具有头孢类药物抗性的乳酸菌及其制剂的制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，特别涉及具有头孢类药物抗性的乳酸菌及其制剂的制 备与应用。
【背景技术】
[0002] 在人体内居住着大量的微生物，其中主要的就是细菌类，据统计健康成人的肠道 栖息着1000万亿个细菌，是人体细胞总数的10~20倍，有多达近500余种细菌，肠道细菌 是人体最庞大、最重要的组成部分，平均每1克大便的细菌数量便达到了 1〇12个。机体的宿 主细胞、肠道微生物和其他微生物构成了一个复杂的系统，相互影响形成了多种生物学效 应。当前，国内外普遍公认的安全性益生菌菌种主要为乳杆菌属Lactobacillus和双歧杆 菌属Bifidobacterium，这两类菌可以在健康成年人的肠道菌群中出现。
[0003] 肠道益生菌成分组成了机体重要功能，负责3个主要功能：抵制病原微生物的定 植；提供营养；免疫调节。益生菌能够结合肠道上的位点，抑制病原微生物的结合，这种潜 在的机制可能是有益菌能够产生保护效应抵制病原菌，包括竞争营养或者附着位点，产生 抑制新陈代谢和抗病原菌作用，调节毒素的产生和活性。有益微生物通过提高日常饮食多 糖的分解效应和提供维生素，从而有助于为宿主提供营养。许多研究已经证实益生菌能刺 激与获得性免疫相关的功能，激活淋巴细胞并刺激抗体生成，能提高机体的特异性及非特 异性免疫功能，对腹泻、炎症、心血管疾病、肥胖等都具有潜在应用价值。
[0004] 由于抗生素能杀死细菌，在疾病的救治中也发挥了不可替代的作用，在医疗领域 得到了广泛的应用。但是，长期使用抗生素及抗生素的滥用，使许多人肠道致病细菌获得耐 药性，同时也抑制体内的有益菌，使肠道菌群失衡，从而引起疾病的发生。抗生素所致的肠 道生态平衡的改变，可能会导致生态系统抗移植性的丢失和肠病原菌的过度繁殖，耐药性 菌株和条件致病菌的过度生长，有益微生物的抑制，改变肠道生物菌群的功能。
[0005] 近十年来，国外在益生菌的耐药性方面做了大量研究工作。D'AIMM0等较系统 地报道了双歧杆菌、乳杆菌、片球菌等对卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及与 抗性有关的基因，如Bifidobacteriumlongum抗四环素的基因tetW等；T00MEYN等则进 一步研究报道了戊糖乳杆菌的抗四环素基因tetM在菌株间的转移。LiviaqF等通过对 Bacteroidesfragilis的研究得到cfxA基因对头孢菌素以及内酰胺类的的抗生素抗 性起作用。通过研究两株Staphylococcusaureus，得到庆大霉素抗性基因mecA、femA。这 种抗药基因在菌种间的转移对于人类将是很大的威胁。
[0006] 乳酸菌在自然界分布广泛，且作为益生菌广泛应用于食品、饲料和医药卫生等相 关领域。近年来，越来越多的研究表明，抗生素的广泛应用在治疗疾病的同时，也使得环境 中耐药菌株的种类及数目增加。目前，人类对抗生素抗性的研究大多集中在致病菌上，对乳 酸菌的抗生素抗性及抗性基因是否能够水平转移缺少系统性的研究，随着益生乳酸菌的普 及和广泛应用，人们对益生菌的研究越来越深入对于乳酸菌的抗生素抗性越来越关注。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株具有头孢类药 物抗性的长双歧杆菌（Bifidobacteriumlongum)。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一株具有头孢类药物抗性的嗜酸乳杆菌 (Lactobacillusacidophilus)〇
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种用于治疗肠道疾病的制剂。
[0010] 本发明的再一目的在于提供上述菌株以及制剂的应用。
[0011] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一株具有头孢类药物抗性的长双歧杆菌 (Bifidobacteriumlongum)，名称为长双歧杆菌（Bifidobacteriumlongum)AnB16,于2014 年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学， 保藏编号为CCTCCM2014442;
[0012] -株具有头孢类药物抗性的嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus)，名称为 嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus)AnL15,于2014年9月23日保藏于中国典型培 养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCM2014441;
[0013] -种用于治疗肠道疾病的制剂，包括上述具有头孢类药物抗性的长双歧杆菌 AnB16和/或嗜酸乳杆菌AnL15;
[0014] 本发明的机理是：用人体粪便在抗生素压力选择下分离得到具有耐药性的乳酸 菌，并进行了 10种抗生素敏感性实验，以筛选到的对抗生素具有较高耐药性的菌株为材 料，采用PCR扩增分析菌株的耐药基因定位情况，探索了乳酸菌耐抗生素的分子机制，并对 筛选具有抗性基因乳酸菌进行安全性评价，对筛选的抗性菌株进行验证是否对肠道失调具 有调节作用，采用"抗生素型肠道菌群失衡模型"，旨在为临床上使用抗生素引起的腹泻、菌 群失调等疾病提供潜在的治疗方法。
[0015] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：现有的益生菌多是多抗生素比较 敏感的，而我们所筛选的是具有抗性的肠道益生菌菌株，当临床再次使用抗生素时，肠道益 生菌能够在抗生素压力下存活，而普通的益生菌则没有这个能力，因此，可以为临床上抗生 素引起的腹与提供治疗方法。
【附图说明】
[0016] 图1是粘附性实验结果的柱形图；其中，A为Caco-2细胞的结果图；B为Hela229 细胞的结果图；AnB16 为B.longumAnB16 ;AnL15 为L.acidophilusAnL15。
