抗Cry1Ab毒素纳米抗体、其编码序列及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于食品科学或食品生物技术领域，涉及一种针对于CrylAb毒素的纳米抗体、其编码序列及应用。
【背景技术】
[0002]Bt毒素作为一类由苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensi,简称Bt)产生的杀虫晶体蛋白，近年来已广为人知。由于其对鳞翅目和鞘翅目的一些害虫具有高效、特异的毒杀作用，目前Bt毒素已作为微生物杀虫剂广泛应用于害虫的防治或表达于转基因植物中。其中Cry毒素是应用最广泛的Bt蛋白，比如CrylAb和CrylAc。然而自从几十年前第一个商品化Bt产品问世以来，人们对转基因植物的安全性和局限性愈加关注和担忧。有报道指出，转基因植物的某些营养特性已有所改变；其它研究证明，Cry毒素会在小鼠体内引起血液毒性。Cry毒素广阔的应用前景及其对人类健康的潜在风险和对生态环境的长期影响将会引起公众的的持续关注。
[0003]目前，转基因植物及其产品的检测大部分是基于核酸和蛋白质水平。核酸水平检测遗传物质中是否含有插入的外源毒素基因，如PCR、定量PCR等；蛋白质水平利用插入外源毒素基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，如酶联免疫检测法、Western blot法、试纸条法等。在转基因植物检测中，采用酶联免疫检测技术(ELISA)检测Cry毒素是目前公认的一种具有明显优势的技术，它具有快速、准确、灵敏度高、能大量检测样本等优点。然而，要获取具有强亲和力、高特异性的Cry毒素抗体(单克隆、多克隆、单链抗体)却是一项困难的工作。
[0004]单域抗体，也叫纳米抗体(VHH)，是由约120个氨基酸组成的肽段，是目前已知的最小的天然抗体片段，能识别目的抗原上常规抗体不能识别的某些位点，并且具有热稳定性高、表达量高、亲和力强、特异性好、生产周期短等特点。其分子结构只含有一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2和CH3区，但相比于人工改造的单链抗体片段(scFv)，其克服了相互粘连、甚至聚集成块的缺点。更重要的是，单独克隆并表达出来的VHH结构具备与原重链抗体相当的结构稳定性以及抗原结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。随着生物工程技术的发展，纳米抗体已开始被广泛应用于检测、分析、治疗等领域，弥补了其它种类抗体的不足之处。比如基于纳米抗体技术检测人体前白蛋白、载脂蛋白B的研究等。因此应用纳米抗体技术研发CrylAb检测试剂具有广阔的前景。
【发明内容】
[0005]发明目的:本发明所要解决的技术问题是提供一种针对CrylAb表位的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列。
[0006]技术方案:为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种CrylAb的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区⑶R，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列:SEQ ID NO:1 所示的 FRl，SEQ ID NO:2 所示的 FR2，SEQ ID NO:3 所示的 FR3，SEQ ID NO:4所示的FR4 ;所述互补决定区⑶R选自下组的⑶R的氨基酸序列:SEQ ID N0:5所示的⑶R1，SEQ ID NO:6 所示的 CDR2，SEQ ID NO:7 所示的 CDR3。
[0007]优选地，所述的CrylAb的纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0008]本发明第二方面，一种CrylAb纳米抗体,它针对CrylAb表位的纳米抗体,包括两条具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的VHH链。
[0009]本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质:本发明所述的CrylAb的纳米抗体的VHH链,或本发明所述的CrylAb纳米抗体。
[0010]优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列:
SEQ ID NO:8o
本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0011]本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有所述的表达载体。
[0012]本发明的第六方面，提供了本发明所述的CrylAb纳米抗体检测CrylAb分子的用途。
[0013]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发明首先将CrylAb毒素分子偶联在酶标板上，展示该蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了 CrylAb特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
【附图说明】
[0014]图1是纳米抗体的DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是:第一道为100bp的分子标记，其余孔道为PCR产物，PCR产物带约为500bp ；
图2是CrylAb纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图，结果显示，CrylAb纳米抗体经过该纯化过程,其纯度可达到95%以上。
【具体实施方式】
[0015]本发明应用针对CrylAb偶联在酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，以此形式的抗原筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
[0016]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0017]实施例1:针对于CrylAb的纳米抗体文库的构建:
(I)首先获得CrylAb蛋白(购自上海佑隆生物科技有限公司)，将I mg CrylAb与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只单峰驼，每周一次，共免疫6次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；(2) 6次免疫结束后，提取100 mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA ; (3)合成cDNA(利用 Superscript reverse transcriptase CAT: 18064-014 合成)并利用巢式 PCR扩增VHH，第一步PCR具体步骤为:94 ° C 7 min I个循环、94 ° C I min 30个循环、55° CI min,72° C I min,72° C 10 min,第二步PCR具体步骤同第一步PCR，只是循环次数由30次降至17次；(4)利用限制性内切酶PstI及NotI酶切20 μ g pComb3噬菌体展示载体(B1vector供应)及10 μ g VHH并连接两个片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TGl中，构建CrylAb纳米抗体文库并测定库容，库容大小为2X109。
