一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用，特别涉及 利用毕赤酵母表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法与应 用，属于微生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖广泛分布于细菌、藻类、酵母、低等植物、昆虫和其它无脊椎动物中，是国际 上最近开发的主要低聚糖之一。海藻糖可以在细胞处于饥饿、干燥、高温、高渗透压及有毒 试剂等胁迫环境时，有效地维持细胞内质膜和蛋白质的稳定，在保护基因工程酶类、各种病 毒、疫苗、抗体、蛋白质因子、核酸等方面取得令人振奋的结果。
[0003]目前，海藻糖制取上存在困难，因此使海藻糖的价格较高，且生产量低，远不能满 足市场需求。双酶法在1991年由Lama等人首次报道，即采用麦芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase)两种酶利用淀粉为底物生产海藻糖的方 法。该方法中第一种酶用来催化聚合度（DP)大于3的麦芽糊精，转化其还原端的a-1，4 连接键生成a-1，1连接键。第二种酶专一性催化水解a-1，4键生成的a-1，1键海藻糖 和低分子量的麦芽低聚糖。各国科学家一致认为生产海藻糖的经济方法是利用双酶法转化 廉价的淀粉底物一步生成海藻糖，但近十年来产海藻糖合酶菌株难以实验发酵生产海藻糖 的经济目标。
[0004]目前生产两种酶的大肠杆菌基因工程菌只能实现胞内表达，不仅需要破碎，而且 在下游分离纯化时存在较多障碍。且大肠杆菌含有内毒素，生产出的麦芽寡糖基海藻糖合 成酶（MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase)不适合在医药食品工业使用。
[0005] 毕赤酵母是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。其具有易培养、繁殖 快的优点，毕赤酵母具有乙醇氧化酶基因诱导性强启动子，可调控外源基因的表达，便于基 因工程操作和高密度发酵，成为微生物表面展示系统极有应用前景的宿主菌。酵母表面展 示可以对外源蛋白进行折叠，糖基化修饰，利用酵母细胞内的蛋白转运机制可以将靶蛋白 表达并定位到酵母细胞表面，表达的蛋白具有独立的空间构像。宿主酵母的细胞器复杂，利 于真核蛋白表达，且不含内毒素和特异性病毒，对其进行高密度发酵，发酵工艺简单，成本 低廉，安全可靠。
[0006] 但目前尚未有成功毕赤酵母表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻 糖水解酶的报道，主要是由于两种酶同时表面展示，分子量较大，会对酵母本身产生影响， 且二者表达过程中会产生影响，进而降低二者的酶反应效率。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种利用毕赤酵母表面展示麦芽寡糖基海藻糖 合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法与应用。
[0008] 本发明构建的表面展示工程菌可以将麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase)-麦芽 寡糖基海藻糖水解酶（MTHase)融合酶稳定的表面展示于毕赤酵母表面的基因工程菌，菌 体可以直接作为全细胞催化剂直接与底物反应，无需破碎细胞和提纯麦芽寡糖基海藻糖合 成酶（MTSase)-麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase)融合酶，使生产海藻糖更加方便。
[0009] 本发明技术方案如下：
[0010] -种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法，包括如下步骤：
[0011] (1)以ArthrobacterSP.L77基因组为模板，F1和R1为引物，通过PCR扩增，获得 MTSase基因片段；
[0012] 所述F1和R1的核苷酸序列如下所示：
[0013] F1:GAATTCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC
[0014] R1：CCTCGGGGGTGAACGTGC
[0015] (2)Arthrobactersp.L77基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR扩增，获得 MTHase基因片段；
[0016] 所述F1和R1的核苷酸序列如下所示：
[0017] F2:ATGAGTTCGCCATTCGAGGT
[0018] R2:GCGGCCGCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG
[0019] (3)将步骤（1)制得的MTSase基因片段与步骤⑵制得的MTHase基因片段经重 叠PCR扩增，电泳纯化，制得麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶目 的基因；
[0020] 经检测，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，可以表达的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
[0021] 重叠PCR的上游引物为F2,下游引物为R1 ;
[0022] (4)酵母基因组提取试剂盒提取酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae,CICC 32919)基因组DNA为模板，F3和F4为引物，通过PCR扩增，获得产物3Pirlp基因片段；
[0023] 所述F3和F4的核苷酸序列如下所示：
[0024] F3 ：GGACTAGTCAGAGAGCCGCTGCTAT
[0025] F4：GCTCTAGATTAACAGTTGAGCAAATCGAT
[0026] (5)将步骤（3)制得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融 合酶目的基因经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切后，与同样经限制性内切酶EcoRI 和NotI双酶切的pPIC-ZaA载体连接，制得异源表达载体pPIC-ZaA-MTSase-MTHase; 将异源表达载体pPIC-ZaA-MTSase-MTHase经限制性内切酶SpeI、NotI双酶切后， 与经限制性内切酶SpeI、NotI双酶切的Pirlp基因片段连接，制得异源表达载体 pPIC-ZaA-MTSase-MTHase-Pirlp；
[0027] (6)将步骤（5)制得的异源表达载体pPIC-ZaA-MTSase-MTHase-Pirlp线性化后， 采用电转化法转化毕赤酵母GS115,经筛选，获得表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的 重组毕赤酵母。
[0028] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中，制备扩增MTSase基因片段的PCR体系如下：
[0029] HifiMix10y1，弓| 物 Fl(10yM)10y1，弓| 物 Rl(10yM)10ul，ddH20 7y1， Arthrobactersp.L77基因组模板 Templatelyl〇
[0030]根据本发明优选的，所述步骤（1)中，制备MTSase基因片段的PCR扩增程序如下：
[0031] 95°C变性 5min;95°C变性 30sec，54°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，共 30 个循环； 72°C延伸 10min，4°C保存。
[0032] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，制备MTHase基因片段的PCR扩增体系如下：
[0033] HifiMix10y1，引物F2(10yM) 10y1，引物R2(10yM) 10y1，ddH20 7y1， Arthrobactersp.L77 基因组模板Templatelyl〇
[0034] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，制备MTHase基因片段的PCR扩增程序如下：
[0035] 95°C变性 5min;95°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2min，共 30 个循环； 72°C延伸 10min，4°C保存。
[0036] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中，制备MTSase-MTHase融合基因片段的重叠 PCR扩增体系如下：
[0037] HifiMix10y1，引物Fl(10yM)10y1，引物R2(10yM)10y1，ddH20 7y1， MTSase基因片段和MTHase基因片段1y1。
[0038] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中，制备MTSase-MTHase融合基因片段的重叠 PCR扩增程序如下：
[0039] 95°C变性 5min;95°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，5 个循环；然 后，补加引物F1和R2 ;95°C变性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸4. 5min，共30个循环； 72°C延伸 10min，4°C保存。
[0040] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中，制备GenBank序列号为D13740的目的基因 Pirlp的PCR扩增体系如下：
[0041] HifiMix10y1，引物F3(10yM)10y1，引物F4(10yM)10y1，ddH20 7y1，酿酒 酵母基因组模板Template1y1。
[0042] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中，制备GenBank序列号为D13740的目的基因 Pirlp的PCR扩增程序如下：
[0043] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 2min，30 个循环；72°C最 终延伸10min，4°C保存。
[0044] 上述方法制得的表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的 重组毕赤酵母在制备海藻糖中的应用。
[0045] 上述应用，步骤如下：
[0046] (i)将表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的毕赤酵母 接种于含有浓度为40~60yg/mL博来霉素（Zeoc