Sem单克隆抗体的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学技术领域，具体地，涉及一种SEM单克隆抗体的制备方法及应 用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins，简称SEs)，是由金黄色 葡萄球菌产生，能引起人类食物中毒、呕吐腹泻、休克的重要致病因子。目前已发现的肠毒 素有23种血清型，SEM属于新型肠毒素，其理论分子量为24. 842KD。据文献报道，sem基因 往往以基因簇（egc)的形式存在。因此，含有SEM的食品原料往往含有其他肠毒素。因此， 利用SEM单克隆抗体建立SEM免疫学检测法，对控制金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食源性 疾病具有重大意义。
[0003] 传统免疫动物方法制备抗体的效率低，产量有限，并且其产生的血清多克隆抗体 为多种抗体的混合物，其与抗原反应的特异性不高，重复性低。而单克隆抗体理化性状高度 均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，是免疫学领域的 重大突破。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提一种SM单克隆抗体的制备方法，通过该方法所 制备的SEM单克隆抗体效价高、性质稳定、特异性强。
[0005] 此外，本发明还提供一种SEM单克隆抗体的应用。
[0006] 本发明解决上述问题所采用的技术方案是：SEM单克隆抗体的制备方法，包括以 下步骤：以重组SEM免疫BALB/c小鼠，再用小鼠的脾细胞直接与骨髓瘤细胞融合，采用间接 酶联免疫吸附法筛选产SEM单克隆抗体的优势杂交瘤细胞株，得到SEM单克隆抗体。
[0007] SEM具体是指金黄色葡萄球菌新型肠毒素M，SEM潜在威胁人类健康，因而我们需 要对SEM进行检测，目前对于SEM蛋白的研究较少，但在暴发的大规模的食源性疾病中sem 基因的检出率较高，目前检测SEM的方法只有PCR方法，因此为了快速检测食品原料中SEM， 必须制备SEM单克隆抗体，利用抗SEM单克隆抗体构建SEM免疫学检测法，从而达到快速检 测的目的；本发明在制备SHM单克隆抗体的方法中，采用重组SHM作为免疫原，重组SHM具 有免疫原性，能够直接激发免疫细胞产生特异性抗体，具有多个抗原决定簇，将其直接作为 免疫原作用于BALB/c小鼠制备单克隆抗体，可以同时制备出多种具有不同抗原决定簇的 单克隆抗体，可以用于构建双单抗夹心ELISA检测法。
[0008] 实验证明，通过本发明所述方法制备的SEM单克隆抗体效价高、性质稳定、纯度 高、特异性强、亲和力高。
[0009] 进一步地，重组SEM的制备与纯化过程为：以金黄色葡萄球菌的DNA为模板进行 PCR扩增，获得sem基因完整片段，采用NdeI和XhoI分别酶切PCR产物和pET-28a (+)，连 接，筛选获得重组质粒pET-28a-SEM，重组质粒pET-28a-SEM在表达场所内进行表达，表达 菌株进行培养、离心收集细胞菌体，再将细菌菌体超声破碎，离心弃沉淀，上清进行过镍琼 脂糖亲和层析、阳离子交换层析纯化收集，进一步浓缩，获得纯化的SEM重组蛋白。所述sem 基因序列在 GenBank 中的 accession number 为 KT853047。
[0010] 目前，蛋白的合成主要包括人工合成多肽以及用现有DNA模板依次进行PCR扩增、 酶切、测序、质粒重组、重组质粒进行细胞表达得到细胞菌体，细胞菌体进行纯化得到重组 蛋白，其中，通过人工合成的多肽分子量小，仅有一种抗原决定簇，因此由其制备的单克隆 抗体种类单一，并且人工合成的多肽为半抗原，由于半抗原缺乏免疫原性，不能直接激发免 疫细胞产生特异性抗体，因此，必须将半抗原与小鼠钥孔虫戚血蓝蛋白（KLH)和牛血清蛋 白（BSA)偶联作为免疫原才能得到特异性抗体，操作麻烦，本发明的SEM重组蛋白采用的 是以金黄色葡萄球菌的DNA为模板进行PCR扩增，获得SEM的完整基因序列（accession number:KT853047);用NdeI和XhoI分别酶切PCR产物和pET-28a(+)、连接，筛选获得重 组质粒pET-28a-SEM，通过本发明制备的SEM重组蛋白能直接激发免疫细胞产生特异性抗 体，并且可以同时制备出多种具有不同抗原决定簇的单克隆抗体，可以用于构建双单抗夹 心ELISA检测法。
