一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，确切地说是一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方 法。
【背景技术】
[0002] L-丙氨酸是一种非必需脂肪族的非极性氨基酸，但却是人体血液中含量最高的氨 基酸，丙氨酸在生物体的代谢中有重要的作用，在食品工业和医药上都具有重要意义。直 到80年代才在日本形成工业化生产，L-丙氨酸的制备由一开始的蛋白水解提取法、发酵 法到现在流行的酶法。酶法转化即通过富有L-天冬氨酸-B-脱羧酶活力的微生物（如 pseudomonasdacunhae等）细胞催化L-天冬氨酸而得到，其中日本多采用固定化细胞法， 而我国均采用游离完整细胞法。许多微生物都能够发酵生产L-丙氨酸，近年来有文献报 道，利用基因工程手段构建高效生产L-丙氨酸的工程菌，并以葡萄糖为原料生产丙酮酸， 然后微生物将丙酮酸通过丙氨酸脱氢酶发生还原氨化反应或者直接发生氨基转移反应生 成L-丙氨酸。发酵法主要原料葡萄糖成本低，培养基成分简单，产品收率高。丙氨酸脱氢 酶催化的酶促反应如图2所示。氨基转移反应如图3所示。
[0003] 北井等用溶胶棒杆菌7183在10%葡萄糖，1(2即0 40.1%，1%504*711200.04%，酵母浸 出汁0. 1%，玉米浆0. 4%，尿素1.8%，pH7. 6?7. 8的培养基中，在30°C培养60h，可积累 3%DL-丙氨酸。另外用嗜氨小杆菌的精氨酸氧酸抗性菌株（MAH2-22)，可在加有0.001% ZnS04 *7H20的葡萄糖培养基中积累DL-丙氨酸47mg/ml，如用10%葡萄糖加10%乳酸铵的 培养基中培养，贝1J产量达60mg/ml。山田分离了一株耐高温，可在55°C培养，避免污染的凝 结芽孢杆菌，培养43h，生成DL-丙氨酸达29. 5g/L。
[0004] 枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)是芽孢杆菌属的一种，为革兰氏阳性细菌，被 FDA认为是安全菌株，可以代谢多种糖，能够合成多种蛋白酶并能把它们分泌到细胞外。由 于其非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础，是目前原核表达系统中分泌表 达外源蛋白较理想的宿主。在枯草芽孢杆菌中，葡萄糖通过磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶 (PTS)系统被细胞吸收。在细胞中，葡萄糖的代谢途径有：磷酸戊糖途径（ppp途径）、糖酵 解途径（EMP途径）、TCA循环和电子传递链。PPP途径主要提供NADPH，为细胞的各种合成 反应提供还原剂，如参与脂肪酸和固醇类物质的合成。TCA循环主要提供合成脂类和氨基酸 的前体，如a_酮戊二酸和草酰乙酸分别是合成谷氨酸和天冬氨酸的前体；草酰乙酸先转 变成丙酮酸再合成丙氨酸；许多氨基酸通过草酰乙酸可异生成糖。因此可以利用增加氨基 酸前体的方法，提高氨基酸的产量。枯草芽孢杆菌代谢途径如图4所示。
[0005] 丙氨酸脱氢酶首先在枯草芽孢杆菌中被发现，说明枯草杆菌本身能生产L-丙氨 酸，能直接满足食品工业的安全生产要求，同时产生的L-丙氨酸分泌到胞外相比大肠杆菌 表达系统更简化，但是产量偏低。
[0006] 在B.subtilisIBL23中，乳酸和乙酸是丙氨酸发酵的主要副产物，导致碳源流向 乳酸个乙酸削弱了流向丙氨酸的量。基于此，可通过敲除乳酸脱氢酶基因（ldh)和乙酸激 酶基因（ackA)，以增加流向丙氨酸的碳源提高丙氨酸的产量，但基因的敲除可能会对菌株 本身的生长造成一定的影响。本研究的主要内容就是通过基因敲除技术敲除B.subtilis IBL23染色体上丙氨酸合成的支路代谢基因ldh基因和ackA基因从而达到提高L-丙氨酸 产量的目的。然后野生菌和工程菌在LB液体培养基中进行培养，研究其发酵特性并通过 HPLC检测其丙氨酸产量，研究ldh基因的缺失和ackA基因的缺失对丙氨酸产量的影响。并 通过向LB培养基中加入20g/L葡萄糖，探讨葡萄糖对丙氨酸产量的影响。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于通过编号为IBL23_ldh的单基因突变的枯草杆菌的菌株构建， 和构建得到双基因突变的枯草杆菌菌株，编号为IBL23-ldh/ackA，从而提供一种高产丙氨 酸的枯草杆菌工程菌的构建方法。
[0008] 上述目的通过以下方案实现：
