一种埃德菌fs110原生质体及其制备方法和转化方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种埃德菌FS110原生质体及其制备方法和 转化方法。
【背景技术】：
[0002] 埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110是从3739米的深海中分离得到的真菌。 从中分离得到了具有很强抗肿瘤活性的化合物Clavatol，Clavatol对于肿瘤细胞SF-268、 MCF-7、NCI-H460和H印G-2的IC5。为6-llnM。从该真菌中还分离得到了 15种胶霉毒素及 其衍生物，其中4种胶霉毒素为新结构化合物，分离得到胶霉毒素对于肿瘤细胞SF-268、 MCF-7、NCI-H460和H印G-2的IC5。为0. 22-34. 02yM。胶霉毒素具有抗肿瘤、抗真菌活性、 抗病毒和免疫调节活性，因此在抗肿瘤、抗肝纤维化、抗病毒及免疫抑制剂药物开发方面具 有良好的开发前景。而且DichotomomycescejpiiFS110粗提物对于病原真菌胶孢炭疽菌、 链格孢霉、新月弯孢霉和柱枝双胞霉的生长抑制率均大于90% (杨小岚，陈玉婵，李浩华， 章卫民，23株海洋真菌的分子鉴定及其抗植物病原真菌和细胞毒活性研究。生物技术通报， 2014,8:132-137)。以上结果预示该真菌具有较新颖的功能基因，存在独特的生物合成机 制。因此，十分有必要建立该埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110的遗传转化体系，以 便于后期对该真菌进行遗传操作改造，以提高高活性次级代谢产物的产量并获得更多结构 新颖的有活性的衍生物，最终获得更多的药物先导化合物，促进我国生物医药事业的发展。
【发明内容】
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[0003] 本发明的第一个目的是提供一种埃德菌FS110原生质体及其制备方法。
[0004] 本发明的埃德菌FS110原生质体是通过以下方法制备的，采用含有溶壁酶、纤维 素酶和蜗牛酶的混合酶体系对埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110的菌丝体进行酶解 而得到埃德菌FS110原生质体。
[0005] 所述的混合酶体系优选是溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶按照质量比1 :1 :1混合而 成，混合酶体系中酶的总浓度为l〇mg/L。
[0006] 优选，具体步骤为：冰浴条件下200rpm搅拌埃德菌FS110菌丝体3h，然后 5000rpm，4°C条件下收集菌丝体，用0. 02MPB缓冲液洗涤，加入0. 5% 0-巯基乙醇室温放 置0. 5h，再用0. 02MPB缓冲液洗涤，收集菌丝体，按lg菌丝体/10mL的比例加入混合酶体 系进行酶解，充分振荡，30°C，lOOrpm酶解3. 5h，将酶解液过滤，取滤液，即为埃德菌FS110 原生质体，所述的混合酶体系是溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶按照质量比1 :1 :1混合而成，混 合酶体系中酶的总浓度为l〇mg/L。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110的转化 方法，其特征在于，将质粒PAN7-1通过PEG介导转化至上述埃德菌FS110原生质体中，以潮 霉素B作为筛选标记，在再生培养基上对埃德菌FS110原生质体进行筛选恢复培养，经过筛 选得到含有质粒PAN7-1的埃德菌FS110。
[0008] 优选，具体步骤为：用STC液洗涤埃德菌FS110原生质体，离心取埃德菌FS110原 生质体沉淀，用STC液稀释至10s个/ml，每100yL埃德菌FS110原生质体悬浮液与含2yg PAN7-1质粒的100yLSTC缓冲液以及50yL体积分数30%PEG-6000混合，在30°C下温育 30min后，与2ml体积分数30 %PEG6000液充分混匀，继续培养5min后，再与5ml融化的再 生培养基（50°C)混合，涂布于含有100yg/ml潮霉素B的再生培养基上，然后覆盖一层含 有100yg/ml潮霉素B的再生培养基，于30°C培养，得到抗性菌落，然后提取抗性菌落的基 因组，以潮霉素B作为筛选标记基因，筛选阳性克隆，得到含有质粒pAN7-l的埃德菌FS110。
[0009] 所述的质粒pAN7-l为带有潮霉素B抗性基因hph和真菌启动子gpdA的广宿主载 体PAN7-1，为现有技术中的已知产品。
[0010] 所述的再生培养基的配方为：酵母粉lg酶水解干酪素lg琼脂16g蔗糖274g蒸馏 水1L，灭菌备用。
[0011] 本专利所涉及的埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110分离自3739米的深 海，本发明以溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶混合酶体系作用制备埃德菌（Dichotomomyces cejpii)FS110原生质体。鉴于目前关于埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110的遗传转 化体系的构建方法尚未见报道，因此本发明以潮霉素B为筛选标记，采用原生质体转化法 将能带有外源基因的载体PAN7-1导入到埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110原生质体 中，从而构建埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110原生质体的遗传操作体系，为建立埃 德菌（Dichotomomycescejpii)FSl10的遗传转化体系并促进其代谢工程改造奠定前期基 础，从而最终通过基因工程手段提高埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110中高活性代谢 产物的产量和种类。
[0012] 本发明的埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110,其公开于文献：杨小M，陈玉 婵，李浩华，章卫民，23株海洋真菌的分子鉴定及其抗植物病原真菌和细胞毒活性研究。生 物技术通报，2014, 8:132-137。该菌种本申请人也持有，保证自发明的申请日起20年内向 公众提供。
【附图说明】
[0013] 图1为深海真菌DichotomomycescejpiFS110的原生质体油镜镜检图；
[0014] 图2为质粒pAN7-l载体图谱；
[0015] 图3为深海真菌DichotomomycescejpiFS110原生质体在不导入外源质粒 pAN7-l(A)和导入外源质粒pAN7-l(B)在含有100yg/ml潮霉素B的YH)培养基平板上的 生长状况；
[0016] 图4为以DichotomomycescejpiFS110重组菌为模板扩增hph基因的PCR产物 鉴定图，其中1、2、3、4、5、6泳道分别为01 20000嫩1&^1?^和以菌落1#-5#基因组为模板 扩增得到的PCR产物。
[0017] 图5为hph引物扩增得到PCR产物的测序结果在NCBI数据库中的比对结果。
【具体实施方式】
[0018] 以下将参照附图，结合具体实施例对本发明进行进一步解释。但实施例本身对本 发明不做任何形式的限定。
[0019] 实施例1:PEG介导的埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110原生质体转化，包含 如下步骤：
[0020] 原生质体的制备：将埃德菌（Dichotomomycescejpii)FS110于斜面上刮取少 量菌落，接种于30mlYH)液体培养基中（YH)液体培养基属于现有技术中的常规培养 基），同时接种于含有20yg/mL、50yg/mL、75yg/mL和100yg/mL潮霉素B的YTO液 体培养基中，30 °C，160rpm培养72h后，结果表明100yg/mL潮霉素B可以完全抑制埃 德菌（Dichotomomycescejpii)FS110的生长。不含潮霉素B培养基中生长的埃德菌 (Dichotomomycescejpii)FS110菌株用无菌磁力搅拌棒在200rpm，冰浴条件下搅拌菌丝体 3. 0h，5000rpm，4°C条件下收集菌