[0018]实施例2:针对CrylAb的纳米抗体筛选过程:
(I)将溶解在100 mM NaHC03> pH 8.2中的20 μ g CrylAb偶联在NUNC酶标板上，
4 °C放置过夜；(2)第二天加入100 UL 0.1%酪蛋白，室温封闭2 h ；(3)2 h后，力口Λ100 μ L噬菌体(5Χ 10ntfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库，具体获得过程见实施例1)，室温作用I h; (4)用0.05% PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体；(5)用100mM TEA (triethylamine)将与CrylAb特异性结合的曬菌体解离下,并感染处于对数期生长的大肠杆菌TGl, 37 °C培养I h,产生并纯化曬菌体用于下一轮的筛选,相同筛选过程重复3-4轮,逐步得到富集。
[0019]实施例3:用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆:
(I)从上述实施例2中3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100μ g/mL的氨苄青霉素的TB培养基(ILTB培养基中含有2.3克磷酸二氢钾，12.52克磷酸氢二钾，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度I毫摩尔的IPTG，28 °C培养过夜。(2)利用渗透法(Zhu，Μ.，Hu, Y., Li, G.,0u, ff., Mao, P., Xin, S., Wan, Y., 2014.Combining magnetic nanoparticle withb1tinylated nanobodies for rapid and sensitive detect1n of influenza H3N2.Nanoscale research letters 9(1)，528.P3_4)获得粗提抗体,并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置I小时。(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入一 mouseant1-HA tag antibody (抗鼠抗HA抗体,购自北京康为世纪生物科技有限公司),在室温下放置I小时。(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入ant1-mouse alkaline phosphataseconjugate (山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置I小时。(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100微克每毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把⑶R1，⑶R2，⑶R3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，其抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0020]实施例4:纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化:
1.将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在LA+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37 1:培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5 mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37 °C摇床培养过夜；(3)接种I mL的过夜菌种至330 mL TB培养液中，37 °C摇床培养，培养到OD值达到0.6~1时，加入IPTG，28。。摇床培养过夜；(4)离心，收菌；(5)利用渗透法，获得抗体粗提液；(6)经镍柱离子亲和层析可制备纯度达90%以上的蛋白。
[0021]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种针对CrylAb纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区⑶R，其特征在于，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列:SEQ ID NO:1所示的FRl，SEQ ID NO:2所示的FR2，SEQ ID NO:3所示的FR3，SEQ ID NO:4所示的FR4 ;所述互补决定区CDR选自下组的 CDR 的氨基酸序列:SEQ ID NO:5 所示的 CDRl，SEQ ID NO:6 所示的 CDR2，SEQ ID NO:7所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的CrylAb纳米抗体的VHH链，其特征在于，它具有SEQID NO:8所示的核苷酸序列。
3.—种CrylAb纳米抗体,其特征在于,它针对CrylAb表位的纳米抗体,包括两条具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的VHH链。
4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质:权利要求1或2所述的CrylAb纳米抗体的VHH链,或权利要求3所述的CrylAb纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自DNA序列如SEQ ID NO:8 所示。
6.—种表达载体,其特征在于,它含SEQID NO:8所不的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它可以表达CrylAb的纳米抗体。
8.权利要求3所述的CrylAb纳米抗体用于检测CrylAb分子的用途。
9.一种用于检测CrylAb分子的试剂盒,其包括权利要求3所述的CrylAb纳米抗体。
【专利摘要】本发明公开了一种抗Cry1Ab纳米抗体、其编码序列、能够表达该纳米抗体的宿主细胞及该纳米抗体的应用。本发明从噬菌体抗体库中淘选获得纳米抗体（Nanobody），其特征在于此纳米抗体的特异性是由其重链可变区序列中CDR区序列决定。该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，具有较大的利用价值。
【IPC分类】C12N15-63, C12N15-13, C07K16-12, G01N33-558
【公开号】CN104628852
【申请号】CN201510060091
【发明人】万亚坤, 李敏, 朱敏
【申请人】东南大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月4日