专利名称：一种内包裹免疫毒素外连接抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒的制作方法
技术领域：
本发明属于牛物医药领域，更具体地，本发明公开了 一种内包裹毒素外连 接抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒、其制备方法及用途。
背景技术：
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免疫毒素是由抗体或抗体片段和蛋白毒素(如绿脓杆菌外毒素PE)进行化学 交联或基因融合而形成的复合物。目前，PE构建的免疫毒素是把除去细胞结合 部分的PE和抗体片段进行基因融合而形成的。尽管PE构建的免疫毒素在肿瘤 的临床治疗中取得了令人瞩目的成就，然而，其临床应用仍然受限于免疫毒素 的严重的非特异毒性，这些非特异毒性主要表现为肝毒性一由于免疫毒素和正
常组织非特异性结合造成的一种非特异毒性，re构建的免疫毒素中的毒素部分
在非特异毒性中起着重要的作用。最近人们发现， -些方法(如降低免疫毒素 的等电点)可以用作来降低免疫毒素的非特异毒性。此外，针对PE构建的免疫 毒素中的毒素部分的免疫反应是治疗固体肿瘤的主要障碍，克服免疫毒素的免 疫原性的方法一般为联合使用免疫抑制剂(CTLA4Tg或Rit:iximab)。如果能减 小免疫毒素的免疫原性和非特异毒性，我们便可以加大免疫毒素的临床使用剂 量，从而得到更好的临床效果。但是，除了聚乙二醇修饰免疫毒素以外，目前 很少有同时可以解决这两个问题的方法。
发明内容
本发明的发明人经过大量实验，将通常应用于包裹小分子药物、减少这些 药物毒副作用的聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)来包裹PE毒素，这里优选 PE38KDEL的I型突变体:PK38KDEL I，为了增加其靶向性，本发明的发明人在 包裹了 PE38K此L工的聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)表面通过碳化二亚胺技 术连接人源化SM5-1单克隆抗体的Fab'片段，得到了一种内包裹PE38KDEL I 型突变体，外连接人源化SM5 1抗体的聚乳酸 羟基乙酸共聚物纳米颗粒。
本发明的发明人利用本发明得到的内包裹PE:化KDEL I型突变体外连接人源 化SM5-1抗体Fab'片段的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒(以下简称 PE-NP-S)进行了一系列的实验，实验结果表明PE NP-S显示出更好的抗肿瘤活 性，而且具有更小的非特异毒性和免疫原性，对抗PE中和性抗体的敏感度更低， 达到了本发明的目的。
本发明的发明人还公开了制备上述纳米颗粒的方法，包括首先制备包裹免 疫毒素的纳米颗粒，然后在纳米颗粒表面连接抗体两个步骤。
类似地，利用本发明公开的方法，还可以连接其它完整抗体或其它人源化 抗体片段(例如Fab'片段或F(ab' h)得到外部连接上述抗体或片段的包裹了 PE38KDELI型突变体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒，这些完整抗体或人源 化抗体片段可为被肿瘤细胞内吞的抗体或其片段，如重组人源化抗HER2单克隆 抗体(rhuMAbHER2)和重组人源化抗CD22单克隆抗体。
相应地，利用本发明公开的方法，还可以利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物包裹 其他类型的毒素然后再在其外部连接上述的抗体或抗体片段得到各种纳米颗 粒，这些毒素可以为篦麻毒素和白喉毒素之--。本发明公开的纳米颗粒可以和其它药学上可接受的辅料 一 起组成药物制
剂。这些药物制剂可以用于治疗肿瘤。肿瘤可以是SM5-1结合蛋白抗原表达阳 性的肿瘤，或者是HER2、 CD22表达阳性的肿瘤。
所述的治疗SM5 l结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤药物，包括但不限于缓解或 /和减轻SM5 -1结合蛋tl抗原表达阳性的肿瘤的各种症状的药物。这里所述的 SM5 - l结合蛋白抗原农达阳性的肿瘤包拈肝癌、乳腺癌及黑色素瘤等， 优选肝癌。
更具体地，本发明公开了
1. 一种内包裹免疫毒素外连接抗体的聚乳酸--羟基乙酸共聚物纳米颗粒。
2. 如l所述的纳米颗粒，其中免疫毒素为篦麻毒素、fi喉毒素、PE38KDEL I型突变体之一，抗体为人源化抗体或人源化抗体的Fab'片段。
3. 如2所述的纳米颗粒为内包裹PE38KDEL I型突变体外连接人源化SM5-1 抗体Fab'片段的聚乳酸.羟基乙酸共聚物纳米颗粒。
4. 如3所述的纳米颗粒，其粒径为70 140 nm，包裹效率为35 45 V 抗体连接效率为15 25tig /mg纳米颗粒。
5. —种制备如1至4任-所述的纳米颗粒的方法，包括首先制备包裹免疫 毒素的纳米颗粒，然后在纳米颗粒表面连接抗体两个步骤。
