专利名称：日本血吸虫虫卵抗原模拟肽、筛选及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种日本血吸虫虫卵抗原模拟肽，即一种利用噬菌体表面展示技术筛选的，能模拟日本血吸虫虫卵抗原的噬菌体多肽，还涉及该日本血吸虫虫卵抗原模拟肽的筛选方法以及其在血吸虫病诊断中的应用，属生物技术领域。
血吸虫广泛分布于世界各地，尤其是发展中国家。有五种血吸虫可以感染人体并引起人体的血吸虫病。在我国以日本血吸虫为主，日本血吸虫的虫卵产量比其他虫种都高，即使在产卵量相同的情况下，其虫卵的致病作用也比其他虫种的大，虫卵的沉积可引起血管的堵塞、组织坏死、肉芽肿反应和组织纤维化。因此虫卵在日本血吸虫对人体的致病过程中有着重要的作用。对于血吸虫病的研究，发展理想的诊断试剂和疫苗是两个主要方面。最初，血吸虫病的诊断方法以常规粪检为主的病原学检查，这种方法因工作量大、漏检率高，不能满足疫情检测的需要；目前虫卵抗原用于临床检测是诊断血吸虫病的主要方法之一。DunneD,Hillyer GV,Vazquez G等在《美国热带医学与卫生杂志》(Am J TropMed Hyg 1988;38508)中记载将可溶性虫卵抗原(Soluble Egg Antigen,SEA)用阳离子交换色谱法分离纯化得到纯化片段虫卵(Cation ExchangeFraction,CEF6)分子抗原，而虫卵CEF6分子抗原是导致环卵沉淀现象产生的重要成分之一，目前主要用于曼氏血吸虫病的诊断。但是，目前虫卵抗原主要是用实验动物来制备的，这样要耗费大量的动物，因此制备成本高，且制备方法较为烦琐。本发明正是利用免疫诊断方法，利用噬菌体表面展示技术筛选出的日本血吸虫虫卵抗原模拟肽，检测血吸虫病人的血清，以达到诊断的效果。
本发明的目的在于提供一种日本血吸虫虫卵抗原模拟肽。
本发明的另一目的在于提供一种简单易行、成本低的日本血吸虫虫卵抗原模拟肽的筛选方法。
本发明的另一目的在于提供该日本血吸虫虫卵抗原模拟肽在血吸虫病诊断中的应用。
本发明所述的日本血吸虫虫卵抗原模拟肽具有如下外源多肽系列NH2-L-Q-R-A-N-R-T-R-Y-G-T-E-T-H-Q-COOH。
本发明所述的日本血吸虫虫卵抗原模拟肽由噬菌体表面展示技术筛选而得，即在噬菌体表面表达外源抗原表位或外源肽，并制成库，而随机肽噬菌体表面展示技术则所是表达的外源肽是具一定长度且随机合成的。然后通过特异性结合物(如单抗)的亲和富集、筛选与之相结合的噬菌体，这样就得到了相对应的抗原表位或肽，并在大肠杆菌中可大量增殖，因此一个重组噬菌体所展示的特异性表位只要被鉴定，那么此噬菌体就可以成为特异性抗原的无限来源。
利用噬菌体表面展示技术筛选日本血吸虫虫卵抗原模拟肽的过程如下将由中国预防医学科学院寄生虫病研究所提供日本血吸虫虫卵抗原的单克隆抗体6B12，6B12为实验室编号，固定在聚苯乙烯酶标板上，加入由美国密苏里大学的GP.Smith教授赠送的噬菌体随机15-肽文库，其多样性为108，从15-肽噬菌体文库中筛选与6B12有特异性结合力的噬菌体，洗涤以去除非特异性结合的噬菌体，然后用pH值为2.5的洗脱液将结合在单抗6B12上的噬菌体洗脱下来，中和后感染美国密苏里大学的GP.Smith教授赠送的大肠杆菌K91Kan，扩增后将噬菌体的提取纯化，即为第一轮的富集噬菌体，将其作为第二轮筛选的起始物，用提高亲和力的筛选方法，经过三轮筛选后，得到与6B12结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽，再将第三轮筛选的噬菌体单克隆化，并结合ELISA、竞争ELISA和Western-blot方法挑选出与6B12有强阳性反应的噬菌体克隆，然后进行鉴定，证明与单抗6B12结合的位点是噬菌体的PⅢ蛋白质所携带外源多肽。
