专利名称：葡萄球菌肠毒素小分子抗体及制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程重组抗体，特别涉及一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体及制备方法及用途。
背景技术：
葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)是由血衆凝固酶或耐热核酸酶阳性葡萄球菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis, SE)等产生的一组单肽链可溶性胞外蛋白质毒素。该毒素家族结构相关、毒力相似，但抗原性不同，其中以金黄色葡萄球菌产生的肠毒素致病力最强，是导致食物中毒的常见重要致病因子。迄今，世界诸多国家都曾相继报道金黄色葡萄球菌的暴发流行，其中，美国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，而我国每年此类中毒事件则占约25%。葡萄球菌的易感染性及其肠毒素的强致病性不仅严重危害人类健康，且直接间接经济损失巨大。除引起急性胃肠炎外，葡萄球菌肠毒素还可引发毒性休克综合症(Toxic shock-like syndrome, STSS),亦与川崎疾病、银屑病等免疫疾病相关，已成为世界性卫生问题。葡萄球菌肠毒素为分子量较小的简单蛋白，约27.5^30.0kDa，易溶于水及盐溶液，对胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶有抵抗作用，同时可耐受100°c煮沸30min而不被破坏。自从1959年葡萄球菌肠毒素被证实以来，已获得肠毒素类型共21种，根据血清学特征分类，包括早为人类发现和熟知的五种肠毒素SEA，SEB, SEC (C型又可分为Cl、C2和C3三亚型)，SED, SEE 和毒性休克综合症毒素 I(Toxic shock syndrome toxin-1, TSST-1,既 SEF),以及近几年相继发现的 SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SE0, SEP, SEQ, SER, SET, SEU等多种新型肠毒素。葡萄球菌肠毒素的生物活性以催吐活性和超抗原活性为主，表现在引发类似细菌内毒素诱导的发热反应、致命性休克、增强宿主对内毒素敏感性、细胞因子分泌，以及刺激T细胞快速增殖等。研究表明，并非所有的肠毒素都具有催吐活性，其中以SEA和SED最常见，并以SEA毒力最强，摄入I μ g即能引起中毒。虽然已从基因水平对传统及新型肠毒素加以区分，但关于其毒素蛋白及功能的研究甚少，尚无借鉴资料，因此广泛获得不同动物及动物性食品中葡萄球菌株，提纯天然肠毒素蛋白，可为研究葡萄球菌肠毒素检测方法及其功能活性奠定基础，对丰富其认识亦有重要意义。目前，葡萄球菌肠毒素导致食物中毒机制有待于进一步证实，从免疫机制研究，可能与其介导大量细胞因子释放而引起多器官损害有关。与此同时，作为第一个被发现的超抗原，其独特高效的诱导机体免疫机制依旧倍受关注。新生物构建技术与其固有生物特性的结合，葡萄球菌肠毒素研究及应用前景将更为广阔。对于葡萄球菌肠毒素蛋白的检测方法和治疗手段多基于免疫原理，但均受到传统抗体制备技术的制约，如多克隆抗体特异性差，单克隆抗体分子量大，亲和力弱，免疫原性强，应用于人体时 HMAM反应强烈等缺陷。随着分子生物学的进一步发展，抗体技术也逐步由细胞工程抗体(单克隆抗体)向基因工程抗体演替。基因工程抗体，又被称为第三代抗体，主要技术领域包括人源化抗体、小分子抗体、抗体库技术。基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。此技术的基本原理是，首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA，逆转录成cDNA后，经PCR分别扩增出抗体的轻链及重链可变区基因，按特定方式连接克隆到表达载体后，表达、折叠成功能抗体分子，筛选出高表达的细胞株，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。该技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分，保留原有抗体的亲和力和特异性，可以对完整抗体及抗体片段进行改造，且不受伦理和技术等因素的制约，发展迅速。小分子抗体是基因工程抗体技术的重要应用产物，可应用于寄生虫抗原表位、自身免疫疾病、基因治疗、肿瘤印象分析与治疗等方面。小分子抗体分子量约为完整IgG的1/6，有利于穿透肿瘤组织，并避免了传统制备方法中细胞杂交的过程，减少工作量，提高制备成功率。另外，此类抗体保留完整抗原结合位点，并缺失Fe片段，减少了与FcR阳性细胞发生非特异性结合的可能性，最大限度地降低鼠源性蛋白的同时，降低了免疫变态反应的可能性。现阶段，小分子抗体的技术路线普遍采取将轻链可变区和重链可变区基因通过寡聚核苷酸以串联方式连接后，经原核系统表达，折叠后形成只由重链和轻链可变区构成的单链抗体。