一种cd7纳米抗体、其编码序列及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人CD7纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，框架区FR选自的FR1～FR4的氨基酸序列，互补决定区CDR选自的CDR1～CDR3的氨基酸序列，本发明还公开了一种人CD7纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明所述的人CD7纳米抗体的VHH链，或人CD7纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它能表达针对人CD7的纳米抗体，还公开了该抗体用于检测人CD7分子、流式检测和细胞免疫荧光实验的用途。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列和宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于CD7分子检测试剂的研发。
【专利说明】一种CD7纳米抗体、其编码序列及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学或生物制药【技术领域】，涉及一种针对于人CD7分子的纳米抗体、其编码序列及应用。
【背景技术】
[0002]1993年，Hamers-Casterman和他的同事在骆5它科动物体内发现了一种特殊类型的抗体，即天然缺失轻链的重链抗体(Heavy chain antibodies, HCAbs),克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体(single domain antibody, sdAb),其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm,高度4nm,所以又被称为纳米抗体(Nanobodies, Nb ;15kDa),它是现阶段最小的功能性抗原结合片段。纳米抗体和常规抗体相比具有许多独特的性质:I)纳米抗体编码的序列与人VH家族3和4同源性高，使得它免疫原性弱；2)纳米抗体分子量小，仅15kDa左右，结构简单，很容易在微生物中大量表达，易于纯化；3)纳米抗体可以识别大量的抗原表位，包括一些藏在分子裂缝中的表位都能识别；4)由于纳米抗体分子量小，使得它们易于穿透组织，到达常规抗体难以到达的部位；5)在变性或者高温环境下纳米抗体具有高可溶性和稳点性。
[0003]人CD7分子是一个分子量约40kDa细胞表面糖蛋白属于免疫球蛋白超家族中的一员。⑶7分子主要表达在大多数的胸腺细胞表面，85%以上的外周血T淋巴细胞表面以及自然杀伤细胞表面。尽管目前的研究表明CD7分子的具体功能还不太清楚，但实验显示CD7缺陷的鼠T淋巴细胞对刺激反应正常以及当抗体与人T淋巴细胞上的CD7分子结合后对细胞的生长和增殖并没有影响。同时，CD7分子的一个重要性质是当它和它的抗体结合后会快速的发生内吞作用。在这个重要性质的基础上，已经有几项研究通过在⑶7分子上偶联免疫毒素来靶向递送到人白血病以及淋巴癌细胞，从而达到治疗疾病的目的以及偶联免疫毒素来治疗急性移植物抗宿主病。这些实验都已进行临床实验阶段。同时有研究通过在⑶7分子上偶联蛋白来靶向递送siRNA到T淋巴细胞内，来治疗HIV感染。但是这些实验都是在常规抗体中分离出来的单链抗体(scFv;30kDa)上进行的。由于单链抗体相对纳米抗体分子量较大，导致其侵入组织和细胞中困难，而纳米抗体由于分子量很小同时单链抗体在原核表达系统中很难可溶表达出来，而纳米抗体在原核表达系统中易可溶表达且易复性。所以制备人CD7纳米抗体来进行疾病治疗研究可能是更加有效的且研究成本较低的备选方案之一。
[0004]目前，也没有针对人CD7抗原表位为靶标的特异性纳米抗体的研究报道。
【发明内容】
[0005]发明目的:本发明所要解决的技术问题是提供一种针对人CD7分子的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。
[0006]技术方案:为实现上述目的，本发明的第一方面，一种人⑶7纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区⑶R，所述框架区FR选自以下的FRl~FR4的氨基酸序列:[0007]SEQ ID N0.1 所示的 FRl，SEQ ID N0.2 所示的 FR2，SEQ ID N0.3 所示的 FR3，SEQ IDN0.4所示的FR4 ；
[0008]或SEQ ID N0.5 所示的 FRl，SEQIDN0.6 所示的 FR2，SEQIDN0.7 所示的 FR3，SEQ IDN0.8所示的FR4 ；
[0009]或SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列FRl，SEQ ID N0.9所示的FR2，SEQ ID N0.3所示的 FR3, SEQ ID N0.4 所示的 FR4 ；