6. 如5所述的方法，其中制备包裹免疫毒素的纳米颗粒步骤包括
a) 将免疫毒素溶解到水性溶液中然后和聚乳酸羟基乙酸共聚物一起加入 到油性溶剂，超声得到油包水的初乳；
b) 利用a)得到的初乳制备复乳；
c) 复乳再加入到聚乙烯醇溶液中后，搅拌使有机溶剂挥发，溶液经过离心、水洗，低温冻干即制得成品纳米颗粒。
7. 如6所述的方法，其中歩骤a)中的水性溶液为PBS，油性溶剂为乙酸乙酯。
8. 如6所述的方法，其中歩骤a)还包括在溶解了免疫毒素的水性溶液中加 入海藻糖。
9. 如5的方法，其中在纳米颗粒表面连接抗体步骤包括将包裹免疫毒素的 纳米颗粒和EDC、 NHS在避光的条件下共同孵育，然后将溶于服PES (pH 7.4)
的抗体或抗体片段加入到沉淀的纳米球中避光反应而得。
10. 如1-4任一所述的纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的用途。
11. 如10所述的用途，其中肿瘤为SM5-1结合蛋白抗原或Her2表达阳性 的肿瘤。
12. 如11所述的用途，其中SM5- 1结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤为乳腺癌、 黑色素瘤和肝癌。
13. 如12所述的用途，其中SM5-1结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤为肝癌。 在本发明中，如没有特别说明，PE-NP S指的是本发明公开的内包裹
PE38KDEL I型突变休外连接人源化SM5 1 Fab'片段的聚乳酸- 羟基乙酸共聚物 纳米颗粒，Mut-1为SM5--1单链抗体和PE38KDEL I突变体进行基因融合后的免 疫毒素(以下如果没有特别说明，PE38KDEL I均指PE38KDEL I突变体，各附图 中也均同)，PE-NP为包裹PE38KDEL I的PLGA纳米颗粒，FITC-PE-NP-S为FITC 标记的PE-NP-S， PE-NP-CD25为连接anti 〔:D25的Fab，片段的PE-NP。 NP 'S 为不含免疫毒素的PLGA纳米颗粒(NP)连接上SM5 l的Fab'片段。
图1: PE-NP-S纳米颗粒的形态学和粒径分布图，其中图]1: PE-NP-S投 射电镜(TEM)的形态学照片，分辨率为().2微米，图l 2: PE NPS通过粒径仪测 定的粒径分布图。
图2:竞争结合实验结果，其中lXl(TCh h印-3细胞和亚饱和浓度的F工TC 标记的鼠源SM5-1 (mSM5-l)、逐渐增高浓度的Mi」t-1、 CD25-PE38匿L或纳米颗 粒在4。C孵育1小时，细胞洗涤后用流式进行分析。最大荧光强度定义为在没 有竞争抗体时，FITC标记的鼠源SM5- 1对(〕h h叩3细胞进行染色得到的平均 荧光强度。所有数据为三次独立实验的平均值。
图3: FITC-PE-NP-S结合并被Ch h印3细胞内吞的过程分析，Ch--h印 3细 胞在下列时间被染色0， l和30分钟。图3 1: Ch-h印-3细胞，孵育时间为l 分钟，图3-2: Ch-h印-3细胞，孵育时间为30分钟，图3-3: QGY7701细胞， 孵育时间为30min，其中图3-1-1为相差，图3-1-2为FITC的绿炎光，图3-1-3 为4',6 二脒基-2-苯吲哚盐酸(对细胞核进行染色)的蓝荧光，图3-1-4为重叠 图象，图3-2-1， 3--2'2， 3 2-3， 3 2 4及3.3-1， 3-3-2， 3-3-3， 3-3-4均同， 分辨率为10 (im。
图4:抗PE抗体测定结果，图4 1:鼠对PE38KDEL I的IgG反应，5组小鼠在 箭头所指的时间分别免疫了l mg/kg的PE NP-S， PE-NP, PE-NP-CD25， Mut-1,和 PE3服DELI，血清中抗PE TgG水平在第21天被检测；对照组免疫PBS; *,代O. 05; 图4-2:抗PE中和性测定结果。
图5: Mut-工和PE-NP S对BALB/c裸鼠的抗肿瘤效应，5 X 10'、 Ch-h印-3 细胞在第O天皮下注射到小鼠中，--旦肿瘤K到了 50min1，在第5， 7和9天(箭头所指)，小鼠接受每天两次的静脉治疗，每组6只小鼠。数据显示为平均肿瘤
体积士标准差(n::6)。图5有八个治疗组，分别为PBS、 PFIDELI (5 mg/kg)、 PR-NP (5 mg/kg，按包裹的PE38KDEL I计算)+ SM5-1 Fab，(按实际抗体连 接效率弓毒素包裹效率折算，抗体量与5mg/kg剂量的PR NP CD25上连接的抗 体等量)、PE-NI〕 CD25 (5 mg/kg，包裹的Pl:i38KDI':L :1.的并连接anti CD25牟-抗 Fab'片段的PLGA纳米颗粒，按包裹的PE38KDEL I计算)、PE NP -S (0. 5 mg/kg， 包裹PE38KDEL I并连接SM5 1 Fab，片段的PLGA纳米颗粒，按包裹的PE38KDEL I计算)、PE-NP-S (2. 5 mg/kg，按包裹的PE38KDEL T计算)、Mut-1 (0. 5 mg/kg)、 Mut-I (5 mg/kg)。