通过上述操作，从400个单克隆化的噬菌体中挑选出43个与单抗6B12有高亲和力的噬菌体，再从43个噬菌体中挑选出13个与6B12的决定簇有特异性反应的目标噬菌体，对这13个目标噬菌体所插入的外源多肤进行编码DNA序列分析后，发现这13个目标噬菌体所携带的编码DNA序列完全相同，都是5’-AAT-GTT-TCT-CGT-TGT-TCT-TGC-GCT-ATG-CCT-TGG-CTT-TGG-GTG-GTT’3，其相应的外源多肽序列为NH2-L-Q-R-A-N-R-T-R-Y-G-T-E-T-H-Q-COOH，从氨基酸组成来看，该肽段偏碱性，具有很强的亲水性。
本发明提供的日本血吸虫虫卵抗原模拟肽在检测血吸虫病中的应用，所采用的方法是用ELISA检测法，先包被抗原，再加入血清，然后加入过氧化物酶标记的抗人IgG结合物，经洗板后加入OPD底物显色液，用酶标仪测定其OD值，与健康人的检验结果对比即可以诊断出是否患有血吸虫病。
本发明与已有技术相比所具有如下优点和积极效果目前用于日本血吸虫病诊断的虫卵抗原都是来源于人工感染的实验动物，因而要耗费大量的动物，制备成本高，且制备方法比较烦琐。而用本发明所采用的方法筛选到的模拟虫卵抗原则可克服这些缺点1．噬菌体多肽易生产、易分离，因而价廉；2．噬菌体稳定且保存时间长；3．易进一步进行改造以满足不同的需要；4．噬菌体具有免疫原性因而免疫时无需佐剂；5．提供了一种快速鉴定免疫优势中和抗原决定簇的有效方法。
5、邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺(DAB)、酶标板均购自美国Nanc公司；(二)主要试剂1、培养基(1)大肠杆菌K91Kan液体培养基(LB培养基)蛋白胨(Bacto-Tryptone)10g/L酵母粉(Yeast extract) 5g/LNaCl 10g/L加入适量的dH2O充分溶解后，用1N的NaOH将pH值调到7.0-7.5之间，最后用dH2O定容至1L，分装后高压灭菌。
(2)LB固体培养基上述分装好的液体培养基加入1.5％的琼脂后再进行高压灭菌即可。
(3)高营养液体培养基(TB)K-PBS(0.17M KH2PO4-0.72M KH2PO4)KH2PO4(anhydrous)2.31gKH2PO4(anhydrous)12.54gdH2O加至 100ml高压灭菌TB培养基蛋白胨(Bacto-Tryptone)12g酵母粉(Yeast extract) 24g/L甘油(Glycerol) 4mldH2O加至900ml高压灭菌(4)选择培养基将高压灭菌后的LB固体培养基加热完全溶解，待到冷却至50℃左右时加入所需的抗生素，充分混合，在培养基凝固之前浇制平板。
2、抗生素的配制卡那霉素储备液的配制卡那霉素(kanamycin)1000×用ddH2O溶解100mg/ml，过滤灭菌，-20℃保存；四环素储备液的配制四环素(tetracycline)1000×用高压灭菌的50％甘油溶解40mg/ml，-20℃避光保存；3、PEG-NaClPEG8000100gNaCl 116.9gdH2O 475ml于1L的烧杯中搅拌溶解，高压灭菌，终体积应为600ml，4℃避光保存。
4、包板液-pH9.6，50mM碳酸盐缓冲液(CBS)Na2CO31.59gNaHCO32.93gdH2O定容至1000ml