[0010]SEQ ID N0.5 所示的 FRl，SEQ ID N0.10 所示的 FR2, SEQ ID N0.11 所示的 FR3, SEQID N0.12 所示的 FR4 ；
[0011]或SEQ ID N0.13 所示的 FRl, SEQIDN0.14 所示的 FR2, SEQIDN0.15 所示的 FR3，SEQID N0.8 所示的 FR4 ；
[0012]或SEQ ID N0.5 所示的氨基酸序列 FRl，SEQ ID N0.14 所示的 FR2，SEQ ID N0.16 所示的 FR3, SEQ ID N0.8 所示的 FR4 ；
[0013]所述的互补决定区⑶R选自以下的⑶Rl~⑶R3的氨基酸序列:
[0014]SEQ ID N0.17 所示的 CDR1，SEQ ID N0.18 所示的 CDR2, SEQ ID N0.19 所示的 CDR3 ；
[0015]或SEQ ID N0.20 所示的 CDRl，SEQ ID N0.21 所示的 CDR2，SEQ ID N0.22 所示的CDR3 ；
[0016]或SEQ ID N0.17 所示的 CDRl，SEQ ID N0.23 所示的 CDR2, SEQ ID N0.24 所示的CDR3 ；
[0017]或SEQ ID N0.25 所示的 CDRl，SEQ ID N0.26 所示的 CDR2, SEQ ID N0.27 所示的CDR3 ；
[0018]或SEQ ID N0.28 所示的 CDRl，SEQ ID N0.29 所示的 CDR2, SEQ ID N0.22 所示的CDR3 ；
[0019]或SEQ ID N0.30 所示的 CDRl，SEQ ID N0.31 所示的 CDR2，SEQ ID N0.22 所示的 CDR3。
[0020]优选地，它具有SEQ ID N0.32、SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.35、SEQ IDN0.36或SEQID N0.37所示的氨基酸序列。
[0021]本发明第二方面，一种人CD7纳米抗体，它是针对人CD7分子表位的的纳米抗体，包括具有 SEQ ID N0.32、SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.35、SEQ ID N0.36 或 SEQ IDN0.37所示的氨基酸序列的VHH链。
[0022]本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质:权利要求1或2所示的人CD7纳米抗体的VHH链，或权利要求3所示的人CD7纳米抗体。
[0023]优选地，所述的DNA分子，它具有选自下组的DNA序列:SEQ ID N0.38、SEQ IDN0.39、SEQ ID N0.40、SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.42 或 SEQ ID N0.43。
[0024]本发明的第四方面，提供了一种表达载体，其特征在于，它含SEQ ID N0.38、SEQID N0.39、SEQ ID N0.40、SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.42 或 SEQ ID N0.43 所示的核苷酸序列。
[0025]本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它表达针对人⑶7的纳米抗体。
[0026]本发明的第六方面，提供了本发明所述的人CD7纳米抗体用于检测人CD7分子的用途。
[0027]本发明的第七方面，提供了本发明所述的人CD7纳米抗体用于流式检测和细胞免疫荧光实验的用途。
[0028]有益效果:
[0029](I)本发明首先用流式检测方法，选择高表达人CD7分子的癌细胞系，经处理后使其具有免疫原性，然后用该细胞系免疫骆驼，取骆驼外周血提取淋巴细胞制备纳米抗体免疫基因库，最后在人肾上皮细胞系(293T cell line)上进行筛选⑶7纳米抗体，从而获得了人⑶7特异性的纳米抗体基因。将此基因克隆至原核表达载体并转化到大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
[0030](2)本发明使用高表达目的抗原的细胞免疫骆驼，获得的免疫库比较丰富，除了可以筛选目的抗原抗体，同时在所免疫细胞上的其它高表达分子同样可以拿来被筛选，比用多肽或者蛋白作为抗原一次免疫只能产生一种类型的针对所选抗原的抗体更能够节约成本、时间以及人力；
[0031](3)本发明使用细胞来对制备的纳米抗体库进行淘筛人CD7分子纳米抗体，能够获得特异性识别天然活性的人CD7分子，这种特异性的纳米抗体可以被拿来用于流式检测和细胞免疫荧光实验。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是第一轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，切胶回收650~750bp片段；