具体实施例方式
以下实施例、实验例仅仅对本发明进行进一歩的说明，不应理解为对本发 明的限制。
PE38KDEL I的制备、纯化和分析方法见(Wang H， Song S, Kou G， et al. Treatment of hepatocellular carcinoma in a mouse xenograft model with an i咖unotoxin which is engineered to elirm'nate vascular leak syndrome. Cancer Immunol Immunother 2007; 56(11):1775…1783. Song S， Xue J， Fan K, et al. Preparation and characterization of fusion protein truncated Pse(jdomonas Exotoxin A (PE38KDEL-I) In Escherichia, coli. Protein Expr Purif 2005;44:52-7.);人源化SM5 l单克隆抗体通过Li B， Wang H, Zhang D， et al. Construction and characterization of a highaffinity humanized SM5-1 monoclonal antibody. Biochem Biophys Res Commun 2007; 357 (4) :951-6中提供的方法，用P:rote:m A杵对表达人源化SM5 1单克隆抗体的CH0细胞(中国 仓鼠卵巢癌细胞)的细胞上清进行亲和层析后得到；另外，除非特别提及，本 文中的SM5-1指人源化SM5- 1 ，人源化SM5 1单克隆抗体和人源化ariti-CD25单克 隆抗体的Fab'片段的方法制备得参见Martin FJ， Hubbe:l.l WL， Papahad,jopoulos D. Immunospeci—fi.c targeting of liposomes to cells: a novel and efficient: method for (;ovalent attachment of Fab' fragments via disulfide bonds. Biochemistry 1981; 20:4229-38.;三株肝癌细胞株 Ch-h印-1， Ch-h印-3 和QGY7701公开资料参见Pr印a:ration and Characterization of PaclitaxeHoadcd PIGA Narioparticles Coated with Cationic SM5-1 Single-chain Antibody, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, Vo. 40， No. 5, S印tember 2007, page 731-739; PLGA (乳酸和乙醇胺的摩尔比为50: 50， RG503，分子量为40 75 kDa)购买自德国 Boehringer Inge丄heim公司;Mut I的制备方法参见:Wang H， Song S， Kou G， et al. Treatment of hepatocellular carcinoma in a mouse xenograft model with an i鹏unotoxin which is engineered to eliminate vascular leak syndrome. Cancer Immunol Iramuriother 2007 ; 56 (11) : 1775--1783; 其余化学 试剂均购自sigma，为分析级纯度。 实施例l:包裹PE38KDEL I的纳米颗粒PE-NP的制备
PE38KDEL工按2 mg/ml的浓度溶于PBS (pH 7. 4)，称取15毫克的海藻糖 加入150 ul上述蛋白溶液，颠倒混匀至完全溶解后，再和40毫克的PLGA共 同加入到1. 5毫升的乙酸乙酯屮，在冰浴中超声15秒(功率为1.4瓦)(Branson Sonicator 450)得到初乳。然后，2毫升的聚乙烯醇(分子量25-35kDa)，水溶液(质量体积比为1%)加入到制备得到的初乳(油包水)中，再超声15秒 (功率为14瓦)得到复乳水(油包水)。得到的复乳再加入到50毫升的聚 乙烯醇(分子量:25 35kDa)水溶液屮(质量休积比为().3%)。最终的溶液再 搅拌8小时使有机溶剂挥发，最后制得的纳米颗粒经过离心(30000 g X 30min)， 水洗三次后，再低温冻干(冻干过程样品分装至冻干瓶中，2 5ml/瓶，在一20 r条件下预冻4小时，置冻千机内，层板温度设定为一40"C，待样品温度至一 3(TC以后，开启真空泵，冻干24小时，无菌条件下释放真空，并取出样品)即 制得成品纳米颗粒PE NP。空纳米颗粒NP的制备也是按照上述方法制备(不含 2 mg/kg的PE38KDEL 1)。
实施例2: FITC (异硫氰酸荧光素)标记的PLGA纳米颗粒的制备