5、洗板液10×pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)NaCl 80gKH2PO42gNa2HPO4·12H2O 29gKCl 2gdH2O定溶至 1000ml洗板液-pH7.4 PBS，0.05％ Tween 20，(PBST05)Tween 20 0.5ml or 5ml for PBST51×PBS加至1000ml6、封阻液PBST05-1％BSA，同时也是酶标抗体的稀释液7、洗脱液(elution buffer)1M Tris-HCl，pH2.5(adjust with glucine) 10mlBSA 10mg高压灭菌8、中和液(neutralize buffer)Tris12.1gHCl adjust pH to 9.5dH2O定容至 100ml高压灭菌9、TBS1M Tris-HCl，pH7.55mlNaCl 0.9gdH2O加至 100ml高压灭菌10、OPD(邻苯二胺)底物显色液(1)OPD底物缓冲液(PCS)柠檬酸4.66gNa2HPO4·12H2O18.4gdH2O加至 1000ml于4℃保存(2)OPD底物显色液PCS 9ml过氧化脲(5mg/ml) 1mlOPD 4mg11、酶终止液2M H2SO412、DAB底物显色液10mM Tris-HCl pH7.5 9ml过氧化脲(5mg/ml) 1mlDBA 6mg30％NiCl 100ul二、方法(一)噬菌体的扩增、纯化和定量
1、噬菌体的扩增和纯化(1)取1ml的LB液体培养基于15-ml的指管中，加入1ul的卡那霉素(100mg/ml)，将大肠杆菌K91Kan接入，37℃震荡(230rpm)培养过夜；(2)将1ml的K91Kan培养液转入10mlTB溶液中继续震荡培养2小时45分钟(至1∶10稀释后OD600=0.2)，37℃震荡(100rpm)培养10-15分钟，即为感受态细胞；(3)将噬菌体原库(1011颗粒)加入到感受态细胞中，继续震荡(100rpm)培养15分钟，将培养物转入100mlLB-0.02Tet(0.02％四环素)中37℃震荡(230rpm)培养30分钟，加入100ul四环素(20mg/ml)继续培养24小时；(4)培养物于4℃、8000rpm离心15分钟，取上清液加入15％PEG充分混合并置于4℃下沉淀过夜；(5)4℃10000rpm离心40分钟，弃去上清液，加入TBS1ml充分溶解，4℃8000rpm离心10分钟，将上清液转入另一个干净的小离心管中，加入15％PEG充分混合并置于4℃下沉淀大于4小时，离心后用200ul的TBS溶液溶解，加入0.7％DMSO于4℃保存。
2、噬菌体的定量本实施例采用噬菌体转染大肠杆菌K91Kan形成的转导子数目(Tu)来进行噬菌体的定量(1)取1ml的LB液体培养基于15-ml的指管中，加入1ul的卡那霉素(100mg/ml)，将大肠杆菌K91Kan接入，37℃震荡(230rpm)培养过夜；(2)将1ml的K91Kan培养液转入10mlTB溶液中继续震荡培养2小时45分钟(1∶10稀释后OD600=0.2)，37℃震荡(100rpm)培养10-15分钟，即为感受态细胞；(3)取大肠杆菌K91Kan感受态细胞10ul于15-ml指管中并与10ul一定稀释度(10x)的噬菌体溶液混合，室温保持10分钟；(4)加入1ml LB-0.02Tet(0.02％四环素)液体培养基，37℃震荡(270rpm)培养30分钟；(5)取100ul培养液涂平板(Kan100-Tet10 LB固体培养基平板)，37℃培养过夜；(6)对培养皿中菌落进行记数(y)，计算噬菌体溶液的效价=y×10x+3Tu/ml。