[0033]图2是第二轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，切胶回收500bp左右的片段； [0034]图3是SpeI和SacI双酶切噬菌体载体pComb3XSS琼脂糖凝胶电泳图，切胶回收3200bp左右的载体片段；
[0035]图4是随机的选取24个克隆做菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳图；
[0036]图5是用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)在细胞上筛选特异性单个阳性克隆结果;
[0037]图6是纳米抗体经过原核表达用镍柱离子亲和层析进行纯化，对纯化收集的4管纳米抗体进行SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色图；
[0038]图7是用商业化⑶7抗体和所获高纯度纳米抗体同时对⑶7阳性细胞Jurkat染色，然后用流式细胞仪检测分析后所得结果；
[0039]图8是用商业化⑶7抗体和所获高纯度纳米抗体同时对⑶7阴性细胞RPMI8226染色，然后用流式细胞仪检测分析后所得结果；
[0040]图9是转染表达⑶7质粒pcDNA3.1-⑶7到⑶7阴性细胞系H460中，然后用商业化CD7抗体染色，流式细胞仪检测分析后所得结果；
[0041]图10是用所获高纯度纳米抗体去染同一批转染⑶7的H460细胞，用于细胞免疫荧光分析图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0043]本发明首先用⑶7高表达细胞系Jurkat cells (5X IO6)免疫一只新疆双峰驼，经过连续7次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了 CD7特异的单域重链抗体文库。然后在293T-CD7 — (293T原始不表达CD7)和293T-CD7+(293T_CD7稳转细胞株)细胞系上进行淘筛CD7特异性的纳米抗体，从而最终获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体菌株。
[0044]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0045]实施例1:针对于人⑶7的纳米抗体文库的构建:
[0046](I)用⑶7高表达细胞系免疫骆驼:5X IO6个⑶7高表达Jurkat细胞系(购自ATCC公司)免疫一只新疆双峰驼(大众养殖集团公司)，每周一次，共连续免疫7次，免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；(2)7次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞 50ml 并提取总 RNA(Trizol 法)；(3)按照 Thermo Scientfic K1621\K1622 试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA，然后利用PCR方法扩增VHH链，第一轮PCR:
[0047]上游引物:GTCCTGGCTCTCTTCTACAAGG
[0048]下游引物:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTC [0049]扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，55°C退火，32个循环；琼脂糖凝胶电泳，切胶回收大小在650bp~750bp的DNA片段，如图1所示。
[0050]第二轮PCR:
[0051]以第一轮PCR回收产物作为模板，
[0052]上游引物:CGAGCTCATGGATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGG
[0053]下游引物:GGACTAGTGATGGAGACGGTGACCTGGGT
[0054]扩增重链抗体FRl区和FR4区，61°C退火，35个循环，回收大小在500bp左右的目的片段，结果如图2所示；(4)使用限制性的内切酶(购自NEB公司)Spe I及Sac I酶切10 μ g pComb3XS即遼菌体展示载体(购自Creative Biogene)如图3所示，以及双酶切10 μ gVHH,并用T4DNA连接酶(购自NEB公司)连接两个酶切片段；(5)将连接产物纯化后电转化至电转感受态细胞XLl-Blue(购自2ndLab?)中，构建⑶7的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小约为7.3X107 ;与此同时，通过菌落PCR检测所建文库的插入率检测结果，图4显示菌落PCR结果，随机的选取24颗克隆做菌落PCR，结果显示插入率达到96%。
[0055]实施例2:针对⑶7的纳米抗体筛选过程:
[0056](I)向293T细胞中加入3%BSA\PBS，室温孵育30min，去除3% BSA\PBS，并用PBS洗两遍后，立即加入新鲜制备的噬菌体纳米抗体悬液，37°C培养lh，并同时微摇培养皿；
