纳米抗体及其编码序列和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，尤其涉及一种针对黄曲霉毒素B1纳米 抗体及其编码序列和应用。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素是黄曲霉与寄生霉素产生毒株的代谢产物，它是化学结构相似的一 类化合物，根据其结构的差异分别被称为黄曲霉毒素8 2、匕和62等，其中以黄曲霉毒 素&最为常见，也是已知最强的化学致癌物之一。黄曲霉毒素BJAflatoxinB1JFB1)是 二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，对人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝 脏的损害，人的原发性肝癌也很可能与黄曲霉毒素有关。早在1993年黄曲霉毒素B1就被 世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO)的癌症研究机构认定为1类致癌物。黄 曲霉毒素Bl主要是污染花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品，且以南方高温高湿地 区受污染最为严重。黄曲霉毒素耐热，280°C才可裂解，一般烹调加工温度下难以破坏，故国 家质检总局规定黄曲霉毒素Bl是大部分食品的必检项目之一。
[0003] 来源于双峰驼的纳米抗体在基础研究、新药开发以及疾病的诊断和治疗以及食品 科学领域具有广阔的应用前景，已经成为一个重要研究热点。利用抗体技术获得来源于双 峰驼特异性针对黄曲霉毒素B1的纳米抗体，从而应用于临床诊断和靶向治疗，具有广阔前 旦 -5^〇
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种针对黄曲霉毒素&纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码 序列及该纳米抗体用于检测黄曲霉毒素B1分子的用途。
[0005] 本发明采用以下技术方案：
[0006] 本发明第一方面，提供了一种针对黄曲霉毒素B1纳米抗体的VHH链，包括框架区 FR和互补决定区CDR，所述框架区FR包括下组的FRl?FR4的氨基酸序列：SEQIDN0:1所 示的FRl，SEQIDNO: 2 所示的FR2,SEQIDNO: 3 所示的FR3,SEQIDNO:4 所示的FR4 ;所 述互补决定区⑶R包括下组的⑶Rl?⑶R3的氨基酸序列：SEQIDNO: 5所示的⑶Rl，SEQ IDN0:6 所示的CDR2,SEQIDNO:7 所示的CDR3。
[0007] 优选地，所述的针对黄曲霉毒素B1纳米抗体的VHH链，其氨基酸序列如SEQIDNO: 8所示。
[0008] 本发明第二方面，提供了一种针对黄曲霉毒素B1纳米抗体，其包括一条如SEQID NO:8所示氨基酸序列的VHH链。
[0009] 本发明第三方面，提供了一种DNA分子，其编码选自下组的蛋白质：本发明所述的 针对黄曲霉毒素B1纳米抗体的VHH链，或本发明所述的针对黄曲霉毒素Bi纳米抗体。
[0010] 优选地，所述的DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。
[0011] 本发明第四方面，提供了一种表达载体，其含SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。
[0012] 本发明第五方面，提供了一种宿主细胞，其可以表达本发明所述的针对黄曲霉毒 素B1纳米抗体。
[0013] 本发明第六方面，提供了本发明所述的针对黄曲霉毒素&纳米抗体用于检测黄曲 霉毒素B1分子的用途。
[0014] 本发明的有益效果：
[0015] 本发明使用黄曲霉毒素B1免疫双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针 对黄曲霉毒素B1的噬菌体展示纳米抗体文库。随后试验中将黄曲霉毒素Bi偶联在酶标板 上，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体文库，从而获得了针对黄曲霉毒素B1的特 异性纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳 米抗体株。
[0016] 本发明获得的纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性强、产量高、能特异识别黄曲 霉毒素B1,较常规抗体用途更广。
【附图说明】
[0017] 图1是经镍柱纯化后得到的黄曲霉毒素B1纳米抗体的SDS-PAGE的电泳图，左道 为蛋白标准分子，右道为经过镍柱纯化后的黄曲霉毒素B1纳米抗体。
【具体实施方式】
[0018] 本发明首先将黄曲霉毒素&免疫一只双峰驼，经过7次免疫之后提取该双峰驼外 周血淋巴细胞并构建了黄曲霉毒素B1特异的单域重链抗体文库。将黄曲霉毒素B1抗原偶 联在酶标板上，黄曲霉毒素&表面的抗原表位得以暴露出来，利用噬菌体展示技术从文库 中筛选黄曲霉毒素&免疫性的纳米抗体基因，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗 体株，并对黄曲霉毒素B1具有高度特异性。
[0019] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0020] 实施例1 :针对黄曲霉毒素&的纳米抗体文库的构建
[0021] (1)用黄曲霉毒素B1免疫双峰驼，每次将黄曲霉毒素B1与弗氏佐剂按1 :1体积混 合，每周一次，共免疫7次，第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余六次全部使用弗式不完全佐 齐U，在免疫过程中刺激B细胞表达特异针对黄曲霉毒素B1的纳米抗体。（2) 7次免疫结束 后，提取骆驼外周血淋巴细胞IOOml并提取总RNA。（3)将提取的RNA反转录成cDNA并利 用巢式PCR扩增VHH链，该片段的大小约为500bp。（4)使用限制性的内切酶PstI及Not I(购自NEB)酶切20ygpComb3噬菌体展示载体（购自Biovector)及10ygVHH并连接 两个片段。（5)将连接产物电转化至电转感受态细胞TGl(购自北京神州红叶科技有限公 司）中，构建黄曲霉毒素B1的纳米抗体文库并测定库容，库容的大小为3X10 8CFU/mL。（6) 文库构建完成后，为检测文库的插入率，随机的选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示：文库 插入率已达到100%。
[0022] 利用巢式PCR扩增VHH链的具体条件如下：
[0023] 第一次PCR体系：
[0024]
【主权项】
1. 一种针对黄曲霉毒素 B i纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区⑶R，其特 征在于，所述框架区FR包括下组的FRl?FR4的氨基酸序列：SEQ ID N0:1所示的FR1，SEQ ID N0:2所示的FR2, SEQ ID N0:3所示的FR3, SEQ ID N0:4所示的FR4;所述互补决定区 CDR包括下组的CDRl?CDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO :5所示的CDRl，SEQ ID NO :6所示 的 CDR2, SEQ ID NO :7 所示的 CDR3。
2. 根据权利要求1所述的针对黄曲霉毒素 B i纳米抗体的VHH链，其特征在于，其氨基 酸序列如SEQ ID NO :8所示。
3. -种针对黄曲霉毒素 B ^自米抗体，其特征在于，其包括一条如SEQ ID NO :8所示氨 基酸序列的VHH链。
4. 一种DNA分子，其特征在于，其编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的针对 黄曲霉毒素 B1纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的针对黄曲霉毒素 B i纳米抗体。
5. 根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。
6. -种表达载体，其特征在于，其含SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列。
7. -种宿主细胞，其特征在于，其可以表达权利要求3所述的针对黄曲霉毒素 B i纳米 抗体。
8. 权利要求3所述的针对黄曲霉毒素 B i纳米抗体用于检测黄曲霉毒素 B i分子的用途。
【专利摘要】本发明公开了针对黄曲霉毒素B1纳米抗体，同时还公开了编码该纳米抗体的基因序列以及能够表达该纳米抗体的宿主细胞。通过本发明所公开的黄曲霉毒素B1纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于黄曲霉毒素B1分子检测试剂的研发。
【IPC分类】C12N15-13, C07K16-14, C12N15-70, G01N33-53, C12N1-21
【公开号】CN104610451
【申请号】CN201510051598
【发明人】万亚坤, 龚雪
【申请人】东南大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月30日