一种分子伴侣共表达提高海藻糖合酶基因表达水平的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种分子伴侣协同表达提高海藻糖合酶 基因表达水平的方法。
【背景技术】
[0002] 海藻糖是由两分子葡萄糖以1，1_糖苷键连接而成的非还原性双糖，广泛存在于 细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。海藻糖对生物体具有非常重 要的生物学意义，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳 定剂和保护剂。又因为海藻糖具有甜度适中，性质稳定，不易分解，无还原性等特殊性质，因 此被广泛应用于食品加工业、医药业、农业、生化制品业和化妆品产业中。
[0003] 海藻糖在生物体内的合成途径主要有以下5种：（1)TPS/TPP途径，亦称为OtsA/ OtsB途径：该途径由6_磷酸海藻糖合成酶（Trehalose-6-phosphatesynthase，TPS)催 化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，再在6-磷酸海藻糖磷酸酯 酶（Trehalose-6-phosphatephosphatase，TPP)作用下生成海藻糖。（2)TreS途径：由 海藻糖合酶（Trehalose synthase，Tres)催化麦芽糖分子内部发生重排反应，将a， a-l，4_糖苷键连接的麦芽糖转化为a，a-l，l-糖苷键连接的海藻糖。（3)TreY/TreZ 途径：由麦芽寡糖基海藻糖合成酶（Maltooligosyltrehalosesynthase，TreY)催化麦芽 糊精形成麦芽寡糖基海藻糖，然后由麦芽寡糖基海藻糖水解酶（Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，TreZ)水解麦芽寡糖基海藻糖形成海藻糖。（4)TreT途径：由海藻糖葡 糖基转移合成酶（Trehaloseglycosyltransferringsynthase，TreT)催化NDP-葡萄糖 (ADP-，UDP-和⑶P-葡萄糖）和葡萄糖聚合生成海藻糖。（5)TreP途径：由海藻糖磷酸化酶 (Trehalosephosphorylase，TreP)催化D-葡萄糖与1-磷酸葡萄糖合成海藻糖。
[0004] 在海藻糖的工业生产中，海藻糖合酶与其它海藻糖合成酶相比具有更大的优势， 只需要一种酶一步反应就能够获得海藻糖，简单，快捷，而且其生产原料为更加廉价的麦芽 糖。因此，各国科学家更加关注海藻糖合酶，并对其进行了更为深入的研宄。
[0005] 早在1995年，日本的Nishimoto等从脂肪杆菌属的Pimelobactersp.R48中最早 发现并提纯了海藻糖合成酶。随后不久，Tsusaki等人分别从Pimelobactersp.R48和水 生栖热菌（ThermusaquaticusATCC33923)中克隆得到了海藻糖合酶的基因。随后，在结 核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis),耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis), 施氏假单胞菌（PseudomonasstutzeriCJ38)和嗜热嗜酸的干热嗜酸菌（Picrophilus torridus)中也发现了海藻糖合酶的存在。
[0006] 我国的黄日波等人先后从褐色喜热裂孢菌（Thermobifidafusca)、谷氨酸棒杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)和耐放射异球菌（Deinococcusradiodurans)等中克隆得 到了海藻糖合酶的基因，通过这些基因在大肠杆菌中的异源表达，将其应用于海藻糖的酶 法生产中，并取得了较好的成果。
[0007] 大肠杆菌近年来已被广泛用于工业化生产各种异源蛋白，被认为是最有效的蛋 白表达系统之一，但它还是有少许不足，在大肠杆菌中重组蛋白大量表达时，经常发生错 误折叠，会生成没有活性的包涵体，导致可溶性蛋白表达量降低。解决包涵体问题的方法 有降低表达温度，更换弱启动子或RBS序列，采用分子伴侣协助表达以及提高二硫键折叠 效率。在大肠杆菌中共表达分子伴侣可以有效地帮助目的蛋白折叠，提高外源蛋白表达 量。目前，国内外有很多成功实例表明分子伴侣能显著提高外源蛋白表达水平，Baneyx和 Mujacic(2004)研宄了多种不同功能的分子伴侣的作用机制；AriodeMarco(2007)采用分 子伴侣将重组蛋白可溶性对比对照菌株提高了 70%，蛋白量提高了 42倍，取得了显著的效 果。