100 mg的PLGA溶于5毫升的无水二氯甲烷中，然后用1， 3 — 二环己基碳 二亚胺(0.7毫克)和N—羟基琥珀酰亚胺(0.4毫克)进行活化。反应4小时 以后，副产品dicyclohexyliosurea用透析的方法除去(透析方法参见 Ataman-0nal， Y. ， Murder, S. ， Ganee， A. ， Terra.t:， C. , Durand， R Y. ， Battail， N. ， Ma,rtinon, F. ， Le， G. R. ， Charles, M. H. ， Delair， T. and Verrier, B. (2006) Surfactantfree anionic PLA nanopartic]es coated with HIV-1 p24 protein induced enhanced cellular and humeral immune responses in various animal models. J. Control. Release 112， 175-185.)。透析后，在上述反 应液中加入0. 7毫克氨茶碱，反应4小时使PLGA的succinimidyl酯基团转变 为伯胺基团，反应完毕，加入到500毫升的的20"C预冷乙醚用沉淀法进行纯化， 然后进行真空千燥(真空度20 Pa 、干燥温度为25°C、干燥时间12小时)。 将溶于二甲亚砜(DMS0)的FITC (1.2 mg)禾n 50毫克的具有伯胺基团的PLGA(真空干燥后的产品)反应。产物对去离子水透析(透析方法上面所述方法相
同)后，冻干。将FITC标记的PLGA聚合物和PLGA按照1: 9的比例混合后， 按照实施例1的复乳法来制得F1TC标记的PLGA纳米颗粒F工TC PE NP。 实施例3:靶向纳米颗粒的制备
1毫升的PLGA纳米颗粒(实施例1产品P1': NP)溶液(5 yg/ul， PE-NP溶于 pH 6. 3的10 mM NaHJ〕a水溶液)禾口 10y 1 的 50 rag/ral EDC
(1-ethyl-3--(3-dimethylaminopropyl)-'carbodiiniide) 7JC溶液、10 u 1的50 mg/ml NHS (N-hydroxysuccinimide)水溶液共同避光孵育20分钟后，30000g离 心10分钟后除去卜.清，然后将溶于50 mM HEPES缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸， 4一- (2—hydroxyerhyl) pipe:razirie'」1-一 erhar)esulfonic acid) (pH 7. 4)白勺SM5國—1 或anti--CD25 Fab' (1 y g/'y 1)加入到沉淀的纳米颗粒中避光反应2小时后， 离心，水洗后制得连接抗休片段的纳米颗粒PE NP S或PE NP Cl〕25。 NP-S的制备可以利用实施例l得到的NP经过实施例3的步骤得到。 FITC-- PE-NP-S的制各可以利用实施例2得到的FITC-PE-NP通过实施例3的步 骤得到。 实验例
除非特别说明，以下实验例均利用上述实施例得到的产品进行实验 实验例1:包裹效率、平均粒径和粒径分布测定
被PLGA纳米颗粒包裹进去的PE38KDEL I的百分比为包裹效率，每毫克纳 米颗粒中PE38KDEL I的含药量为PE38KDEL I的载药量，抗体片段连接效率为 每毫克的PLGA纳米球连接的抗体片段的质量，包裹效率、PE38KDEL I的载药量 和抗体片段连接效率都是通过Micr。BCA protein assay kit (Pierce, Rockford，IL)按说明书方法-进行测定(()f.ra Ber、ny， Maayan Duvshani Eshet， Theresa Cargioli， Lorenzo Bello, Andreas Bikfalvi， Rora S. Carroll, andMarcelle Mach丄uf, Continuous Delivery of Endogenous Inhibitors from Poly (Lactic-Co-Glycolic Acid) Polymeric Microspheres —Inhibits Glioma Tumor Growth, Clinical Cancer Research 2005; 768 (U) : 768 76)。纳米颗粒的 平均粒径和粒径分布是由粒径仪Zeta Sizer 3000HS (Ma]vern， UK)测定的。纳 米颗粒的表面形态和粒径是通过投射电镜JE()L 2010 Transmission Electronic Microscopy观'J定白勺。
结果PE-NP-S的包裹效率为41.8 ± 2.3%， PE38KDEL I的载药量是8. 5 ± 0.2 ug/mg，抗休连接效率是19. 4 ± 2. 4 iig SM5-1的Fab' /mg纳米颗 粒(mean ± SD; n = 4)。通过Zel:a Sizer 3000HS粒径仪测量，PE-NP-S的平 均直径为107.7 ± 30.9 ran (mean ± SD; n : 10)。通过透射电镜TEM的观察， 我们发现PE-NP-S的形状为圆形，而且粒径分布比较狭窄为107. 67 ± 27, 6 nm， 见图1。