[0011] 进一步地，重组的pET-28a-SEM质粒的表达场所为大肠杆菌。
[0012] 进一步地，优势杂交瘤细胞株采用辛酸-饱和硫酸纯化腹水，透析后得到SEM单克 隆抗体。本发明的纯化抗体的方法操作简单，不需特殊仪器，且蛋白损失小，纯化效果较为 理想。
[0013] 进一步地，重组SEM与等量完全或不完全弗氏佐剂混合搅拌法将其乳化，乳化完 全后用于免疫BALB/c小鼠。
[0014] SEM单克隆抗体的应用，所述SEM单克隆抗体用于制备检测样品中含有SEM的试剂 条或试剂盒。
[0015] 综上，本发明的有益效果是：
[0016] -般方法制备的单克隆抗体亲和力仅能达到106,但通过本发明所述的方法制备 的SEM单克隆抗体亲和力达10 8,说明本方法制备的SEM抗克隆抗体与抗原分子结合力更 强，可以大大提高构建SEM免疫学检测法的灵敏度；此外本发明制备的SEM单克隆抗体还具 有效价高、性质稳定、纯度高、特异性强等优点。因此，通过本发明所述的方法制备的SEM单 克隆抗体能够应用于试剂条或试剂盒，能够快速检测出样品中SEM的含量，能够用于建立 SEM的免疫学检测方法，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1是纯化的融合蛋白SEM的SDS-PAGE分析图；
[0018] 图2是纯化的融合蛋白SEM的WesternBlot分析图；
[0019] 图3是纯化的融合蛋白SEM的灰度分析图；图3中Rf是色谱法中表示组分移动位 置的参数；
[0020] 图4是纯化的融合蛋白SEM浓度的BSA标准曲线；图4中BSA是标准的结晶牛血 清蛋白Bovine Serum Albumin的缩写；OD值是光密度Optical Density的缩写，表示被检 测物吸收掉的光密度；
[0021] 图5是纯化的SEM单克隆抗体的SDS-PAGE分析图；
[0022] 图6是SEM单克隆抗体亲和常数分析图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例及附图，对发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不 限于此。
[0024] 实施例1:
[0025] 一、SEM单克隆抗体的很制备：
[0026]I、SEM重组蛋白的制备及纯化：
[0027] 1)菌株来源：采用保存的金黄色葡萄球菌（含sem基因，该基因序列已经提交到 GenBank数据库中，该基因的登录号为KT853047)。
[0028] 2)根据sem基因序列设计金黄色葡萄球菌新型肠毒素sem基因引物：
[0029]上游引物：CGTACGCATATGAAAAGAATACTTATCAITGT(NdeI);
[0030]下游引物：CGCTAGCTCGAGACTITCGTCCTTATAAG(Xho I)。
[0031] 3)质粒构建：以金黄色葡萄球菌的DNA为模板进行PCR扩增，获得sem基因完整 片段，并连接.pMD:?19-TVector(Takara公司），进行测序。
[0032] 4)表达质粒的构建：NdeI (天根公司）和XhoI (天根公司）分别酶切PCR产物 和pET_28a(+)(天根公司），Solution I(Takara公司）16°C连接60min，转入感受态细胞 DH5a (天根公司）中，37°C培养过夜，提取质粒，双酶切鉴定，获得重组质粒pET-28a-SEM。
[0033] 5)融合蛋白表达转化：取I y L重组的pET-28a_SEM质粒转入大肠杆菌 Rossetta(DE3)，42°C热击90s后冰上静置5min加入700 y L培养基，37°C培养45min，取 IOOul 涂平板（30 y g/mL Kan)，37°C培养过夜。