(2)向293T-CD7+细胞中加3%BSA\PBS，室温孵育30min ;去除3% BSA\PBS，并用PBS洗两遍后，立即加入从(I)中吸取的上清悬液，37°C孵育lh，并同时微摇培养皿；(3)去上清，洗下细胞，并用PBS\TWeen-20洗细胞3遍，然后加入甘氨酸-盐酸洗脱缓冲液(pH2.2)，37°C孵育30min，按比例加入Tris\HCl缓冲液(pH7.4)，中和pH值，离心，去细胞，上清中含有噬菌体悬液；(4)上一步中的噬菌体悬液进一步感染对数生长期的XLl-Blue大肠杆菌，产生并纯化噬菌体进行下一轮细胞筛选，反复进行3轮，噬菌体逐步得到淘筛。
[0057]实施例3:用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆(全细胞ELISA 法):
[0058]1.在微量滴定板中表达噬菌体抗体
[0059](I)用无菌牙签挑取32个单个克隆，分别置于每孔含100μ 12XTY/amp/glu的96孔微量滴定板板孔中，振荡(300r/min)培养过夜，放在微量滴定板架上；(2)每孔加入50 μ 12XTY/amp/glu/gly并储存于_70°C ； (3)使用96孔无菌转移设备或移液器，从主板每孔中吸取2 μ 1，接种到一块每孔含150μ 12XTY/amp/glu的96孔板中，37°C振荡，直到A600值接近0.5 (2.5小时)；(4)每孔加入50 μ I含2X109pfu/ml辅助噬菌体(在储存料中稀释)的2XTY/amp/glu，噬菌体与细菌的比例接近20:1，37°C下孵育孔板30分钟；(5)以2700r/min离心孔板10分钟，用多道移液器或吸取设备移除上清液；(6)用150 μ 12 X TY/amp/kan重悬每孔的细菌沉淀,让曬菌体纳米抗体表达,37°C振荡(300r/min)培养孔板过夜；(7)次日，以2700r/min离心孔板10分钟；每孔取50 μ I上清液用来进行噬菌体ELISA。
[0060]2.全细胞 ELISA
[0061](I)在96孔板中分别加入293T-CD7+细胞(5 X IO5个)和293T-CD7—细胞(5 X IO5个)，每个克隆各取出50 μ I噬菌体悬液加入到96孔板中，并对应编号；室温孵育lh，离心96孔板，去除上清液，每孔细胞用PBS洗两遍；(2)向每孔中加入HRP标记的抗HA-Tag抗体，室温孵育lh，离心去除上清液，PBS洗细胞3遍，去尽上清，用TMB显色法进行显色；(3)用酶标仪在450nm处读板，并保存数据；(5)处理数据，分析实验结果；(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值2.5倍以上时，判为阳性克隆孔，结果如图5所示；(7)将对应的阳性克隆孔的菌转摇在含有3毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测序分析。
[0062]根据序列比对软件DNAMAN分析各个克隆株的基因序列，把⑶Rl，⑶R2，⑶R3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终共有6株不同的抗体。
[0063]实施例4:纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化
[0064](I)将前面测序分析所获得6种纳米抗体亚克隆至表达载体PET27b(+)中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌BL (DE3)中，将其涂布在含有50 μ g\ml卡那霉素的LB固体培养基平板上，37°C过夜；(2)挑选单个菌落接种在3毫升含有卡那霉素的LB培养液中，37 °C摇床培养过夜；(3)接种Iml的过夜菌种至250mlLB培养基中，37 °C摇床培养，培养到OD值达到0.6~I时，加入IPTG，37°C摇床培养过夜；(4)第二天，离心收菌；(5)将菌体破碎以获得抗体粗提液；(6)经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，获得高纯度的纳米抗体，如图6所示，为其中一种纳米抗体纯化后收集的连续4管纳米抗体，经过SDS-PAGE后，考马斯亮蓝染色图。
[0065]实施例5:用流式细胞仪检测所获得的纳米抗体活性
[0066]用高纯度的纳米抗体在CD7阳性的细胞系Jurkat细胞上进行流式细胞分析，并用商业化⑶7抗体做对比。实验步骤如下:常温孵育I小时后用PBS洗3遍，加入抗HA-tag抗体(兔抗)常温孵育I小时，PBS洗3遍,加入抗兔Alexa Fluor? 488突光标记抗体常温孵育I小时后，用PBS洗3遍，最后用流式细胞仪检测，结果如图7表示，表明所获的纳米抗体结合阳性细胞比例和商业化抗体相似。用高纯度的纳米抗体在CD7阴性的细胞系RPMI8226细胞上进行流式细胞分析，检测特异性。实验步骤同上，结果如图8所示，表明所获的纳米抗体特异性较好。
[0067]实施例6:用细胞 免疫荧光法检测所获得的纳米抗体活性
