LPLLWSPQRREGPGLFARTHGQPGYFYELSLDPGFYRLLLARLK EGFEGRSLRAYYRGRHPGPVPEAVDLLRPGLAAGEGVWVQLGLVQDGGLDRTERVLPRLDLPWVLRPEGGLFWERGA SRRVLALTGSLPPGRPQDLFAALEVRLLESLPRLRGHAPGTPGLLPGALHETEALVRLLGVRLALLHRALGEVEGVE GGHPLLGRGLGAFLELEGEVYLVALGAEKRGAVEEDLARLAYDVERAVHLALEALEAELWAFAEEVADYLHAAFLQA YRSALPEEALEEAGWTRHMAEVAAEHLHREERPARKRIHERWQAKAGKA
[0077] 5、海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的表达
[0078] a、将保藏好的测序正确的DH5a菌株接菌于4mL试管，过夜培养，提取重组质粒 pET-22b_tttreS，采用OMEGA公司PlamidMinikitI试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤 参见pET-22b质粒的小量提取。
[0079] b、将a中的10yL重组质粒与50yL的大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞混合， 冰浴30min;42°C热激90s，立即重置于冰上2min，再加入500yLLB液体培养基，37°C培养 40min;涂布于LB固体平板（含100yg/mL氨苄青霉素），37°C培养过夜。
[0080] c、海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的表达
[0081] 挑取步骤c中平板上长出的单菌落，接种于装有4mLLB的试管中（含50yg/mL硫 酸卡那霉素和100Ug/mL氨苄青霉素），于37°C。200rpm振荡培养过夜，转接于装有50mL TB培养基（含50yg/mL硫酸卡那霉素和100yg/mL氨苄青霉素）的250mL三角瓶中，于 37°C，220rpm培养至 0D_为 0.6 ?0.8。添加IPTG至终浓度为 0.5mM/L，于 16°C，180rpm 继续培养30h。培养24h后取菌液置于50mL离心管中，4°C，6000rpm离心lOmin，倒掉上清， 收集菌体。平行发酵数瓶菌液，按时间点分别取菌液离心收集菌体（10h、20h、30h、40h和 50h) 〇
[0082] 将离心后的菌体用10mL1XPBS磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上进行超声破碎，功 率采用130KW，超声3s，间歇5s，总共20min，然后采用SDS-PAGE电泳和活性检测确定重组 蛋白的表达和酶活力，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
[0083] d、海藻糖合酶活性检测
[0084] 在50°C条件下，以过量的浓度为20%的麦芽糖溶液为底物，每分钟转化生成 1 y mol海藻糖的量为1个酶活单位U。
[0085] 吸取lmL的粗酶液，加入到250mL三角瓶中，然后加入20mL麦芽糖溶液（20% )， 50°C振荡反应30min，100°C沸水浴lOmin灭活。以标准空白样为空白对照，高效液相色谱测 定海藻糖生成量。结果表明，对所长出的重组子进行诱导表达后酶活测定，筛选出一株能高 表达海藻糖合酶的重组菌，酶活力为1276U，比活力为1. 996ymol/min/mg。
[0086] 实施例2分子伴侣sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ基因编码区的克隆及 pCS27-sigma32, pCS27-GroeL-GroeS，pCS27-DnaK-DnaJ，pCS27-sigma32-GroeL-GroeS， pCS27-sigma32-DnaK_DnaJ，pCS27-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ和pCS27-sigma32-GroeL-Gro eS-DnaK-DnaJ重组质粒的构建
[0087] 1、大肠杆菌BL21(DE3)总基因组的提取