对于PE-NP-CD25进行上述实验也得到了相同的结果。 实验例2:竞争性结合的结合和内吞活性实验
竞争性结合实验lXl(TCh-hep--3细胞和亚饱和浓度的FITC标记的鼠源 SM5-1(制备方法参见U. Trefzer, N. Rietz， Y. Chen， H. Audring, G. Herberth， P. Siegel, S. Reinke， P. Koniger, S. Wu， J. Ma， Y. Liu， H. Wang, W. Sterry, Y. Guo, SM5-1: a new monoclonal antibody which is highly sensitive and specific for melanocyt丄c lesions, Arch. Dermato丄.Res. 292 (2000) 583 - 589.)和逐渐增高浓度的鼠源SM5-1、 Mut -T或PE-NP-S在4"C孵育1小时，同时以CD25-PE38KDEL、 PE NP CD25作为阴性对照。细胞通过离心洗涤以后用 流式细胞仪进行分析。流式细胞仪结果用FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose， CA)来分析。竞争者的ICM (半数抑制浓度)用四参数算 法来计算，结果见图2，结果表明PE-NP-- S和Mut I都可以竞争性阻断鼠源SM5-1 结合Ch-hep-3细胞，意味着它们都保留r特异性结合SM5 J结合蛋白抗原的 能力。PE-NP-S的亲和力(平均IC5o士SD，n二3)为0.40 ± 0.02呢/ml，大大高于 Mut陽I的亲和力(16.47 ± 2.69 (ig/ml)，而和鼠源SM5-1的亲和力(0.32 ± 0.03 吗/ml)相似，意味着把SM5-1的Fab'抗体片段连接到纳米颗粒上没有改变它的 结合活性，最大荧光强度定义为在没有竞争抗体时，FITC标记的鼠源SM5-1对 Ch-hep-3细胞进行染色得到的平均荧光强度。
结合和内吞实验通过共聚焦显微镜来测定Ch-h印-3细胞和PE-NP-S在37 。C孵育0， l或30分钟，然后用PBS洗涤两次，用10毫升的4XPFA(多聚甲醛) 固定30分钟。最后，细胞用Leica TCS SP2 Corifoca] Spectral Microscope (UV-VIS)进行拍照，照片用Leica共聚焦软件分析，结果见图3，结果显示通 过l分钟的孵育，FITC的荧光仅仅在Ch-h印-3细胞表面被检测到(图3-1)， 在孵育30分钟以后，FITC荧光可以在Ch-h印-3细胞胞质内可以清楚的被检测 到(图3-2)。然而，在SM5-1结合蛋白抗原表达阴性的细胞株QGY7701，则没 有检测到任何FITC荧光(图3-3)。
另外，本发明的发明人利用PE-NP和PE-NP-CD25进行了同样的实验，实 验结果表明PE-NP和PE-NP-CD25与PE-NP--S结果相反，表明其均不能结合到细 胞表面抗原从而不能被Ch hep-3细胞内吞。
本发明的发明人利用另外一株SM5-1结合蛋白抗原表达阳性的细胞株Ch-hep-1也得到了与上述实验相似的结果。 实验例3:体外细胞毒性实验
二株肝癌细胞在96孔板中以1 X 107孔的密度在37°C， 7. 5XC02中培养 24小时后，和PE-NP-S、 Mut--1或PE38KDEL I 、 PE--NP + SM5 -1 Fab' 、 PE-NP-CD25 在37。C共孵育两天，药物中PE38KDEL 1的浓度为丄到10， 000 pM。细胞生存率 用细胞效价非放射性细胞增殖试剂盒(Cell Titer 96 non--radioactive cell proliferation assay kit, P画ega， Madison, WI， USA)来进行测定。简要 地说，20 til of MTS/PMS溶液加到每个孔中，在37-C孵育两个小时以后，用 全自动定量绘图酶标仪在490 nm波长进行读数，结果见表1。
"数据显示为平均值士标准差(n = 3).
表1显不，高表达SM5-1结合蛋白抗原的Ch -h印-3细胞对PE-NP-S最敏感 (IC邓二 32. 39 pM)。中度表达SM5-1结合蛋白抗原的Ch-h印-1细胞对PE-NP-S 也比较敏感(IC5。 = 82. 26 PM)。然而，表达SM5-1结合蛋白抗原阴性的QGY7701 细胞对PE-NP-S相当不敏感 〔IC,W 〉2000 pM)。对Mut-1来说，我们得到了相 似的结果，这意味着PE-NP-S和Mut-工对表达SM5--1结合蛋白抗原的乳腺癌细 胞株的特异性结合活性对细胞毒性起着关键性作用。和Mut-1比起来，PE-NP-S 对Ch-h印-3细胞的细胞毒性更大(PE-NP-S的IC'5。为32.39 ± 5.36 pM，而 Mut-I的IC,。为82.26 ± 9.58 pM (mean ± SD);两者具有显著统计学意义，