该传统方法虽宜于基因工程操作及大量制备抗体，但其导致的轻链或重链肽链反向、缺乏糖基化修饰、折叠错误等缺陷，使得所获抗体空间构象有别于天然抗体，进而影响抗体的特异性和亲和力。基因工程重构抗体技术日趋成熟，但将其应用于葡萄球菌肠毒素抗体的研究，国内外罕有报道，且研究对象仅局限于SEB、SEC等少数传统肠毒素。综述其基本路线为:查找相关IgG抗体的基因序列，分析抗体基因的结构及完整性，利用PCR技术分别扩增其重链可变区和轻链可变区基因序列，再通过LinkeH多采用(Gly4Ser)3)将二者连接，克隆到表达载体后转入表达系统。2009年，Kalinina等建立抗SECl基因重构抗体原核表达体系，但受到表达系统蛋白修饰功能缺乏的制约，其蛋白活性表现受阻，该抗体与SEA、SEB、SED、SEE、SEG和SEI均有不同程度交叉反应，特异结合能力有待提高；2010年，Pawan等通过PCANTAB5E载体系统制备出特异性强和亲和力高的抗SEB单链抗体，但研究发现该表达系统随时间推移分泌能力逐渐消失，稳定性缺陷突显。`
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种应用于葡萄球菌肠毒素检测的葡萄球菌肠毒素小分子抗体。本发明的第二个目的是提供一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体的用途。本发明的技术方案概述如下:一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体，是序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体的制备方法，包括如下步骤:(I)制备葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12 ；(2)采用Trizol法提取葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12总mRNA，以oligo(dT) 18为引物,逆转录合成cDNA ；(3)在相对保守的FRl区和FR4区，设计由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12表达的单抗的轻链可变区基因的上、下游简并引物，分别为SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.9所示，以及由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12表达的单抗的重链可变区基因的上、下游简并引物，分别为SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示；以cDNA为模板，PCR扩增获得轻链可变区基因和重链可变区基因，分别克隆至pUC-T simple载体，经测序及IMGT/V-QUEST,BLAST分析，确认所获序列符合鼠源抗体可变区经典结构，均为功能性V (D)J重排模式，其中，轻链可变区基因为SEQ ID N0.2所示，其编码的多肽为SEQ ID N0.3所示；重链可变区基因为SEQ ID N0.4所示，其编码的多肽为SEQ ID N0.5所示；(4)设计轻链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ ID N0.12和SEQ IDN0.13所示，以SEQ ID N0.2所示序列为模板，通过PCR扩增，使轻链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位点；设计重链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ IDN0.14和SEQ ID N0.15所示，以SEQ ID N0.4所示序列为模板，通过PCR扩增，使重链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Nhe I和Hind III酶切位点，同时在轻链可变区基因序列和重链可变区基因序列的N端引入Kozak序列；(5)经酶切、连接，将步骤(4)获得的修饰的重链可变区基因序列插入真核表达载体 pcDNA3.1 (+)，获得 pcDNA3.1-Vh 过渡载体；另以pIRESneo质粒为模板，以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17所示核苷酸为上、下游引物，通过PCR扩增获得ivs-1RES序列；同时以步骤(4)获得的修饰的轻链可变区基因序列和ivs-1RES序列为模板，以SEQ ID N0.12所示核苷酸为上游引物，以SEQ ID N0.17所示核苷酸为下游引物，采用两步法重叠PCR方法，扩增获得带有后续重组操作BamHI和XbaI酶切位点的ivs-1RES-'融合基因片断，插入所述pcDNA3.1-Vh过渡载体，构建真核单启动子共表达重组载体P5C12HIL0，其中，5'-VH-1vs-1RES-VL_3'融合序列为SEQ ID N0.6所示，p5C12HIL0质粒序列为SEQ ID N0.7所示；(6)通过Lipo2000脂质体介导瞬时转染哺乳动物细胞BHK-21细胞系，经PCR鉴定和G418抗性筛选，获得稳定表达分泌细胞系。