[0088] 将实验室保存的大肠杆菌BL21 (DE3)接种到到4mL液体LB培养基中，220rpm振 荡培养16h左右。收集菌液加到2mL离心管中，室温，12000rpm离心lmin，弃尽上清，进行 基因组提取。加入180yLTEBuffer，重悬菌体，再加入20yL50mg/ml溶菌酶溶液，30°C 水浴放置l〇min，室温，12000rpm离心5min，除掉上清，加200yLBufferBTL，振荡重悬菌 体，再加25?40mg玻璃珠，室温，12000rpm振荡5min，加25yL蛋白酶K溶液，混匀，55°C 振荡水浴放置lh。然后加入5yLRNA酶A，颠倒几次充分混合，室温放置10?30min，室 温，12000rpm离心5min，小心吸入上层，转移到无菌小离心管中，除去不溶物。加220yL BufferBDL，短时漩涡振荡混合，65°C水浴放置10min，然后添加220yL纯乙醇，完全混合， 室温，12000rpm离心20s，移至吸附柱中，静置2min，室温，12000rpm离心lmin，弃去收集管 中液体，加500yLBufferHB至吸附柱中，静置2min，室温，12000rpm离心lmin，弃去收集 管中液体。再加入700yLDNAWashBuffer，室温，12000rpm离心lmin，弃去收集管中液 体，重复此步骤一次。然后将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温瞭干15min。向空吸附 柱中加入50yL超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min。离心管中的溶液即为基因组 DNA水溶液。取3yL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品 于-20 °C贮存。
[0089] 2、sigma32、GroeL、GroeS，DnaK和DnaJ基因编码区的PCR扩增
[0090] 根据GenBank上公布的大肠杆菌sigma32、GroeL、GroeS，DnaK和DnaJ基因序列 设计下列引物：
[0091] 三种分子伴侣单独使用，与海藻糖合酶共表达的引物：
[0092] Sigma32上游引物27rpoHKpnF :5' -GGGAAAGGTACCATGGCAGCACGCAATTTTTTCATC-3' (下划线为Kpnl酶切位点）
[0093] Sigma32下游引物27rpoHBamHR :5' -GGGAAAGGATCCTGACTGACAAAATGCAAAGTTTAGCT TTAG-3'（下划线为BamHI酶切位点）
[0094] GroEL上游引物27groELSalF :5' -GGGAAAGTCGACATGGCAGCTAAAGACGTAAAATTCG-3' (下划线为Sail酶切位点）
[0095]GroEL下游引物 27groELHindR:5' -GGGAAAAAGCTTTTACATCATGCCGCCCATG-3' (下 划线为Hindlll酶切位点）
[0096]GroES上游引物 27groESHindF:5'-GGGAAAAAGCTTAGGAGAATGAATATTCGTCCATTGCAT GATCG-3'（下划线为Hindlll酶切位点）
[0097]GroES下游引物 27groESBamHR:5' -GGGAAAGGATCCTTACGCTTCAACAATTGCCAGAATG-3 '（下划线为BamHI酶切位点）
[0098]DnaK上游引物 27dnaKKpnF: 5 ' -GGGAAAGGTACCATGGGTAAAATAATTGGTATCGACCTGG-3 '（下划线为Kpnl酶切位点）
[0099]DnaK下游引物 27dnaKSalR:5'-GGGAAAGTCGACTTATTTTTTGTCTTTGACTTCTTCAAATTC AGCG-3'（下划线为Sail酶切位点）
[0100] DnaL上游引物 27dnaJSalF: 5 '-GGGAAAGTCGACAGGAGAATGGCTAAGCAAGATTATTACGGA GATT-3'（下划线为Sail酶切位点）
[0101] DnaL下游引物 27dnaJBamHR:5' -GGGAAAGGATCCTTAGCGGGTCAGGTCGTC-3?(下划线 为BamHI酶切位点）
[0102] 三种分子伴侣随机组合使用，与海藻糖合酶共表达的引物（sigma32上下游引物 不变）：
[0103] GroeL上游引物 27LpgpgTSpeF:5'-GGGAAAACTAGTAATTGTGAGCGGATAACAATTGACATT G-3'（下划线为Spel酶切位点）
[0104]GroeL下游引物 27LpgpgTSacR: 5 ' -GGGAAAGAGCTCACAACAGATAAAACGAAAGGCCCA-3 ' (下划线SacI酶切位点）
[0105]DnaK上游引物 27LpdpdTXbaF:5'-GGGAAATCTAGAAATTGTGAGCGGATAACAATTGACATTG -3'（下划线为Xbal酶切位点）
[0106]DnaK下游引物 27LpdpdTSpeR:5 ' -GGGAAAACTAGTACAACAGATAAAACGAAAGGCCCA-3 ' (下划线为Spel酶切位点）