表1药物对肝癌细胞株的IC5G (pM)
IC50 (pM)
gGY7701
>2000代0.05)(表1)。在Ch-h印-l细胞中也得到了相似的结果。然而，PE-NP和SM5-1 的Fab，的混合物(SM5-1的Fab'量和结合到PE-NP-S上的SM5-1的F油'的 量一样)、PE-NP-CD25对这二株细胞株有非常高的工C:，。值，意味着PE-NP-S的细 胞毒性是依赖结合在纳米颗粒上的SM5 -1的Fab'，而不是游离的SM5-1的Fab'。
本发明的发明人同时也利用未包裹PE38KDEL I的NP和NP -朋R进行了上述 的细胞毒性实验，结果表明未包裹PE38KDELI，这些纳米颗粒几乎无细胞毒性。 实验例4:非特异毒性和肝脏酶实验
8只雌性BALB/c小鼠静脉注射200 u 1剂量逐渐提高的药物，在两个星期 内观察动物的死亡率。U^,定义为杀死50%的动物需要的PE38KDEL I的剂量， 是通过trimmed Spearman-Karbar统计方法来得出。肝脏损害则通过对血浆中 ALT的酶活性来进行定量分析(上海生物制品研究所提供的ALT检测试剂盒检 测)。不同剂量的药物通过静脉注射的方式注射入BALB/c小鼠，几乎所有的死 f:均发生在注射3天之内，Mut-1和PE38KDEL I的LD.^值为11.56 mg/kg，相 反的是，PLGA包裹的PE38KDEL I则能够很好的被小鼠耐受PE-NP-'S， PE-NP 和PE-NP-CD25的LDs(,值为52. 79 mg/kg。为了评估PLGA包裹PE38KDEL I的肝 脏毒性，小鼠在接受各种药物的静脉注射以后(剂量为5 mg/kg PE38KDEL 1)， 在3小时和24小时我们收集了血样品，PLGA包裹的PE38KDEL I的剂量指的是 PE-NP在37°C中24小时释放PE38KDEL I的累积量，在注射Mut-'I和PE38KDEL I 以后，血浆中的ALT水平显著增加，然而，在注射等量的PE-NP-S， PE-NP和 PE-NP-CD25以后，ALT的血浆水平没有显著改变。 实验例5:抗PE抗体测定实验
小鼠对PE38KDEL I的IgG反应实验24只雌性BALB/c小鼠( 20 g)分为6组，每组在第1、 14天时腹腔免疫1 mg/kg的PE38KDEL I，血样在第天 免疫后在第21天收集。ELISA (酶联免疫吸附测定)平板用PE38KDEL I进行包 被后，通过ELISA来测定血清中对PE38KDEL I的特异性IgG抗体。测定抗体是 连接HRP(辣根过氧化物酶)羊抗鼠IgG抗体(Zymod Lab， San Francisco, CA)， DAB (3,3' 二氨基联苯胺)用作反应底物。第1天免疫以后的第21天收集血清 样品，用ELISA来测定血清中的鼠抗PE38KDEL I IgG抗体水平，PE-NP-S、 Mut--1: 及相关对照品的测定也同，结果见图4-1,结果显示，PE NP-S和Mut-I相比其 吸光度有统计学差异，PE38KDEL I和Miit- I的产生了.高滴度的抗PE38KDEL I IgG。 相反的是，PENP-S的免疫原性则很低。
抗PE中和性实验是用SM5-l结合蛋白抗原表达阳性的乳腺癌细胞株来进行 在96孔板中每孔接种1X1(T Ch-h印-3细胞，在37"C孵育24小时。第二天，小鼠 免疫l mg/kg PE38KDEL I (在第l,， 14和28天分别免疫一次)后收集的第42天的 血浆样品在56i:热灭活30分钟后，用培养液十倍比稀释。200 pM PE-NP-S或者 Mut-1 (PE38KDEL I剂量)加到每个稀释血浆样品后孵育30分钟后，将混合物和 各种对照都加入到Ch-h印 3细胞中，在37。C继续孵育48小时，细胞生存率用细 胞效价非放射性细胞增殖试剂盒(Promega， Madison, WI， USA)来进行测定， 结果见图4-2，结果表明Mut--I对C:h-h印-3的细胞毒性能被抗PE中和性血清剂量 依赖性抑制。特别的，禾[J200pMMut-:1、未稀释的中和性血清共孵育的Ch-h印3 的细胞生存率为98%，这意味着Mut-I的细胞活性完全被消除了。然而，PE-NP-S 对Ch-h印-3的细胞毒性则没有被抗PE中和性血清显著影响(数据显示为平均值 土标准差(n :二 4). ***，.代O. 001; PE-NP-S和Mut. I组的细胞生存率的比较显 示出统计学差异(two-sample individual t test))。在Ch--h印l细胞中我们也得到了相似的结果。
同时，我们也用ELISA来证实了抗PE中和性血清不能中和SM5-1或SM5-l的
F油'。
实验例6:抗肿瘤活性实验
5 X ](f Ch -h印 3细胞在第0天皮下注射到MLB/c:裸鼠( 20 g)中， 在第5天肿瘤体积达到了 50 mm:1。从第5天开始，小鼠开始接受静脉注射药物， 在第5， 7,和9天进行，每天两次。共有八个治疗组，分别为PBS、 PE38KDEL1 (5mg/kg)、PE-N:P(5mg/kg) 联合SM5-1Fab， (5. 25 mg/kg) 、PE NP-CD25 (5mg/kg)、 PE-NP…S (0. 5 mg/kg) > PE-NP-S (2. 5 mg/kg) 、 Mut-1 (0. 5 ing/kg)、 Mul:I (5mg/kg)，每组都有6只老鼠，肿瘤每5夭用游标卡尺测量 一次，共观 察40天。肿瘤体积=(宽2X长)/2。所有的老鼠都来自上海屮科院，老鼠放 在无病原微生物的环境中饲养，饲养--星期以后再用作实验小鼠。