[0009] -种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0010](1)、编号为IBL23-ldh的单基因突变的枯草杆菌的菌株构建：
[0011] 以B.subtilisIBL23基因组DNA为模板，PCR扩增得到ldh基因，将ldh基因连 接到T载体pTG19-T上，在大肠杆菌IBL15中转化，蓝白筛选得到重组质粒pTG19-T-ldh; 然后以质粒pKD3为模板，PCR扩增得到氯霉素cm基因，将cm基因用NdeI和EcoRV双酶 切后连接到重组质粒pTG19-T-ldh上，在大肠杆菌IBL15中转化，通过氯霉素抗性筛选得到 打革巴载体pTG19-T_ldh::cm;通过Spizizen法把pTG19-T_ldh::cm在IBL23 中转化，成 功敲除IBL23染色体上的ldh基因，获得了L-乳酸脱氢酶缺失突变型菌株IBL23-ldh;
[0012] (2)、构建得到双基因突变的枯草杆菌菌株：
[0013] 从L-乳酸脱氢酶缺失突变型菌株IBL23_ldh的基因组中PCR扩增得到ackA基因， 连接到T载体PTG19-T上得到重组质粒pTG19-T-ackA，然后以质粒pKD4为模板，PCR扩增得 到卡那霉素kana基因，将kana基因用EagI和Hpal双酶切后连接到重组质粒pTG19-T_ackA 上，在大肠杆菌IBL15中转化，通过卡那霉素抗性筛选得到打祀载体pTG19-T_ackA::kana; 通过Spizizen法把pTG19_T_ackA::kana在IBL23_ldh中转化，成功敲除IBL23_ldh染色 体上的ackA基因，获得了L-乳酸脱氢酶和乙酸激酶缺失突变型菌株IBL23-ldh/ackA。
[0014]所述的一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：（3)研究了 野生型B.subtilis168、单基因突变株IBL23-ldh和双基因突变株IBL23-ldh/ackA的发酵 特性，通过多次传代和抗生素筛选得到了稳定；通过显微镜发现三株菌在形态方面的区别； 通过HPLC分析三株菌中的丙酮酸产量和丙氨酸产量。
[0015] 所述的一种高产丙氨酸的枯草杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：所述的乳酸 脱氢酶基因和乙酸激酶基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸残基序列如下：
[0016] a.乳酸脱氢酶基因（ldh)的核苷酸序列如列表中SEQIDNO. 1所示；乳酸脱氢酶 基因（ldh)的编码的氨基酸残基序列如列表中SEQIDN0. 2所示；
[0017] b.乙酸激酶基因（ackA)的核苷酸序列如列表中SEQIDNO. 3所示；乙酸激酶基 因（ackA)的编码的氨基酸残基序列如列表中SEQIDN0. 4所示。
[0018] 本发明的有益效果为：
[0019] (1)首次用枯草杆菌表达系统生产丙氨酸；
[0020] (2)编号为IBL23_ldh的单基因突变的枯草杆菌的菌株，是敲除乳酸脱氢酶基因 (ldh)的微生物菌株；
[0021] (3)编号为IBL23_ldh/ackA的双基因突变的枯草杆菌菌株，是敲除乙酸激酶基 因（ackA)的微生物菌株。
[0022] (4)首次与野生型B.subtilis168相比，在外源添加葡萄糖条件下，单基因突变 菌株丙氨酸产量达到1. 602g/L，比野生型提高8. 21倍，双基因突变菌株丙氨酸最高产量 3.1048/1，提高15.9倍。
[0023] (5)构建得到编号为IBL23Aldh的单基因突变的枯草杆菌菌株和编号为 IBL23AldhAackA的双基因突变的枯草杆菌菌株。对它们进行了应用，发酵检测其的发酵 特性。实验结果分析，三株菌均为革兰氏阳性菌，菌落形态发生显著变化，短杆状转变为球 形；菌浓和培养基pH方面无显著变化；在添加葡萄糖的条件下丙酮酸产量方面，单基因突 变菌株最高提高1.62倍，双基因突变菌株最高可提高2. 1倍；在添加葡萄糖条件下，单基因 突变菌株丙氨酸产量达到1. 602g/L，比野生型提高8. 21倍，双基因突变菌株丙氨酸最高产 量3. 104g/L，提高15. 9倍。本研究是首次用枯草杆菌表达系统表达丙氨酸，可用于丙氨酸 的生产。
【附图说明】
[0024]图1为枯草芽孢杆菌代谢简图；
[0025] 图2为丙氨酸脱氢酶催化的酶促反应示意图；
[0026] 图3为氨基转移反应；
[0027] 图4为枯草芽孢杆菌氨基酸代谢途径示意图；
[0028] 图5为IBL23_ldh的单基因突变的枯草杆菌菌株阳性筛选电泳图；
[0029] 图6为IBL23_ldh的单基因突变的枯草