(二)目标噬菌体的筛选(1)包板单克隆抗体6B12用CBS(pH9.6，50mM碳酸盐缓冲液)稀释，包板浓度为10ug/孔，包板体积为100ul，置于4℃下大于16小时；(2)洗板加入200ul PBST05洗板液静置5分钟，重复洗三次，尽量甩干板孔中的液体；(3)封阻加入200ul 1％BSA于37℃封阻1小时，同(2)洗板；(4)加入噬菌体库加入100ul PBST05-1％BSA稀释至Tu=1010的噬菌体溶液，37℃慢摇孵育1小时，同(2)洗扳；(5)洗脱加入100ul洗脱液(pH2.2，0.1N HCl 0.1％BSA)反应15分钟，再加入40ul中和液(pH9.5，1M Tris-HCl)使其pH值变为中性；(6)感染在15-ml指管中先放入160ul大肠杆菌K91Kan感受态细胞，再加入上述洗脱的140ul噬菌体溶液，室温感染15分钟；(7)诱导加入300ul LB-0.02Tet后，37℃震荡(270rpm)培养30分钟；(8)涂板取6ul的培养液涂平板以计算噬菌体的得率，其余的培养液涂布到三个大培养皿上，37℃培养过夜；(9)次日将培养皿上的菌落用LB液体培养基冲洗下来转入离心管中，37℃震荡(270rpm)培养1小时后，将噬菌体纯化出来并测定其效价，作为下一轮筛选的噬菌体溶液；(10)重复以上的筛选步骤，进行第二和第三轮筛选，并且逐渐降低McAb-6B12的包板浓度(第二轮为1ug/孔，第三轮为0.1ug/孔)；(11)测定并纪录每次筛选噬菌体的输入量和输出量，通过计算每一轮的噬菌体得率来检验噬菌体的富集情况；(12)用McAb-6B12(1mg/ml的浓度作1∶1000稀释)包扳，对第三轮筛选得到的噬菌体溶液(浓度均调整为Tu=1010)作ELISA分析，结果使得噬菌体溶液对McAb-6B12的亲和力得到了较大的提高，这表明与MeAb-6B12有亲和力的噬菌体得到了有效地富集。
(三)单个目标噬菌体的筛选与鉴定1、用ELISA的方法挑选出与单抗6B12有较高亲和力的单个噬菌体(1)噬菌体的单克隆化用牙签轻触第三次筛选得到的噬菌体感染大肠杆菌K91Kan所形成的单菌落，并将其投入已放有1ml LB-Kan100-Tet40液体培养基的15-ml指管中，37℃震荡(270rpm)培养24小时；(2)离心除去菌体，得到上清液，随机测定6个样品的效价，平均为1010Tu；(3)用1mmg/ml单抗6B12作1∶1000稀释后包被96孔酶标板，检测上述每个噬菌体的上清夜对单抗6B12的反应，并以噬菌体对单抗6B12反应的OD490值比阴性对照高出5倍挑选出高阳性反应的噬菌体。
2、用竞争ELISA的方法挑选出与McAb-6B12有特异性反应的噬菌体(1)用1mg/mlMcAb-6B12作1∶1000稀释后包被96孔酶标板，洗板，封阻；(2)每孔加入50ul上清液和50ul的日本血吸虫卵抗原(1∶50稀释)，设阳性对照孔为加入50ul噬菌体溶液和50ul的PBS，37℃孵育1小时；洗板；
(3)加入Rabbit anti-M13血清(1∶5000)，37℃孵育1小时，洗板；(4)加入Goat anti-Rabbit HRP，37℃孵育1小时，洗板，显色后测定OD490值；与阳性孔比较以OD490值下降50％或50％以上的为目标噬菌体；3、用点印迹检测目标噬菌体与单抗体6B12的作用(1)将目标噬菌体用点样器点在NC纸上，待第一次的样品变干后，重复点样2-3次；(2)将NC纸转入已放有5ml 1％BSA的热封口袋中，37℃慢摇孵育1小时，进行封阻；(3)将NC纸放入TBS中漂洗三次，3分钟/次；(4)依照步骤(2)和(3)的操作依次将NC纸与5ml McAh-6B12(20ug/ml)和5ml Goat-anti-Mouse HRP(1∶1000)进行孵育；(5)将漂洗过的NC纸转入DAB底物显色液中，等到出现明显的条带后将NC纸取出，用清水稍加漂洗自然干燥后保存。
