lg/100mL)琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切 下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5mL离心管中，称量其重量，加入等重量的Binding Buffer，放于65°C水浴中至胶完全溶化。
[0050] b、将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心lmin
[0051 ] c、将离心下来的收集管中液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心 lmin，倒掉收集管中液体。
[0052]d、向吸附柱中加入700yLSPWWashBuffer，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中 液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次。
[0053]e、将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温瞭干15min。
[0054]f、向空吸附柱中加入30yL超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min。
[0055] g、离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液。
[0056] h、取3yL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品 于-20 °C贮存。
[0057] 3、pET_22b质粒小量提取
[0058] 采用OMEGA公司Plamid Mini kit I试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤为：
[0059] 将实验室保存的含有pET_22b质粒的大肠杆菌DH5a接种到到4mL含有氨苄青霉 素（100yg/mL)的液体LB培养基中，振荡培养16h左右。取出菌液加到2mL离心管中，常 温，12000rpm离心lmin，弃尽上清。加入250yL溶液I，吹打混匀。加入250yL溶液II，上 下轻轻颠倒数次，混匀，常温静置2min。加入350yL溶液III，上下轻轻颠倒数次，使裂解 物分散均匀，常温静置2min，常温12000rpm离心lOmin。转移上清至吸附柱中，静置5min， 常温，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体。再加入500yLHBBuffer到吸附柱中，静 置5min，常温，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体。加入700yLDNAWashBuffer 到吸附柱中，常温12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中， 重复此步骤一次。然后将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温瞭干15min。向空吸附柱中 加入30yL超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min。离心管中的溶液即为质粒DNA水 溶液。取3yL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20°C 贮存。
[0060] 4、海藻糖合酶基因的克隆
[0061] a、PCR切胶回收产物和pET-22b质粒的双酶切
[0062]PCR切胶回收产物（tttreS基因编码区）和pET-22b质粒均用限制性内切酶EcoRI 和Sail双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收备用（胶回收采用OMEGA公司 MicroEluteGelExtractionKit柱式DNA胶回收试剂盒方法进行）。
[0063]PCR切胶回收产物和pET-22b质粒的酶切体系均为30yL:DNA片段和质粒均为 20yL，ddH20 5yL，EcoRIlyL，SalIlyL，10Xbuffer3yL。以上操作在冰上进行，混匀 后在水浴锅上于37°C反应lh。
[0064] b、DNA连接反应
[0065] 将凝胶回收后的双酶切PCR产物（由步骤2获得）和pET_22b载体连接，连接体 系为10yL:双酶切后的PCR产物5yL，双酶切后的pET-22b3yL，10XBufferlyL，T4连 接酶1yL。以上操作在冰上进行，混匀后在金属浴上于22°C连接lh。
[0066] c、大肠杆菌DH5 a感受态细胞的转化