[0107]PCR反应体系为50yL:嗜热细菌基因组模板DNA1yL，上下游引物各2yL，dNTP Mix3yL,2XPrimeSTARGCBuffering25yL,DMS0 0. 75yL,ddH20 15. 65yL,PrimeSTAR 0. 6uL〇
[0108]PCR反应条件为 98°C预变性lmin，进行 98°C12s，65°C10s，72°Cxs，共 9 个循环， 然后进行98°C12s，55°C30s，72°Cxs，共21个循环，最后72°C延伸3min。x根据片段长度 设定大约lmin延伸1000bp。反应结束后将PCR产物进行1%琼脂糖电泳，结果表明，在正 确位置有一特异性条带（图2)。
[0109] 3、PCR产物回收及纯化
[0110] 米用OMEGA公司MicroEluteGelExtractionKit柱式DNA胶回收试剂盒回收 PCR产物，具体操作步骤按实施例1步骤2所述的方法进行。
[0111] 4、pCS27质粒小量提取
[0112] 采用OMEGA公司PlamidMinikitI试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤按实施 例1步骤3所述的方法进行。
[0113] 5、pCS27-sigma32，pCS27-GroeL-GroeS，pCS27-DnaK-DnaJ， pCS27-sigma32-GroeL-GroeS，pCS27-sigma32-DnaK_DnaJ，pCS27-GroeL-GroeS-DnaK_DnaJ 和pCS27-sigma32-GroeL-GroeS-DnaK_DnaJ重组质粒的构建
[0114] ①双酶切
[0115] 将本实施例步骤3获得的PCR切胶回收产物（sigma32, GroeL，GroeS，DnaK和DnaJ 基因编码区）和PCS27质粒均用相应的限制性内切酶双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳 纯化后回收备用（胶回收采用OMEGA公司MicroElute Gel Extraction Kit柱式DNA胶回 收试剂盒方法进行）。
[0116]PCR切胶回收产物和质粒的酶切体系为30yL:回收后的PCR片段20yL，ddH20 5yL，限制性内切酶11yL，限制性内切酶21yL，lOXbuffer3yL。以上操作在冰上进行， 混匀后在水浴锅上于37 °C反应lh。
[0117] ②DNA连接反应
[0118] 将凝胶回收后的双酶切PCR产物（由步骤①获得）和pCS27载体连接，连接体 系为10yL:三种分子伴侣单独和海藻糖合酶共表达时，双酶切后的PCR产物（sigma32、 GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ基因编码区）5yL，双酶切后的pET-22b3yL，10XBuffer 1yL，T4连接酶1yL。三种分子伴侣两两随机组合和海藻糖合酶共表达时，双酶切后的 PCR产物（sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ基因编码区）2yL，双酶切后的pCS272yL， lOXBufferlyL，T4连接酶lyL。三种分子伴侣共同和海藻糖合酶共表达时，双酶切 后的PCR产物（sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ基因编码区）1.5yL，双酶切后的 PCS270. 5yL，10XBufferlyL，T4连接酶lyL。以上操作在冰上进行，混匀后在金属浴上 于22°C连接lh。
[0119] ③连接产物的转化和鉴定
[0120] 将本实施例步骤5所获得的10yL连接产物转化50yL的大肠杆菌DH5a感受态 细胞中，对转化后长出的菌落进行菌落PCR鉴定和测序鉴定。测序结果表明，所获得的大肠 杆菌sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ基因编码区序列与GenBank上已知的序列100% 同源。成功构建的质粒命名为pCS27-sigma32,pCS27-GroeL-GroeS，pCS27-DnaK-DnaJ， pCS27-sigma32-GroeL-GroeS，pCS27-sigma32-DnaK_DnaJ，pCS27-GroeL-GroeS-DnaK_DnaJ 和pCS27-sigma32-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ〇
[0121] 大肠杆菌sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ基因编码区与pCS27连接克隆测 序结果如下：
[0122] sigma32：
[0123] TTACGCTTCAATGGCAGCACGCAATTTTTTCATCGCGTTCTTTTCCAGCTGGCGTACACGCTCAGCGGA AACGCCG