[0008] 综上所述，在大肠杆菌中共表达分子伴侣可以协助外源基因的表达，在海藻糖合 酶的研宄中还未有利用分子伴侣提高酶可溶性的方法。
[0009] 本发明提供了七种不同的分子伴侣单独或随机组合的形式，与海藻糖合酶基因共 表达，实验证明分子伴侣对海藻糖合酶基因可溶性表达有很好的效果。
[0010] 本发明提供了一种以sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ联合使用的分子伴侣 方法，尚效表达海澡糖合酶。此反应不但能提尚可溶性蛋白酶量，进而提尚海澡糖的广量， 这种具有优良效果的分子伴侣组合从未被提及或公开过。
[0011] 本发明中所引述的文献、著作、专利和专利申请公开书，其中全部或局部都明确地 和独立地都在本专利申请书引用参考。
【发明内容】
[0012] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种共表达分子伴侣 提高海藻糖合酶基因表达水平的方法。
[0013] 本发明的技术方案如下：
[0014] -种共表达分子伴侣提高海藻糖合酶基因表达水平的方法，其步骤如下：
[0015] (1)嗜热细菌海藻糖合酶基因编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达
[0016] 提取嗜热细菌基因组；根据已知的海藻糖合酶基因编码区序列，设计一对上下游 引物，设计的引物为：
[0017]上游引物 22tttreSNcoF:5'-GGGAAACCATGGGTGGACCCCCTCTGGTACAAG-3'(下划线 为Ncol酶切位点），
[0018]下游引物 22tttreSSalR:5'-GGGAAAGTCGACGGCTTTTCCGGCCTTGGC-3?(下划线为 Sail酶切位点）；
[0019]PCR反应体系为50yL:嗜热细菌基因组模板DNAlyL，上下游引物各2yL， dNTPMix3yL,2XPrimeSTARGCBuffering25yL,DMSO0. 75yL,ddH20 15. 65yL, PrimeSTAR0.6yL;PCR反应条件为 98°C预变性lmin，进行 98°C12s，65°C10s，72°C2min 54s，共9个循环，然后进行98°C12s，57°C30s，72°C2min54s，共21个循环，最后72°C延伸 3min;切胶回收PCR产物并将其克隆至pET-22b上；对所获得的海藻糖合酶进行测序，构建 pET-22b-tttreS质粒并实现其在大肠杆菌中的表达，并筛选一株能高效表达海藻糖合酶的 重组菌；
[0020] (2)分子伴侣sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ基因的克隆及 pCS27-sigma32, pCS27-GroeL-GroeS，pCS27-DnaK-DnaJ，pCS27-sigma32-GroeL-GroeS， pCS27-sigma32-DnaK_DnaJ，pCS27-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ和pCS27-sigma32-GroeL-Gro eS-DnaK-DnaJ重组质粒的构建；
[0021] (3)共表达分子伴侣sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ对海藻糖合酶产量的影 响
[0022] 分别将pET-22b-tttreS和pCS27-sigma32,pCS27-GroeL-GroeS， pCS27-DnaK_DnaJ，pCS27_sigma32-GroeL_GroeS，pCS27_sigma32-DnaK_DnaJ， pCS27-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ和pCS27-sigma32-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ转化到大肠杆 菌Rosetta(DE3)中，诱导表达海藻糖合酶，对其表达条件进行优化，并且鉴定表达产物，分 析其酶学性质。
[0023]步骤（3)中，使用的七种分子伴侣为pCS27-sigma32、pCS27-GroeL-GroeS、 pCS27_DnaK_DnaJ、pCS27-sigma32-GroeL_GroeS、pCS27-sigma32-DnaK_DnaJ、 pCS27-GroeL-GroeS-DnaK_DnaJ和pCS27-sigma32-GroeL-GroeS-DnaK_DnaJ，表达条件是： 诱导时间10?50h，诱导温度4?16°C，诱导剂IPTG终浓度为0?1.OmM/L。
