PSpXYLT:引物P29和P31下划线部分由5'到3'端分别为SalI 和NotI的识别位点，引物P30和P32下划线部分为BamHI的识别位点。
[0206] P29 :5, ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGCTAACTTCAATTAGAA T3，
[0207] P30 :5, CGGGATCCCATCACTATAAGCGAAATCGGGTTTC 3'
[0208] P31 :5' ACGCGTCGACATAAGAATGCGGCCGCGTTTGATTCTAGTTTATA T3'
[0209] P32 :5, GCGCGGATCCATAGTTAACTATGTCACTTGAACTC 3，
[0210] (2)以Spathasporapassalidarum基因组DNA为模板，以引物P29 和P30 进行PCR 扩增，获得片段SpCYClT。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，63°C退火30s，72°C 延伸30s，30个循环，72°C延伸5min。
[0211] (3)以Spathasporapassalidarum基因组DNA为模板，以引物P31 和P32 进行PCR 扩增，获得片段SpXYLT。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，61°C退火30s，72°C延 伸30s，30个循环，72°C延伸5min。
[0212] (4)将纯化的片段SpCYClT和重组质粒PRATH分别用SalI和BamHI双酶切，将 酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于LB(100yg/ml氨 苄青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后SalI和BamHI双酶切验证，获得重组质粒 PAACTH〇
[0213] (5)将纯化的片段SpCYClT和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将 酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于LB (100 y g/ml氨 苄青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒 PAXCTHo
[0214] (6)将纯化的片段SpXYLT和重组质粒PRATH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶 切产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于LB (100 y g/ml氨苄青 霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PMXTH。
[0215] (7)将纯化的片段SpXYLT和重组质粒PRXTH分别用Sal I和BamH I双酶切，将酶 切产物分别纯化后过夜连接，转化E. coli JM109感受态细胞，涂布于LB (100 y g/ml氨苄青 霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后Sal I和BamH I双酶切验证，获得重组质粒PAXXTH。
[0216] 实施例3 :PEG/LiAc介导的树干毕赤酵母转化方法的建立。
[0217]以Scheffersomyces stipitis NRRLY-7124 作为宿主菌，米用PEG/LiAc介导转 化酵母的方法实施如下：
[0218] 一、Scheffersomyces stipitisNRRLY-7124 感受态的制备
[0219] (1)将冻存管保藏的Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124接种于YH)培养 基，摇瓶活化培养48h。
[0220] (2)将活化好的菌液在YPD平板上划线培养，并4°C保存。
[0221] (3)于YPD平板中挑取Scheffersomyces stipitisNRRLY-7124单菌落，接种于 20ml YPD培养基中，于100ml摇瓶中30°C过夜培养。
[0222] (4)将过夜培养的新鲜菌液接种于50mlYPD培养基中，于250ml摇瓶中30°C， 200rpm培养，至菌液0D600到1. 2左右。
[0223] (5) 5000rpm室温离心5min，收集菌体细胞。
[0224] (6)将细胞重新悬浮于500y1 0.lmol/L的LiAc中，离心，弃上清，获得感受态细 胞。
[0225] 二、线性化重组质粒的制备
[0226] (1)将含有重组表达质粒的E.coli接种于LB培养基，过夜培养。
[0227] (2)收集E.coli菌体细胞，采用碱裂法提取重组质粒，具体方法参照博大泰克质 粒提取试剂盒。
[0228] (3)采用限制性内切酶StuI单酶切重组质粒，酶切反应体系（50yL) :40yL DNA，5yLbuffer，1. 5yL限制性内切酶StuI，用双蒸水补足50yL，混匀后置于37°C恒温 箱中酶切2h。
[0229] (4)纯化酶切产物，获得线性化重组质粒。
[0230]三、PEG/LiAc法转化ScheffersomycesstipitisNRRLY-7124
[0231] (1)在感受态细胞中顺序加入下列转化混合液：240yLPEG3350,36yLI.Omol/L LiAc，25yL鲑鱼精DNA，50yL待转化线性DNA，其中鲑鱼精DNA沸水浴lOmin后立即冰浴；
[0232] (2)剧烈振荡每个反应管直至细胞完全混匀；
[0233] (3)置于 30°C温育lh;
[0234] (4)置于42°C金属浴热击22min;
[0235] (5)待降至室温后，5000rpm离心5min，弃上清；
[0236] (6)加入1ml YPD培养基，于30°C后培养2h ;
[0237] (7) 5000rpm离心5min，弃掉800y1上清，混勾菌体并涂布潮霉素B(250mg/mL)抗 性平板，30°C培养3-4d，获得转化子。
[0238] 实施例4:电穿孔法介导的酵母树干毕赤酵母转化方法的建立
[0239] 以ScheffersomycesstipitisNRRLY-7124作为宿主菌，采用电穿孔法介导转化 酵母的实施如下：