[0067] 将b中的10yL连接产物与50yL的大肠杆菌DH5a感受态细胞混合，冰浴30min; 42°C热激90s，立即重置于冰上2min，再加入500yLLB液体培养基，37°C培养40min;涂布 于LB固体平板（含100yg/mL氨苄青霉素），37°C培养过夜。
[0068] d、菌落PCR初步鉴定
[0069]用移液枪挑取少量单菌落至含20yL灭菌水的PCR管中，混匀后取出10yL保存， 其余的加入扩增DNA片段的上下游引物22tttreSEcoRF/22tttreSSalR各1yL、0. 5yL水 和 12.5rTaq。
[0070] 混合均匀后，按以下条件进行PCR反应：95°C30s，55°C30s，72°C2min54s，共35个 循环，最后再72°C延伸7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测验证。验证正确的菌落。
[0071] e、DNA测序及检验实验的正确性
[0072] 将菌落PCR鉴定为阳性克隆的无菌水保存的菌进行4mL试管12?16h培养，并送 往生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA测序。将测序后获得的序列用DNAMAN软 件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性。测序结果表明，所获得的DNA片段含 有海藻糖合酶基因编码区。该海藻糖合酶基因编码区序列全长为2989bp，编码995个氨基 酸。成功构建的质粒命名为pET-22b-tttreS。
[0073] 嗜热细菌海藻糖合酶基因编码区测序结果如下：
[0074] GTGGACCCCCTCTGGTACAAGGACGCGGTGATCTACCAGCTCCACGTCCGCTCCTTCTTTGACGCCAAC AACGACGGCTACGGGGACTTTGAGGGCCTGAGGCGGAAGCTTCCCTACTTGGAGGAGCTCGGGGTCAACATCCTCTG GCTCATGCCCTTCTTCCAGTCCCCCTTGAGGGACGACGGATACGACATCTCCGACTACTACCAGATCCTCCCCGTCC ACGGGACCCTGGAGGACTTCAAGCGCTTCCTGGACGAGGCCCACGGCCGGGGGATGAAGGTGATCATTGAGCTCGTC CTGAACCACACCTCCATTGACCACCCCTGGTTCCAGGAAGCGAGGAAGCCAGGAAGCCCCATGCGGGACTGGTACGT GTGGAGCGACACCCCGGAGAAGTACAAGGGGGTCCGGGTCATCTTCAAGGACTTTGAAACCTCCAACTGGACCTTTG ACCCCGTGGCCAAGGCCTACTACTGGCACCGCTTCTACTGGCACCAGCCCGACCTCAACTGGGACAACCCCGAGGTG GAGAAGGCCATCCACCAGGTCATGTTCTTCTGGGCCGACCTGGGGGTGGACGGCTTCCGCCTGGACGCCATCCCCTA CCTCTACGAGCGGGAGGGGACCTCCTGCGAGAACCTCCCCGAGACCATTGAGGCGGTGAAGCGCCTGAGGAAGGCCC TGGAGGAGCGCTACGGCCCCGGGAAGATCCTCCTCGCCGAGGCCAACATGTGGCCGGAGGAGACCCTCCCCTACTTC GGGGACGGGGACGGGGTCCACATGGCCTACAACTTCCCCCTGATGCCCCGGATCTTCATGGCCCTAAGGCGGGAGGA CCGGGGGCCCATTGAAACCATGCTCAAGGAGACGGAGGGGATCCCCGAGACCGCCCAGTGGGCCCTCTTCCTCCGCA ACCACGACGAGCTCACCCTGGAGAAGGTCACGGAGGAGGAGCGGGAGTTCATGTACGAGGCCTACGCCCCCGACCCC AAGTTCCGCATCAACCTGGGGATCCGCCGCCGCCTCATGCCCCTCCTCGGGGGCGACCGCAGGCGGTACGAGCTCCT CACCGCCCTCCTCCTCACCCTGAAGGGCACGCCCATCGTCTACTACGGGGACGAGATCGGCATGGGGGACAACCCCT TCCTCGGGGACCGGAACGGGGTCCGGACCCCCATGCAGTGGTCCCAAGACCGCAACGCCGGCTTCTCCCGCGCCCCC TACCACGCCCTCTTCCTTCCCCCCGTGAGCGAGGGGCCCTACAGCTACCACTTCGTCAACGTGGAGGCCCAGCGGGA AAACCCCCACTCCCTCCTGAGCTTCAACCGCCGCTTCCTCGCCCTGAGGAACCAGCACGCCAAGATCTTCGGCCGGG GGAGCCTCACCCTTCTTCCCGTGGAGAACCGGCGCGTCCTCGCCTACCTGAGGGAGCACGAGGGGGAGCGGGTCCTG