一种针对sea的纳米抗体及其编码序列与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术或生物医学领域，涉及一种针对于日本血吸虫可溶性虫卵抗原(Soluble Egg Antigen，SEA)的纳米抗体、其编码序列及应用。
【背景技术】
[0002]血吸虫广泛分布于世界各地，尤其是发展中国家。有五种血吸虫可以感染人体并引起人体的血吸虫病。在我国以日本血吸虫为主，日本血吸虫虫卵的沉积可引起血管的堵塞、组织坏死、肉芽肿反应和组织纤维化，因此虫卵在日本血吸虫对人体的致病过程中有着重要的作用。对于血吸虫病的研宄，发展理想的诊断试剂和疫苗是两个主要方面。最初，血吸虫病的诊断方法以常规粪检为主的病原学检查，这种方法因工作量大、漏检率高，不能满足疫情检测的需要；目前虫卵抗原用于临床检测是诊断血吸虫病的主要方法之一。Dunne D等在《美国热带医学与卫生杂志》(Am J Trop Med Hyg 1988 ；38:508)中报道，将可溶性虫卵抗原(SEA)用阳离子交换色谱法分离纯化得到纯化片段虫卵抗原，而纯化的虫卵抗原是导致环卵沉淀现象产生的重要成分之一，目前主要用于曼氏血吸虫病的诊断。但是，目前虫卵抗原主要是用实验动物来制备的，这样要耗费大量的动物，因此制备成本高，且制备方法较为烦琐。
[0003]纳米抗体技术，是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初有比利时科学家Hamers.R在骆蛇血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻链，这些新型抗体能像正常抗体一样于抗原紧密结合，但不像单链抗体那样相互粘连聚集成块。以其为基础构建的纳米抗体不仅分子量为普通抗体的1/10，而且化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易且容易获得，并能够偶联其他分子，因此应用纳米抗体技术研发血吸虫检测试剂具有广阔的应用前景。本发明正是利用该技术，利用筛选得到的日本血吸虫虫卵抗原特异的纳米抗体，用于检测血吸虫感染。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种针对日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种针对SEA的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区⑶R，所述框架区FR包括FRl?FR4的氨基酸序列:其中，FRl的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述互补决定区⑶R包括⑶Rl?⑶R3的氨基酸序列:⑶Rl的氨基酸序列SEQ ID NO:2所示，⑶R2的氨基酸序列SEQ ID NO:4所示，CDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:6所示。
[0006]进一步的，所述的SEA的纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
[0007]一种SEA纳米抗体，它针对SEA表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的VHH链。
[0008]一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质:上述的针对SEA的纳米抗体的VHH链，或上述的SEA纳米抗体。
[0009]一种表达载体，它含有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0010]一种宿主细胞，它可以表达SEA纳米抗体。
[0011]—种SEA纳米抗体在制备SEA检测试剂方面的应用。
[0012]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发明首先制备及纯化日本血吸虫虫卵抗原，将其免疫骆驼，制备SEA特异的纳米抗体库，然后将纯化后的SEA偶联在酶标板上，利用噬菌体展示技术筛选高表达的SEA特异的纳米抗体，并将其转入大肠杆菌TG1，建立能在大肠杆菌TGl中高效表达的纳米抗体株。
【附图说明】
[0013]图1是纳米抗体的DNA电泳图，M分子量marker，l PCR产物，条带约600bp，1_13为SEA纳米抗体；N为阴性对照；
图2是血吸虫SEA特异的纳米抗体，经镲柱亲和层析纯化后再经AKTAexpress纯化后的SDS-PAGE电泳图(A)和Western blot印迹图(B)，其中M为分子量标记，单位kD，1_6表示SEA纳米抗体；
图3是应用SEA纳米抗体识别血吸虫SEA的酶联免疫吸附试验(ELISA)结果。图中“▲”曲线为SEA纳米抗体，“ ■”曲线为阴性对照抗体VSG。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
本发明应用针对SEA纳米抗体偶联在酶标板上，展示蛋白质的正确空间构象，以此形式的抗原筛选免疫纳米抗体库(骆驼重链抗体噬菌体展示库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
[0015]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0016]实施例1
本实施例构建日本血吸虫SEA特异纳米抗体库，步骤如下:
Cl)首先纯化日本血吸虫SEA，然后将Img SEA抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只羊马它(Alpa-Vet，www.alpa-vet.be)，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；
(2)7次免疫结束后，提取10ml羊驼外周血淋巴细胞并提取总RNA ；
(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；
(4)利用限制性内切酶pstl及NotI酶切20ug噬菌体展示载体及1uIVHH并连接两个片段；
(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TGl中，构建SEA纳米抗体文库并测定库容，库容大小为8.9 XlO9。
[0017]实施例2
本实施例筛选SEA特异的纳米抗体，步骤如下:
(1)将溶解在10mMNaHCO3^ pH8.2的20ug SEA包被在NUNC酶标板上，4°C放置过夜；
(2)第二天加入10ul3%milk，室温封闭2h ；
(3)2h后，加入10ul2X 10ntfu含有SEA纳米抗体文库的辅助噬菌体，室温作用Ih;
(4)第一轮淘选用0.05%PBS+Tween-20洗10遍/第二轮20-25遍/第三轮20遍，除掉非特异性结合的噬菌体；
(5)用10mMTEA (triethylamine)将与SE