实验结果见图5，实验结果表明Mut :I和PE-NP -S对肿瘤的抑制显示出剂量 依赖性。对于完全的肿瘤消退，定义为完全的肿瘤消失达50天。我们发现，0.5 mg/kg X 6的Mut-1可以使1只小鼠完全肿瘤消退。在5mg/kg X 6的Mut-1 治疗组，在6只小鼠中我们观察到了完全的肿瘤消退。然而，PE-NPS的抗肿瘤 活性得到了极大的提高；在0.5mg/kg X 6的PE--NP-S治疗组，有2只小鼠完 全肿瘤消退；而在2. 5mg/kg X 6的PE-NP-S治疗组，所有的小鼠达到了完全 的肿瘤消退；这些数据清楚的显示了提高免疫毒素治疗剂量的有效性。相反， 高达5 mg/kg PE38KDEL I的对照药物治疗没有任何抗肿瘤活性。这些数据显示 /给更髙免疫毒素治疗剂量的有效性。
综合上述实验例，可以看出，PE--NP-S禾口 Mut-1对小鼠的毒性PE-NP-S的LD「，',为52. 79 mg/kg，而Mut-1的LD「v,为U. 56 mg/kg，注射5 rag/kg的PE-NP-S 没有引起肝脏明显的损害，相反，5mg/kg的Mut I对肝脏有严重的损害，这些 结果提示PE38KDEL :[通过PLGA包裹后，其毒性大大减小。另夕卜，PE-NP-S比 Mut-i有更小的免疫原性，而且在体外对抗PE中和性抗体更加不敏感，抗PE 抗体测定证实了和抗PE中和性血清共孵育后，PE-NP-S的对SM5-1结合蛋白抗 原阳性的肝癌细胞株的细胞毒性没有被明显影响，相反，Mut-1则完全丧失了它 的细胞毒性。此外，在预免疫PE38KDEL I、长有高表达SM5-1结合蛋白抗原肝 癌小鼠中的PE-NP-S和Mut-1的抗肿瘤活性中，尽管在血循环中存在抗PE中和 性抗体，PE-NP S仍然显示出强大的抗肿瘤活性，而Mut-I则没有。PE-NP-S减 少的敏感性可能是由于PLGA的包裹和它的快速内吞。PE-"NP-S对SM5 1结合蛋 白抗原有特异性的结合，而且几乎完全被SM5-1结合蛋白抗原阳性肿瘤细胞内 吞。由于选择性的内吞，PE-NP--S可以有效的引起SM5-1结合蛋白抗原阳性细胞 死亡，而对SM5-〗结合蛋白抗原阴性细胞毒性较小。PE -NP-S选择性杀伤SM5 1 结合蛋白抗原阳性细胞的原因是纳米颗粒表面的SM5-1抗体片段介导了内吞， 然后纳米颗粒巾的药物释放出来杀伤细胞。对SM5-1结合蛋白抗原阳性肝癌细 胞株的细胞毒性比Mut-1更大是因为靶向纳米颗粒比免疫毒素具有更高的转运、 结合能力。体内抗肿瘤实验证实了 PE-NP-S的抗肿瘤活性是Mut-1的两倍，另 外，PE-NP-S的体内毒性是Mut-1的1/5;所以> PE-NP-S的治疗效率提高了 10 倍。PE-NP--S有效的抗肿瘤效应的机制可能是由于靶向纳米颗粒的双相转运在 第 一相转运中，纳米颗粒的在肿瘤组织中缓慢聚集，而且由于增强的渗透和滞 留效应，纳米颗粒在肿瘤组织的浓度会得到进一步提高；在第二相，通过配体--
受体互相作用，靶向纳米颗粒结合并被肿瘤细胞内吞。关于re静-S的组织分布的进一步研究则在进行中。另外，纳米颗粒的粒径对其在体内的分布起着重
要的作用。100 200mii的纳米颗粒可以逃避网状内皮系统的吞噬，在体内的循 环时间达到最长。通过复乳溶剂蒸发法，得到了平均粒径为107.67 ± 27.6 nm 的PE NP S，具有长循环的特征。更为重要的是，本发明的发明人选择了 t叶u扁〕SM5 l结合蛋白抗原的Fab'片段，而不是完整的抗体来作为PE -NP-S的 靶向分子，这也可以减少肿瘤相关巨噬细胞对纳米颗粒的吞噬，而且纳米颗粒 对实体瘤的渗透也更加广泛。
本发明的发明人还对本发明中公开的PE-NP-S进行了体外释放实验(体外 释方夂实马佥参照、Gaspar MM， Blanco D， Cruz ME， Alonso MJ. Formulation of I. 'aspamgjna.se-loaded poly (lactidc-co-glycolide) nanopa:rt.:i cles: -jn.nuerice of polymer properties on enzyme loading, activity and [,_//:ro release. J Control Release 1998;52:53--62.进行)，实验结果显示1小时以 后，仅仅2. 9%的PE38KDEL I从PE-NP中释放出来，使得中和性抗体不太可能 完全中和PE，因为接种PE构建的免疫毒素后，动物会引起抗PE免疫反应， PE-NP- S对中和性抗体减小的敏感性可以增加重复应用药物的有效性，这些研究 为克服针对PE38KDEL I的中和性抗体提供了有益的尝试。PE-NP-S有更小的免 疫原性，原因可能为纳米颗粒的粒径较小，100 200nm的纳米颗粒更少被巨噬 细胞吞噬，而巨噬细胞吞噬在激活免疫反应方面起着重要的作用。
