整合型表达载体，其为环状，且可操作性地连接有以 下元件：
[0011] pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源整合序列、外源基因表达盒和筛选标记基因 表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子，外源基因插入酶切位点以及 转录终止子；所述筛选标记基因包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
[0012] 优选的，所述的rDNA同源重组序列为18srDNA，序列如SEQIDNO: 1所示。另一个 选择是，所述的rDNA序列与SEQIDN0:1的相似性不低于90%，优选为95%，更优为98%。
[0013] 本发明还提供一种新型游离型表达载体，其为环状，且可操作性地连接有以下元 件：
[0014]pMD19-Tsimple质粒骨架、树干毕赤酵母来源的自主复制序列（PsARS2)、外源基 因表达盒和筛选标记基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子，夕卜 源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述筛选标记基因包括启动子、抗生素抗性基因、转 录终止子。
[0015] 所述的表达载体中的外源基因表达盒启动子包括SpADHP、SpXYLP;转录终止子包 括SpCYClT、SpXYLT。
[0016] 所述的表达载体中的外源基因表达盒启动子和转录终止子的DNA序列来自一株 能够利用木糖的酵母Spathasporapassalidarum，该酵母全基因组序列在NCBI(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的编号为NZ_AEIKOOOOOOOO,其中所述酵母可为来自美国农业 研宄菌种保藏中心的细胞株NRRLY-27907。
[0017] 所述外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和筛选标记基因，所述外源基因插 入所述外源基因表达盒中启动子和转录终止子之间。在本发明的一个实施例中，所述外源 基因为8€口基因，该基因的〇嫩序列如5￡〇10勵：12所示。
[0018] 所述的SpADHP启动子为Spathasporapassalidarum来源的乙醇脱氢酶基因ADH1 启动子，该启动子的DNA序列如SEQIDN0:2所示。
[0019] 所述的SpXYLP启动子为Spathasporapassalidarum来源的木糖还原酶基因XYL 启动子，该启动子的DNA序列如SEQIDNO:3所示；
[0020] 所述的SpTEFlP启动子为Spathasporapassalidarum来源的转录起始因子基因 TEF1启动子，该启动子的DNA序列如SEQIDN0:4所示；
[0021] 所述的SpCYClT终止子为Spathasporapassalidarum来源的细胞色素C基因CYC1 终止子，该终止子的DNA序列如SEQIDNO: 5所示；
[0022] 所述的SpXYLT终止子为Spathasporapassalidarum来源的木糖还原酶基因XYL 终止子，该终止子的DNA序列如SEQIDNO:6所示；
[0023] 所述的筛选标记基因表达盒中的启动子为SpTEFlP;抗生素抗性基因可以是表达 载体中常用的；转录终止子为ScCYC1t。
[0024] 所述的ScCYClj#止子为Saccharomycescerevisiae来源的细胞色素C基因CYC1 终止子，该终止子的DNA序列如SEQIDNO: 7所示。
[0025] 所述的筛选标记基因表达盒中可包括一个以上的标记基因，所述标记基因可为潮 霉素B抗性基因、博来霉素抗性基因和/或G418;在本发明的一个实施方案中，所述标记基 因是潮霉素B抗性基因。
[0026] 所述的潮霉素B抗性基因的DNA序列如SEQIDNO:8所示。
[0027] 所述的博来霉素抗性基因的DNA序列如SEQIDNO:9所示。
[0028] 所述的G418的DNA序列如SEQIDNO: 10所示。
[0029] 所述的自主复制序列（PsARS2)的DNA序列如SEQIDNO: 11所示。
[0030] 本发明所使用的酵母为树干毕赤酵母。具体的，该酵母购自美国农业研宄菌种保 藏中心，保藏编号为NRRLY-7124。
[0031] 本发明提供了含有树干毕赤酵母的整合型基因表达系统；且其中还含有基因表达 载体，所述基因表达载体从5'-3'依次包括以下可操作性连接的元件印1?19-18；[11^16质粒 骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和抗生素筛选标记基因表达盒；所述外源基因 表达盒自上游至下游依次包括启动子，外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述抗生 素筛选标记基因包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。所述含有树干毕赤酵母的整合 型表达系统与上述环状的新型整合型表达载体的各元件的序列相同。
[0032] 本发明还提供了含有树干毕赤酵母的游离型基因表达系统；且其中还含有基因表 达载体，所述基因表达载体从5'-3'依次包括以下可操作性连接的元件印1?19-18；[11^16质 粒骨架、自主复制序列PsARS2、外源基因表达盒和抗生素筛选标记基因表达盒；所述外源 基因表达盒自上游至下游依次包括启动子，外源基因插入酶切位点以及转录终止子；所述 抗生素筛选标记基因包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。所述含有树干毕赤酵母的 游离型表达系统与上述环状的新型游离型表达载体的各元件的序列相同。
[0033] 具体而言，发明人按照下述技术方案制备得到了新型整合型表达载体：
[0034] 以Spathasporapassalidarum基因组DNA为模板，以引物P1和P2进行PCR扩 增获得18srDNA同源重组序列；以引物P23和P24进行PCR扩增获得SpTEFlP启动子；以 引物P25和P26进行PCR扩增获得SpADHlP启动子；以引物P27和P28进行PCR扩增获得 SpXYLP启动子；以引物P29和P30进行PCR扩增获得SpCYCl^止子；以引物P31和P32进 行PCR扩增获得SpXYLT终止子。以PMD-hphm质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR 扩增获得片段hphm-ScCYClT。所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQIDNO. 14-15所示，所 述P21-P32的核苷酸序列如SEQIDNO. 34-45所示。
[0035] 以pMD19-Tsimple为骨架，将上述各片段连接，所述连接是在适当的限制酶酶切 位点上进行的。具体连接方式为：在pMD19-Tsimple的EcoRV酶切位点连接18srDNA后，沿 着18srDNA的方向依次连接外源基因表达盒启动子、外源基因表达盒转录终止子、SpTEFlP 启动子、hph^-ScCYClT。
[0036] 另外，发明人按照下述技术方案制备得到了新型游离型表达载体：
[0037] 以树干毕赤酵母基因组DNA为模板，以引物P33和P34进行PCR扩增获得自主复制 序列；以引物P23和P24进行PCR扩增获得SpTEFlP启动子；以引物P25和P26进行PCR扩 增获得SpADHlP启动子；以引物P27和P28进行PCR扩增获得SpXYLP启动子；以引物P29和 P30进行PCR扩增获得SpCYClj#止子；以引物P31和P32进行PCR扩增获得SpXYLT终止