4、用Western-blot来验证目标噬菌体的pⅢ蛋白与单抗6B12的反应(1)将13个目标噬菌体依照上述噬菌体的扩增与纯化大量制备，只是将最终培养体积改为600ml；(2)用Beckman全自动紫外扫摇仪粗略测定步骤(1)所制备的噬菌体浓度为1014颗粒/ml；(3)采用12％胶浓度进行SDS-PAGE，上样量为20ul/孔，恒压120伏，1.5小时；12％SDS-PAGE试剂的配制B液(4×)2M Tris-HCl，pH8.8 75ml10％SDS 4mlddH2O 21ml可4℃保存几个月C液(4×)0.5M Tris-HCl，pH6.8 50ml10％SDS 4mlddH2O 46ml可4℃保存几个月SDS-PA9E 12％分离胶的配制ddH2O 3.5mlB液 2.5ml30％Acr-Bis 4.5ml10％APS 50ulTEMED5ul浓缩胶的配制ddH2O 2.3mlB液 1ml30％Acr-Bis 670ul10％APS 30ulTEMED 5ul电极缓冲液(5×)的配制Tris15.1gGlycine 94gSDS 10％50mlddH2O 1000ml样品缓冲液(2)()的配制1.0M Tris-HCl，pH6.81.0ml甘油2.0ml10％SDS 4.0ml1％溴酚蓝 0.2mlddH2O 1.8ml巯基乙醇1.0ml注意不含巯基乙醇的样品缓冲液可保存于室温，临用前加入(4)将电泳好的一块凝胶进行染色以显示噬菌体的电泳全条带；(5)将电泳好的另一块凝胶转入电转移缓冲液中平衡20分钟；(6)电转移采用NC纸、恒压100伏、50分钟可以得到较好的结果；转移缓冲液Tris3.03g甘氨酸(Glycine) 14.41g甲醇 200mlddH2O加至1000ml(7)电转移后将凝胶进行染色处理，NC纸放入丽春红S染液中染色5分钟以观察蛋白条带转移的情况；丽春红S染液0.5g丽春红(Ponceau S)溶解于1ml的冰乙酸中，dH2O加至1000ml。注意临用前配制(8)如果转移的比较好，将NC按照操作方法3.4所述进行显色。5、依据3的步骤，可以用兔抗M13血清显示噬菌体蛋白质全条带。(四)对目标噬菌体进行DNA序列测定用Pharmacia测序试剂盒测定，该目标噬菌体的编码DNA序列是5’-AAT-GTT-TCT-CGT-TGT-TCT-TGC-GCT-ATG-CCT-TGG-CTT-TGG-GTG-GTT’3，其相应的外源多肤序列为NH2-L-Q-R-A-N-R-T-R-Y-G-T-E-T-H-Q-COOH。
(五)目标噬菌体用于ELISA检测血吸虫病人血清，以达到检测血吸虫病诊断的目的(1)包被抗原目标噬菌体溶液用CBS作1∶200稀释，以100ul/孔包被酶标板，4℃过夜，1％BSA 37℃封阻1小时，洗板；(2)湖北省粪检阳性的血吸虫病人血清12份，以PBS-0.05％Tween20作1∶100稀释，每孔加入100ul，37℃孵育1小时；同时上海市正常人血清5份，1∶100稀释后，100ul/孔，37℃孵育1小时，洗板；
(3)加入过氧化物酶标记的抗人IgG结合物(自制)(1∶500稀释)100ul/孔，37℃孵育1小时，洗板；(4)加入OPD底物显色液(用pH5.0醋酸盐缓冲液配)，37℃反应30分钟后，用2M H2SO4终止反应，酶标仪测定490nm波长时的OD值。
(5)结果12名血吸虫病人血清的OD值分别为1.341.141.201.071.771.101.070.931.241.070.990.745名健康人血清的OD值分别为0.670.430.730.960.69用t值检验，t=0.0025 t＜0.005，PI＞95％。表明用该噬菌体多肽在检测病人血清与健康人血清时，有显著的差异。