总之，PE-NP-S显示出更好的抗肿瘤活性，而且具有更小的非特异毒性和免 疫原性，对抗PE中和性抗体的敏感度更低。 对照例包裹蛋白的生物学活性实验
利用与实施例1相同的方法(只是没有加入10%海藻糖或加入其它添加剂(如]%甘油，]%PEG400)替代海藻糖)得到的PE-NP与利用实施例1的制备 方法得到的PE-NP进行了包裹蛋白的生物学活性实验(实验方法参见用Flexi Rabbit Reticulocyte Lysate System体外蛋白翻译试剂盒测定蛋白的生物学 活性(Promcga公司))，未包裹的PE38KDEL的ICW)值(半数抑制浓度)为4. 76 ±2.25 pmol (mean ± SD， n —」3)，而包裹后的PE38KDEL的ICS"值为4.99 ±2.96 praol (mean ± SD， n 二 3)， P〉 0.05，两者比较没有显著性差异，表 明利用实施例1的制备方法得到的PE-NP提取出来的PE38KDEL I保持了和未包 裹的PE38KDEL I相似的活性。而对于没有加入10%海藻糖或加入其它添加剂(如 1%甘油，1%PEG400)替代海藻糖利用实施例1相同的方法得到的PE--NP，提取 得到的PE38K!〕RL .[的活性和未包裹的PE38KDEL :f相比，其活性均大大降低。
本发明的发明人按照实施例中公开的方法得到了内包裹蓖麻毒素外连接 人源化SM5 1抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒，取得了和上述试验例一 致的抗肿瘤效果。
另外，本发明的发明人还利用包裹PE38KDEL I型突变体的聚乳酸-羟基乙 酸共聚物连接抗Her2的人源化单克隆抗体的Fab'片段用于治疗Her2表达阳性 的肿瘤，也获得了与本发明目的一致的良好的治疗效果。
权利要求
1. 一种内包裹免疫毒素外连接抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒。
2. 权利要求1所述的纳米颗粒，其中免疫毒素为篦麻毒素、白喉毒素、PE38KDEL I型突变体之一，抗体为人源化抗体或人源化抗体的Fab'片段。
3. 权利要求2所述的纳米颗粒为内包裹re38KDEL :1型突变体外连接人源化 SM5-i抗体Fab'片段的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒。
4. 权利要求3所述的纳米颗粒，其粒径为70 140 nm，包裹效率为35 45 %， 抗体连接效率为15 25yg /mg纳米颗粒。
5. —种制备权利要求:1罕:4任一所述的纳米颗粒的方法，包括首先制备包裹免 疫毒素的纳米颗粒，然后在纳米颗粒表面连接抗体两个步骤。
6. 权利要求5所述的方法，其中制备包裹免疫毒素的纳米颗粒步骤包括a) 将免疫毒素溶解到水性溶液屮然后和聚乳酸羟基乙酸共聚物一起加入到油 性溶剂，超声得到油包水的初乳；b) 利用a)得到的初乳制备复乳；c) 复乳再加入到聚乙烯醇溶液中后，搅拌使有机溶剂挥发，溶液经过离心、水 洗，低温冻干即制得成品纳米颗粒。
7. 权利要求6所述的方法，其中步骤a)中的水性溶液为PBS，油性溶剂为乙酸 乙酯。
8. 权利要求6所述的方法，其中步骤a)还包括在溶解了免疫毒素的水性溶液中 加入海藻糖。
9. 权利要求5的方法，其中在纳米颗粒表面连接抗体步骤包括将包裹免疫毒素 的纳米颗粒和EDC、 NHS在避光的条件下共同孵育，然后将溶于HEPES (pH7.4)的抗体或抗体片段加入到沉淀的纳米球中避光反应而得。
10. 权利要求l-4任一所述的纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的用途。
11. 权利要求10所述的用途，其中肿瘤为SM5 1结合蛋白抗原或Her2表达阳 性的肿瘤。
12. 权利要求ll所述的用途，其中SM5 l结合蛋白抗原表达阳性的肿瘤为乳腺 癌、黑色素瘤和肝癌。
13. 权利要求12所述的用途，其中SM5 1结合蛋1二—l抗原表达阳性的肿瘤为肝癌。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明公开了一种内包裹毒素外连接抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒、其制备方法及用途。本发明公开的内包裹PE38KDEL I型突变体外连接人源化SM5-1抗体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有抗肿瘤活性高、非特异毒性和免疫原性小、对抗PE中和性抗体的敏感度低的优点，可用于制备抗肿瘤药物。
文档编号A61K47/48GK101450215SQ20081017793
公开日2009年6月10日 申请日期2008年11月19日 优先权日2007年12月4日
发明者庚 寇, 李博华, 皓 王, 郭亚军, 洁 高 申请人:上海中信国健药业有限公司