[0034]6)小试培养选择最佳的诱导条件
[0035] a.挑取表达菌株Rossetta (DE3) (pET_28a_SEM)的单菌落于试管中（4mL LB培养 基，30 y g/mL Kan) 37°C，220rpm 过夜培养。
[0036]b.将培养的菌液按1:100比例分别接种于4mL LB培养基中，添加至30 y g/mL Kan，37°C，220rpm 培养。
[0037] c?当OD值达到0?6左右时，分别添加终浓度为0?5mM的IPTG，220rpm，15°C过夜， 25°C过夜，37°C诱导5h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。
[0038]d.收集菌体并用PBS缓冲液悬浮。
[0039] e. SDS-PAGE电泳检测，选择最佳的蛋白表达诱导条件。
[0040]7)大量诱导
[0041] 将培养的菌液按1:100比例接种于4L的LB液体培养基中，添加终浓度30 yg/mL Kan，37°C，220rpm培养，当OD值达到0? 6左右时，添加终浓度为0? 5mM IPTG，25°C，220rpm， 16h，离心收集细胞菌体。
[0042] 8)融合蛋白纯化：将收集的细菌菌体用破碎Buffer(50mM Tris，300mM NaCl，7M 盐酸胍，0.1 % Triton X-100, PH = 8. 0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率500W，20min (超 声2s，暂停6s为一个循环）。超声完毕后，12000rpm/min，4°C，离心20min，弃沉淀，上清做 下步纯化。
[0043] 镍琼脂糖亲和层析：取5mL mL Ni-IDA，用10倍柱床体积的Binding Buffer (50mM Tris，300mMNaCl，8M尿素，pH=8. 0)清洗平衡柱子，流速5mL/min。再将样品（溶解液上 清）上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。之后用10倍柱床体积的WashBuffer(50mMTris， 300mMNaCl，8M尿素，10/20/50mM咪唑，pH= 8.0)清洗柱子，流速2mL/min。再用Elution 811打61(5011111^18,3001111 似(：1，811尿素，5001111咪唑卬11 = 8.0)洗脱，流速211117111111，收集 洗脱液。最后将含目的蛋白的洗脱组分透析到25mMTris，4M尿素，PH= 8. 0的缓冲液中， 透析过夜，过滤分装。
[0044] 最终得到的纯化的SEM重组蛋白的SDS-PAGE分析见图I;SEM免疫原的蛋白纯度 分析见图2,SEM蛋白纯度为89. 3%;SEM蛋白浓度采用图3的标曲进行计算，获得的SEM蛋 白浓度为I. 8mg/ml。
[0045] 2、动物免疫：
[0046] 1)实验动物：选5只6~8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。小鼠注射抗原前一周， 皮下注射Img卡介苗，以增强机体对抗原的免疫应答水平。
[0047] 2)抗原处理：将SEM免疫原与等量完全或不完全弗氏佐剂混合搅拌法将其乳化， 乳化完全后皮下多点注射小鼠。
[0048] 3)免疫方法：按照特定免疫流程（该免疫过程后老鼠达到了较高的效价，并且没 有耐受）免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3 天后眼眶采血后进行融合。
[0049] 4)骨髓瘤细胞（Sp2/0)的准备：融合前两周复苏Sp2/0,置于5% C02、37°C恒温培 养箱中传代培养。培养过程在培养液中加入8-氮鸟嘌呤，连续处理3次，使Sp2/0细胞对 HAT培养液更加敏感。融合前一天传代一次，使融合当天的骨髓瘤细胞处于对数生长期。
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