权利要求
1.一种日本血吸虫虫卵抗原模拟肽，其特征在于多肽系列为NH2-L-Q-R-A-N-R-T-R-Y-G-T-E-T-H-Q-COOH。
2.一种日本血吸虫虫卵抗原模拟肽的筛选方法，其特征在于利用噬菌体表面展示技术筛选过程如下将日本血吸虫虫卵抗原的单克隆抗体6B12，固定在聚苯乙烯酶标板上，加入噬菌体随机15-肽文库，其多样性为108，从15-肽噬菌体文库中筛选与6B12有特异性结合力的噬菌体，洗涤以去除非特异性结合的噬菌体，然后用pH值为2.5的洗脱液将结合在单抗6B12上的噬菌体洗脱下来，中和后感染大肠杆菌K91Kan，扩增后将噬菌体提取纯化，即为第一轮的富集噬菌体，将其作为第二轮筛选的起始物，用提高亲和力的筛选方法，经过三轮筛选后，得到与6B12结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽，再将第三轮筛选的噬菌体单克隆化，并结合ELISA、竞争ELISA和Western-blot方法挑选出与6B12有强阳性反应的噬菌体克隆，然后进行鉴定，证明与单抗6B12结合的位点是噬菌体的PⅢ蛋白质所携带外源多肽。
3.如权利要求2所述的日本血吸虫虫卵抗原模拟肽的筛选方法，其特征在于包括以下步骤(1)包板单克隆抗体6B12用CBS稀释，包板浓度为10ug/孔，包板体积为100ul，置于4℃下孵育大于16小时；(2)洗板加入200ul PBST05洗板液静置5分钟，重复洗三次，尽量甩干板孔中的液体；(3)封阻加入200ul 1％BSA于37℃封阻1小时，同(2)洗板；(4)加入噬菌体库加入100ul含1％BSA的PBST稀释至Tu=1010的噬菌体溶液，37℃慢摇孵育1小时，同(2)洗扳；(5)洗脱加入100ul pH2.2，0.1N HCl，0.1％BSA洗脱液，反应15分钟，再加入40ul pH9.5，1M Tris-HCl中和液，使其pH值变为中性；(6)感染在15-ml指管中先放入160ul大肠杆菌K91Kan感受态细胞，再加入上述洗脱的140ul噬菌体溶液，室温感染15分钟；(7)诱导加入300ul LB-0.02Tet后，37℃震荡，培养30分钟；(8)涂板取6ul的培养液涂平板以计算噬菌体的得率，其余的培养液涂布到三个大培养皿上，37℃培养过夜；(9)次日将培养皿上的菌落用LB液体培养基冲洗下来转入离心管中，37℃震荡，培养1小时后，将噬菌体纯化出来并测定其效价，作为下一轮筛选的噬菌体溶液；(10)重复以上的筛选步骤，进行第二和第三轮筛选，并且逐渐降低McAb-6B12的包板浓度，第二轮为1ug/孔，第三轮为0.1ug/孔；(11)测定并纪录每次筛选噬菌体的输入量和输出量，通过计算每一轮的噬菌体得率来检验噬菌体的富集情况；(12)用McAb-6B12包扳，对第三轮筛选得到的噬菌体溶液作ELISA分析，结果使得噬菌体溶液对McAb-6B12的亲和力得到了较大的提高，这表明与McAb-6B12有亲和力的噬菌体得到了有效地富集。
4.日本血吸虫虫卵抗原模拟肽在血吸虫病诊断中的应用。
全文摘要
本发明提供一种日本血吸虫虫卵抗原模拟肽、筛选及其在血吸虫病诊断中的应用,属生物技术领域。利用噬菌体表面展示技术筛选出本血吸虫虫卵抗原模拟肽,再将其用于血吸虫病诊断中,通过测定其OD值,与健康人的检验结果对比即可以诊断出是否患有血吸虫病。具有制备简单易行、成本低,检测效果好的优点,是目前诊断血吸虫病的较佳方法之一。
文档编号C12Q1/02GK1286261SQ00119570
公开日2001年3月7日 申请日期2000年8月4日 优先权日2000年8月4日
发明者钱旻, 白艳军 申请人:华东师范大学