上述抗体在葡萄球菌肠毒素检测中的应用。其中检测为细胞间接免疫荧光检测法或流式细胞术检测法。本发明设计并构建葡萄球菌肠毒素单抗轻链、重链可变区基因的真核单启动子共表达载体，分别于轻链、重链C端引入半胱氨酸残基，结合细胞内肽段自组装原理形成链间二硫键，模拟天然抗体的抗原结合域空间构象，获得高效表达稳定分泌哺乳动物细胞系及特异性高、亲和力强的小分子抗体。 实验证明，本发明的葡萄球菌肠毒素小分子抗体可以应用于葡萄球菌肠毒素检测中，可以应用于细胞间接免疫荧光检测和流式细胞术检测。本发明中所涉及的葡萄球菌肠毒素为天然的葡萄球菌肠毒素或者通过原核表达获得的重组葡萄球菌肠毒素，该肠毒素优选为葡萄球菌肠毒素A、葡萄球菌肠毒素G、葡萄球菌肠毒素K、葡萄球菌肠毒素O、葡萄球菌肠毒素Q、葡萄球菌肠毒素U型中的一种或多种。
图1:葡萄球菌肠毒素单抗可变区基因克隆的电泳图片；图中A为轻链可变区基因扩增电泳图谱，M为DNA Marker2000,l为葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12的轻链可变区基因，2为阴性对照，3为空白对照。B为重链可变区基因扩增电泳图谱，M为DNAMarker2000,1为葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12的重链可变区基因，2为阴性对照，3为空白对照。图2:真核单启动子共表达重组载体P5C12HIL0质粒图谱。图3:细胞间接免疫荧光(IFA)结果图；图中a-g为SEA、SEA-his、SEG-his、SEK-his、SEO-his、SEQ-his、SEU-his 处理组，h 为阴性对照细胞系。图4:稳定表达细胞系识别天然及重组抗原流式细胞术(FCM)结果图。
图5:两步法重叠PCR反应程序。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。1.葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12的制备以SEO-GST融合蛋白为免疫抗原，免疫6周龄Balb/c小鼠4次，2周/次:初次免疫采用加入等量弗氏完全佐剂方法颈背部多点皮下注射，免疫抗原剂量为IOOyg/只；二次免疫采用加入等量弗氏不完全佐剂方法颈背部多点皮下注射，免疫抗原剂量为100 μ g/只；第三次及终次免疫不加佐剂，采用尾静脉注射，免疫抗原剂量为50 μ g/只。处死已结束免疫的Balb/c小鼠，无菌取脾，制备免疫脾脏细胞悬浮液备用。通过PEG法体外融合免疫脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞，步骤如下:分别吸取并混匀IX IO8个免疫脾细胞和5 X IO7个SP2/0细胞，1000r/min离心lOmin，弃上清；缓缓加入lmL37°C预温的PEG4000融合剂，作用90s后使用DMEM液终止反应，800r/min离心lOmin，弃上清；加入适量HAT选择培养基，以1000个cell/孔铺于96孔细胞培养板中，每2天更换培养液，持续筛选7d ;阳性细胞通过有限稀释法单克隆后， 逐步扩大培养，制备得到葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12。2.单抗杂交瘤轻链、重链可变区基因克隆、测序分析及表达载体的构建(I)选取稳定分泌抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞5C12株，采用Trizol法提取葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12的总mRNA，以oligo(dT)18为引物，逆转录合成cDNA。(2)分别在相对保守的FRl区和FR4区，设计由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12表达的单抗的轻链可变区基因的上、下游简并引物，分别用SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.9所示，以及由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12表达的单抗的重链可变区基因的上、下游简并引物，分别为SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示；以cDNA为模板，通过PCR扩增获得轻链可变区基因\和单抗重链可变区基因VH。轻链可变区基因PCR反应体系(50 μ L):
权利要求
1.一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体，是序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。