[0024] 所述的方法，步骤（3)中，所述优化的表达条件是：诱导表达时间24h，诱导温度 16°C，诱导剂IPTG终浓度为0. 5mM/L。
[0025]所述的方法，共表达分子伴侣优选pCS27-sigma32-GroeL-GroeS-DnaK_DnaJ。
[0026] 本发明将在大肠杆菌海藻糖合酶的重组菌中转化含分子伴侣sigma32、GroeL、 GroeS、DnaK和DnaJ基因编码区的质粒，使海藻糖合酶与分子伴侣共表达，提高了海藻糖合 酶的表达水平。
【附图说明】
[0027] 图1为嗜热细菌海藻糖合酶基因编码区的克隆；M:DNA标准分子量；1 :PCR扩增产 物。
[0028] 图2为大肠杆菌sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ基因编码区的克隆；M:DNA 标准分子量；1-4 :sigma32的PCR扩增产物；5-8:GroeL的PCR扩增产物；9-12:GroeS的PCR 扩增产物；13-16:DnaK的PCR扩增产物；17-20:DnaJ的PCR扩增产物。
[0029] 图3为重组海藻糖合酶的SDS-PAGE电泳分析；a和b分别表示海藻糖合酶的可溶 蛋白和包涵体蛋白；M:DNA标准分子量；L1 :重组海藻糖合酶（未添加分子伴侣）；L2 :重组 海藻糖合酶（与分子伴侣sigma32共表达）；L3 :重组海藻糖合酶（与分子伴侣GroeL/S共 表达）；L4 :重组海藻糖合酶（与分子伴侣DnaK/J共表达）；L5 :重组海藻糖合酶（与分子 伴侣sigma32和GroeL/S共表达）；L6 :重组海藻糖合酶（与分子伴侣sigma32和DnaK/J 共表达）；L7 :重组海藻糖合酶（与分子伴侣sigma32、GroeL/S和DnaK/J共表达）；L8 :重 组海藻糖合酶（与分子伴侣GroeL/S和DnaK/J共表达）。
[0030] 图4为高表达海藻糖合酶大肠杆菌重组子最适诱导条件的优化结果。
[0031] 图5为三种分子伴侣组合与海藻糖合酶共表达的重组菌的海藻糖合酶最适反应 pH〇
[0032] 图6为添加金属离子对三种分子伴侣组合与海藻糖合酶共表达的重组菌的海藻 糖合酶反应的影响。
[0033] 图7为添加还原剂对三种分子伴侣组合与海藻糖合酶共表达的重组菌的海藻糖 合酶反应的影响。
[0034] 图8为三种分子伴侣组合与海藻糖合酶共表达的重组菌的海藻糖合酶最适反应 温度。
[0035] 图9为三种分子伴侣组合与海藻糖合酶共表达的重组菌的海藻糖合酶最适反应 时间。
[0036] 图10为三种分子伴侣组合与海藻糖合酶共表达的重组菌的海藻糖合酶最适反应 底物浓度。
【具体实施方式】
[0037] 通过以下的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细解释及展述。
[0038] 实施例1嗜热细菌海藻糖合酶基因（tttreS)编码区的克隆及其在大肠杆菌中的 表达
[0039] 1、引物设计及PCR反应
[0040] 嗜热细菌（Thermusthermophilus)HB27基因组由美国乔治亚大学闫亚军老师提 供，此菌株可购置于中国普通微生物菌种保藏中心。
[0041] 根据已知的嗜热细菌来源的海藻糖合酶编码区序列设计一对上下游引物，上游自 起始密码子处设计，下游引物至终止密码子处设计，设计的引物为：
[0042]上游引物 22tttreSNcoF:5' -GGGAAACCATGGGTGGACCCCCTCTGGTACAAG-3' (下划线 为Ncol酶切位点），
[0043]下游引物 22tttreSSalR:5'-GGGAAAGTCGACGGCITTTCCGGCCTTGGC-3'（下划线为 Sail酶切位点）；
[0044] PCR反应体系为50yL:嗜热细菌基因组模板DNAlyL，上下游引物各2yL，dNTP Mix3yL,2XPrimeSTARGCBuffering25yL,DMS0 0. 75yL,ddH20 15. 65yL,PrimeSTAR 0. 6uL〇
[0045]PCR反应条件为 98°C预变性lmin，进行 98°C12s，65°C10s，72°C2min54s，共 9 个 循环，然后进行98°〇128,57°〇308,721：2111111548，共21个循环，最后721：延伸3111111。反 应结束后将PCR产物进行1%琼脂糖（lg/lOOmL)电泳，结果表明，在3000bp下面有一特异 性条带（图1)。
[0046] 2、PCR产物回收及纯化
[0047] 米用OMEGA公司MicroEluteGelExtractionKit柱式DNA胶回收试剂盒回收 PCR产物，具体操作步骤为：
[0048] 按照步骤1所述，制备100 y LPCR反应液，电泳后切胶，步骤如下：
[0049] a、PCR产物经1% (