GTGGTGGCCAACCTCTCCCGCTACACCCAGGCCTTTGACCTCCCCTTGGAGGCCTACCAAGGCCTCGTCCCCGTGGA GCTCTTCTCGCAGCAACCCTTCCCCCCGGTGGAGGGGCGCTACCGCCTGACCCTGGGCCCCCACGGTTTCGCCCTCT TCGCCCTGAAACCCGTGGAGGCGGTGCTCCACCTCCCCTCCCCCGACTGGGCCGAGGAGCCCGCCCCCGAGGAGGCC GACCTGCCCCGGGTCCACATGCCCGGGGGGCCGGAGGTCCTCCTGGTGGACACCCTGGTCCACGAAAGGGGGCGGGA GGAGCTCTTAAACGCCCTCGCCCAGACCCTGAAGGAGAAGAGCTGGCTCGCCCTCAAGCCGCAGAAGGTGGCCCTCC TGGACGCCCTCCGCTTCCAGAAGGACCCGCCCCTTTACCTCACCCTGCTCCAGCTGGAGAACCACAGGACCCTCCAG GTCTTCCTCCCCCTCCTCTGGTCCCCCCAGAGGAGGGAAGGCCCCGGCCTCTTCGCCCGCACCCACGGCCAGCCCGG CTACTTCTACGAGCTCTCCTTGGACCCGGGCTTCTACCGCCTCCTCCTCGCCCGCCTCAAGGAGGGGTTTGAGGGGC GGAGCCTCCGGGCCTACTACCGCGGCCGCCACCCGGGTCCCGTGCCCGAGGCCGTGGACCTCCTCCGGCCGGGACTC GCGGCGGGGGAGGGGGTCTGGGTCCAGCTCGGCCTCGTCCAAGACGGGGGCCTGGACCGCACGGAGCGGGTCCTCCC CCGCCTGGACCTCCCCTGGGTCCTCCGGCCCGAAGGGGGCCTCTTCTGGGAGCGGGGCGCCTCCAGAAGGGTCCTCG CCCTCACGGGAAGCCTCCCCCCGGGCCGCCCCCAGGACCTCTTCGCCGCCCTGGAGGTCCGGCTCCTGGAAAGCCTT CCCCGCCTCCGGGGGCACGCCCCCGGGACCCCAGGCCTCCTTCCCGGGGCCCTGCACGAGACCGAGGCCCTGGTCCG CCTCCTCGGGGTGCGCCTCGCCCTCCTCCACCGGGCCCTTGGGGAGGTGGAGGGGGTGGAGGGGGGCCACCCCCTCC TAGGCCGCGGCCTCGGGGCCTTCCTGGAGCTGGAGGGGGAGGTGTACCTCGTGGCCCTGGGCGCGGAGAAGCGGGGC GCGGTGGAGGAGGACCTGGCCCGCCTGGCCTACGACGTGGAGCGGGCCGTGCACCTCGCCCTCGAGGCCCTGGAGGC GGAGCTTTGGGCCTTCGCCGAGGAGGTGGCCGACTACCTCCACGCCGCCTTCCTCCAAGCCTACCGCTCCGCCCTCC CCGAGGAGGCCCTGGAGGAGGCGGGCTGGACGCGGCACATGGCCGAGGTGGCGGCGGAGCACCTCCACCGGGAGGAG AGGCCCGCCCGCAAGCGCATCCACGAGCGCTGGCAGGCCAAGGCCGGAAAAGCCTAG
[0075] 其氨基酸序列如下：
[0076] VDPLWYKDAVIYQLHVRSFFDANNDGYGDFEGLRRKLPYLEELGVNILWLMPFFQSPLRDDGYDISDYY QILPVHGTLEDFKRFLDEAHGRGMKVIIELVLNHTSIDHPWFQEARKPGSPMRDWYVWSDTPEKYKGVRVIFKDFET SNWTFDPVAKAYYWHRFYWHQPDLNWDNPEVEKAIHQVMFFWADLGVDGFRLDAIPYLYEREGTSCENLPETIEAVK RLRKALEERYGPGKILLAEANMWPEETLPYF⑶⑶GVHMAYNFPLMPRIFMALRREDRGPIETMLKETEGIPETAQW ALFLRNHDELTLEKVTEEEREFMYEAYAPDPKFRINLGIRRRLMPLLGGDRRRYELLTALLLTLKGTPIVYYGDEIG MGDNPFLGDRNGVRTPMQWSQDRNAGFSRAPYHALFLPPVSEGPYSYHFVNVEAQRENPHSLLSFNRRFLALRNQHA KIFGRGSLTLLPVENRRVLAYLREHEGERVLVVANLSRYTQAFDLPLEAYQGLVPVELFSQQPFPPVEGRYRLTLGP HGFALFALKPVEAVLHLPSPDWAEEPAPEEADLPRVHMPGGPEVLLVDTLVHERGREELLNALAQTLKEKSWLALKP QKVALLDALRFQKDPPLYLTLLQLENHRTLQVF