2.一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体的制备方法，包括如下步骤: (1)制备葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12； (2)采用Trizol法提取葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12总mRNA，以oligo(dT)18为引物，逆转录合成cDNA ； (3)在相对保守的FRl区和FR4区，设计由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12表达的单抗的轻链可变区基因的上、下游简并引物，分别为SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9所示，以及由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12表达的单抗的重链可变区基因的上、下游简并引物，分别为SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示^cDNA为模板，PCR扩增获得轻链可变区基因和重链可变区基因，分别克隆至pUC-T simple载体，经测序及MGT/V-QUEST, BLAST分析，确认所获序列符合鼠源抗体可变区经典结构，均为功能性V (D) J重排模式，其中，轻链可变区基因为SEQ ID N0.2所示，其编码的多肽为SEQ ID N0.3所示；重链可变区基因为SEQ ID N0.4所示，其编码的多肽为SEQ ID N0.5所示； (4)设计轻链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQID N0.12和SEQ ID N0.13所示，以SEQ ID N0.2所示序列 为模板，通过PCR扩增，使轻链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位点；设计重链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQIDN0.14和SEQ ID N0.15所示，以SEQ ID N0.4所示序列为模板，通过PCR扩增，使重链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Nhe I和HindIII酶切位点，同时在轻链可变区基因序列和重链可变区基因序列的N端引入Kozak序列； (5)经酶切、连接，将步骤(4)获得的修饰的重链可变区基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1 (+)，获得 pcDNA3.1-Vh 过渡载体； 另以PlRESneo质粒为模板，以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17所示核苷酸为上、下游引物，通过PCR扩增获得ivs-1RES序列；同时以步骤(4)获得的修饰的轻链可变区基因序列和ivs-1RES序列为模板，以SEQ ID N0.12所示核苷酸为上游引物，以SEQ ID N0.17所示核苷酸为下游引物，采用两步法重叠PCR方法，扩增获得带有后续重组操作BamHI和XbaI酶切位点的ivs-1RES-'融合基因片断，插入所述pcDNA3.1-Vh过渡载体，构建真核单启动子共表达重组载体P5C12HIL0，其中，5'-VH-1vs-1RES-VL_3'融合序列为SEQ ID N0.6所示，p5C12HIL0质粒序列为SEQ ID N0.7所示； (6)通过Lipo2000脂质体介导瞬时转染哺乳动物细胞BHK-21细胞系，经PCR鉴定和G418抗性筛选，获得稳定表达分泌细胞系。
3.权利要求1的抗体在葡萄球菌肠毒素检测中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是所述检测为细胞间接免疫荧光检测法。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征是所述检测为流式细胞术检测法。
全文摘要
本发明公开了一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体及制备方法及用途，一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体是序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。本发明设计并构建葡萄球菌肠毒素单抗轻链、重链可变区基因的真核单启动子共表达载体，分别于轻链、重链C-端引入半胱氨酸残基，结合细胞内肽段自组装原理形成链间二硫键，模拟天然抗体的抗原结合域空间构象，获得高效表达稳定分泌哺乳动物细胞系及特异性高、亲和力强的小分子抗体。本发明的葡萄球菌肠毒素小分子抗体可应用于葡萄球菌肠毒素检测，细胞间接免疫荧光检测和流式细胞术检测。
文档编号C12N15/11GK103224561SQ20131001612
公开日2013年7月31日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者黄金海, 刘鹏翀, 孙盈 申请人:天津大学