[0068]用lipofectamine2000转染试剂转染pcDNA3.1-CD7质粒到CD7阴性细胞系H460细胞，48小时候后用胰酶消化H460细胞后，一半继续培养24小时后用于流式检测(商业抗体)检验转染效果，另一半细胞用于细胞爬片，24小时后进行细胞免疫荧光检测。流式细胞检测方法步骤如下:取出转染的H460细胞，PBS洗3遍，加入商业化⑶7流式抗体，常温孵育I小时后PBS洗3遍，进行流式细胞仪检测，检测结果如图9所示，转染效率在18%左右。细胞免疫荧光检测步骤如下:把载玻片取出，用PBS洗2遍后用4%多聚甲醛固定15分钟，然后用3% BSA封闭I小时，最后加抗体染色，方法同实施例5，最后用共聚焦荧光显微镜拍摄，结果如图10所示，表明同商业化抗体染色比例相似，以及特异性较好。
[0069]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护 范围。
【权利要求】
1.一种人⑶7纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区⑶R，其特征在于，所述框架区FR选自以下的FRl~FR4的氨基酸序列:
SEQIDN0.1 所示的 FR1，SEQIDN0.2 所示的 FR2，SEQIDN0.3 所示的 FR3，SEQIDN0.4 所示的 FR4 ；
或 SEQIDN0.5 所示的 FRl，SEQIDN0.6 所示的 FR2，SEQIDN0.7 所示的 FR3，SEQIDN0.8 所示的FR4 ；
或SEQIDN0.1所示的氨基酸序列FRl，SEQIDN0.9所示的FR2，SEQIDN0.3所示的FR3，SEQIDN0.4 所示的 FR4 ；
SEQIDN0.5 所示的 FRl，SEQIDN0.10 所示的 FR2, SEQIDN0.11 所示的 FR3, SEQIDN0.12所示的FR4 ；
或 SEQIDN0.13 所示的 FRl ,SEQIDN0.14 所示的 FR2，SEQIDN0.15 所示的 FR3，SEQIDN0.8所示的FR4 ； 或SEQIDN0.5所示的氨基酸序列FRl ,SEQIDN0.14所示的FR2，SEQIDN0.16所示的FR3，SEQIDN0.8 所示的 FR4 ； 所述的互补决定区⑶R选自以下的⑶Rl~⑶R3的氨基酸序列:
SEQIDN0.17 所示的 CDRl，SEQIDN0.18 所示的 CDR2, SEQIDN0.19 所示的 CDR3 ；
或 SEQIDN0.20 所示的 CDRl，SEQIDN0.21 所示的 CDR2, SEQIDN0.22 所示的 CDR3 ；
或 SEQIDN0.17 所示的 CDRl，SEQIDN0.23 所示的 CDR2, SEQIDN0.24 所示的 CDR3 ；
或 SEQIDN0.25 所示的 CDRl，SEQIDN0.26 所示的 CDR2, SEQIDN0.27 所示的 CDR3 ；
或 SEQIDN0.28 所示的 CDRl，SEQIDN0.29 所示的 CDR2, SEQIDN0.22 所示的 CDR3 ；
或 SEQIDN0.30 所示的 CDRl，SEQIDN0.31 所示的 CDR2, SEQIDN0.22 所示的 CDR3。
2.根据权利要求1所述的人CD7纳米抗体的VHH链，其特征在于，它具有SEQIDN0.32、SEQIDN0.33、SEQIDN0.34、SEQIDN0.35、SEQIDN0.36 或 SEQIDN0.37 所示的氨基酸序列。
3.—种人CD7纳米抗体，其特怔在于，它是针对人CD7分子表位的的纳米抗体，包括具有 SEQIDN0.32、SEQIDN0.33、SEQIDN0.34、SEQIDN0.35、 SEQIDN0.36或SEQIDN0.37所示的氨基酸序列的VHH链。
4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质:权利要求1或2所示的人CD7纳米抗体的VHH链,或权利要求3所示的人CD7纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列:SEQIDN0.38、SEQIDN0.39、SEQIDN0.40、SEQIDN0.41、SEQIDN0.42 或 SEQIDN0.43。
6.— 种表达载体，其特征在于，它含 SEQIDN0.38、SEQIDN0.39、SEQIDN0.40、SEQIDN0.41、SEQIDN0.42 或 SEQIDN0.43 所示的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它表达针对人CD7的纳米抗体。
8.权利要求3所述的人CD7纳米抗体用于检测人CD7分子的用途。
9.权利要求3所述的人CD7纳米抗体用于流式检测和细胞免疫荧光实验的用途。
【文档编号】G01N33/68GK104004095SQ201410244584
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】汤金乐, 杨林 申请人:博生吉医药科技(苏州)有限公司