[0017] 图2是头孢耐药基因的PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M:DNA Ladder2000;泳道AnB16 :B.longumAnB16;泳道AnL15 :L.acidophilusAnL15〇
[0018] 图3为Hindlll酶酶切基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图和Southern杂交结果图； 图A为Hindlll酶酶切基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，图B为southern杂交结果图；泳道 1 :入HindlllDNAladder;泳道 2 :L.rhamnosusGGATCC53103 ;泳道 3 :B.longumAnB16 ; 泳道 4 :L.acidophilusAnL15〇
[0019] 图4为肠道菌群在不同处理条件下的变化的柱形图。
[0020] 图5为小鼠肠道粪便DGGE分析结果图。
[0021]图6为益生菌对肠道菌群的调节作用的过程图。
[0022] 具体实施方法
[0023] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方法不限 于此。
[0024] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制 造厂商所建议的实验条件。
[0025] 实施例1益生菌初筛
[0026] 菌株的初筛包括分离的具体操作步骤（包括培养温度、时间等）及各培养基组成 (如改良MRS培养基等），以及两株菌的形态学鉴定过程（包括双歧乳杆菌和乳酸杆菌各自 的形态学特征描述）
[0027] 1、益生菌初筛方法
[0028] 收集南阳市人民医院使用抗生素一周的3个青年病人粪便样品各l.Og，用LB培 养基扩增培养，用溴化乙锭法去除质粒，蒸馏水稀释至10s9个稀释度，取lmL，涂布到含有 8~12g/L碳酸钙的乳酸杆菌MRS分离固体培养基和改良MRS分离固体培养基上，置于厌氧 培养箱中，37°C厌氧培养48h。培养结束后，取出平板挑选出具有可见溶钙圈或蓝色、浅蓝色 的菌落，并转接至乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中在37°C厌氧培养48h，并放入4°C冰箱保存 备用。
[0029] 2、鉴定方法
[0030] (1)菌株的形态学观察。
[0031] 将分离纯化的菌株纯培养物接种到增菌液体培养基中，37°C培养24h复活后，经 革兰氏染色操作后，在光学显微镜下观察其细胞形态特征，并用带有数字成像系统的显微 镜选取合适视野进行照相记录。
[0032] (2)乳酸菌分子生物学-16SrDNA鉴定。
[0033] 16SrDNA全长通用引物：
[0034]引物l:27F-5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，；
[0035]引物SdAgSR-S' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
[0036]PCR反应体系（25yL):引物 1/l.OyL;引物 2/1.0yL;10XPCRBuffer/2.5yL; dNTPmix/2. 0yL;Taq酶 /0? 3yL;DNA模板 /l. 0yL;超纯水 /25yL。
[0037]PCR反应条件为：先 94°C--4min ;再 94°C--30s，55°C--40s，72°C--90s 下循环30次，最后72°ClOmin。
[0038] 以无菌去离子水替代模板作为阴性对照。扩增结束后取3. 0 y L扩增后的产物进 行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，切割待测胶带送上海生工进行序列测定。将测定菌株的 序列结果与NCBI中已知的16SrDNA序列进行Blast对比分析得到最相近的菌株，以确定 实验所分离细菌的种属。
[0039] 3、实验结果
[0040] (1)菌体的生长情况的检查结果见表1。
[0041] 表1菌体生长情况检查结果
[0042]
[0043] (2) 16S rf)NA鉴定结果。
[0044]进入NCBI核酸数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，输入待测菌 株的16Srf)NA序列，点击Blast进入比对。
[0045] 比对结果显示，该菌株的16Srf)NA序列与其它多株长双歧杆菌的16Srf)NA 序列有99 %的相似性，（共1476bp)如SEQIDNo. 3所示，初步判断为长双歧杆菌 (Bifidobacteriumlongum)，将其命名为BifidobacteriumlongumAnB16D 另一菌株的 16Srf)NA序列与其它多株嗜酸乳杆菌的16Srf)NA序列有98%的相似性，（共1488bp)如 SEQIDNo. 4所示，初步判断为嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus)，将其命名为 LactobacillusacidophilusAnL15〇
[0046] 实施例2益生菌的生物学活性评价
[0047] 1、抑菌活性测定
[0048]待测菌为上述获得的BifidobacteriumlongumAnB16 和Lactobacillus acidophilusAnL15,对照菌株为鼠李糖乳杆菌，分别取各菌100uL于100mL的乳酸菌MRS 增茵肉汤培养基中进行活化复苏。指亦菌为EscherichiacoliATCC11105、Clostridium diffiileNY-5、StaphylococcusaureusNT-12〇
[0049] 抑菌活性的试验结果，见表2。
[0050]表 2B.longumAnB16 和L.acidophilusAnL15 抑菌活性的试验结果
[0051]
[0052] 2、耐胆盐、耐低pH菌株的筛选
[0053] 对上述两种菌进行耐胆盐、耐低pH筛选，实验结果，见表3。
[0054]表 3 (A)B.longumAnB16 和L.acidophilusAnL15 耐胆盐试验结果
[0055]
[0058] 3、粘附性试验
[0059] 将上述两株菌株，用于进行粘附性实