[0240] 一、ScheffersomycesstipitisNRRLY-7124 电转感受态细胞的制备
[0241] (1)将冻存管保藏的ScheffersomycesstipitisNRRLY-7124接种于YH)培养 基，摇瓶活化培养48h;
[0242] (2)将活化好的菌液在YPD平板上划线培养，并4°C保存；
[0243](3)于YPD平板中挑取ScheffersomycesstipitisNRRLY-7124单菌落，接种于 20mlYPD培养基中，于100ml摇瓶中30°C过夜培养；
[0244] (4)将过夜培养的新鲜菌液接种于50mlYH)培养基中，于250ml摇瓶中30°C， 200rpm培养，至菌液0D600到1. 2左右；
[0245] (5)将菌液置于冰上30min，5000rpm，4°C离心5min，收集菌体细胞；
[0246] (6)加入预冷的20ml双蒸水洗绦菌体2次，5000rpm，4°C离心5min，收集菌体细 胞；
[0247] (7)加入20ml预冷的1. 0mol/L山梨醇洗绦菌体2次，5000rpm，4°C离心5min，收 集菌体细胞；
[0248] (8)加入200y1预冷的1. 0m〇l/L山梨醇混匀菌体细胞，获得感受态细胞。
[0249]二、线性化重组质粒的制备
[0250](1)将含有重组表达质粒的E. coli接种于LB培养基，过夜培养。
[0251] (2)收集E.coli菌体细胞，采用碱裂法提取重组质粒，具体方法参照博大泰克质 粒提取试剂盒。
[0252] (3)采用限制性内切酶StuI单酶切重组质粒，酶切反应体系（50yL) :40yL DNA，5yLbuffer，1. 5yL限制性内切酶StuI，用双蒸水补足50yL，混匀后置于37°C恒温 箱中酶切2h。
[0253] (4)纯化酶切产物，获得线性化重组质粒。
[0254]三、ScheffersomycesstipitisNRRLY-7124 的电转化
[0255] (1)取100y1电转化感受态细胞和10y1DNA混合，加入到0? 2cm电转杯中；
[0256] (2)电转杯冰浴5min，设定条件1500v，电击5s，进行电转化；
[0257] (3)立即向电转杯中加入1ml预冷的1.Omol/L山梨醇，转移至培养箱30°C温育 lh；
[0258] (4) 5000rpm离心 5min，弃上清；
[0259] (5)加入1mlYPD培养基，混匀菌体细胞，于培养箱30°C后培养2h;
[0260] (6) 5000rpm离心5min，弃掉800y1上清，混勾菌体并涂布潮霉素B(250mg/mL)抗 性平板，30°C培养3-4d，获得转化子。
[0261] 实施例5:PR系列整合型表达载体的应用。
[0262] 一、构建绿色荧光蛋白重组表达载体
[0263] (1)根据绿色荧光蛋白的基因序列，设计引物：引物P35下划线部分为SalI的识 另IJ位点，引物P36下划线部分为NotI的识别位点。
[0264] P35 :5,ACGCGTCGACATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCAC3，
[0265] P36 :5'ATAAGAATGCGGCCGCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG3'
[0266] (2)以绿色荧光蛋白基因的DNA为模板，以引物P35和P36进行PCR扩增，获得基 因gfp。扩增条件为95°C预变性5min，94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸45s，30个循 环，72°C延伸 5min。
[0267](3)将纯化对gfp片段克隆至pMD19_Tsimple载体，转化E.coliJM109感受态细 胞，涂布于LB(100yg/ml氨苄青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后SalI和NotI双 酶切验证，获得重组质粒pMD-gfp。
[0268] (4)由于gfp基因序列开放阅读框中存在密码子CUG，而树干毕赤酵母使用特殊的 编码系统，即密码子CUG编码丝氨酸而非亮氨酸。因此有必要对gfp基因进行定点突变，将 密码子CUG突变为密码子UUG。
[0269] (5)以gfp基因序列开放阅读框中601位的碱基C作为突变位点，设计单点突变引 物：引物P37和P38下划线部分为突变位点。
[0270] P37 :5,GGCAGATTGTGTGGACAAGTAATGGTTGTCTGGTA3'
[0271] p38 :5'TACCAGACAACCATTACTTGTCCACACAATCTGCC3'
[0272] (6)以重组质粒pMD-gfp为模板，采用高保真聚合酶Primerstar，以引物P37和 P38进行PCR扩增，获得环状PCR产物。扩增条件为：98°C预变性2min，98°C变性10s，60°C 退火20s，72°C延伸90s，30个循环，72°C延伸5min。
[0273] (7)将上述PCR产物纯化后用内切酶DpnI于37°C消化30min，于65°C反应 15min以失活内切酶DpnI。将酶切产物纯化后，转化E.coliJM109感受态细胞，涂布于 LB(100yg/ml氨苄青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后送至生工生物工程（上海）股 份有限公司进行测序，挑选突变位点正确的质粒，命名为pMD-gfpm。gfp基因定点突变后序 列如图2所示。
[0274] (8)将重组质粒pMD-gfpjPPRACTH分别用SalI和NotI双酶切。gfp片段酶 切纯化后与质粒PRACTH的酶切产物过夜连接，转化E.coliJM109菌株，涂布于LB(100yg/ ml氨苄青霉素）平板上，挑选单菌落，提取质粒后SalI和NotI双酶切验证，获得绿色荧 光蛋白重组表达载体PRACTH-gfpm，质粒图谱如图3所示。
[0275] 二、构建树干毕赤酵母重组菌
[0276] 将经StuI线性化的质粒实施例2或实施例3中所述方法，转化 到ScheffersomycesstipitisNRRLY-7124中，获得转化子。
[0277] 三、转化子筛选与验证
[0278] (1)通过高浓度潮霉素B抗性平板筛选转化子。将绿色荧光蛋白重组表达载体 转化ScheffersomycesstipitisNRRLY-7124后获得的转化子转接于更高浓度潮霉素 B(350yg/mL)抗性平板上，30°C培养2-3d，采用相同的方法连续转接3次，获得纯培养转化 子菌株。
[02