单克隆抗体mers-27及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体MERS-27及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 新型冠状病毒（MERS-CoV)于2012年首次在中东地区被发现感染人类，随后这种 病毒感染引起的疾病又先后出现在欧洲几个国家和地区。超过半数的感染病人均会出现严 重的呼吸道疾病，其临床症状同2003年爆发的由SARS-CoV的临床症状非常相似。由于这 种疾病可以人传染给人，引起了全世界的高度关注。到目前为止，还没有特异性的药物和疫 苗对这种疾病进行治疗和预防。
[0003]MERS-CoV利用其表面的膜蛋白（S蛋白）进入易感细胞。S蛋白由位于N端的S1 结构域和位于近膜端的S2结构域和跨膜结构域组成，其中病毒对细胞易感性是由S1结构 域决定的。通过利用MERS-CoV的S1结构域进行共纯化实验，2013年初Raj的研究小组确 定了 dip印tideyl p印tidase4(DPP4,也称为 CD26)为 MERS-CoV 的受体。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种单克隆抗体MERS-27及其编码基因和应用。
[0005] 本发明提供了一种抗体，命名为单克隆抗体MERS-27,由A链和B链组成；所述A链 为如下（a)或（b) : (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b)将序列1 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的 由序列1衍生的蛋白质；所述B链为如下（c)或（d) :(c)由序列表中序列3所示的氨基酸 序列组成的蛋白质；（d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。
[0006] 所述A链和所述B链通过二硫键形成单克隆抗体MERS-27。
[0007] 本发明还保护一种DNA组合物，由编码所述A链的DNA分子甲和编码所述B链的 DNA分子乙组成。
[0008] 所述DNA分子甲可为如下（1)或（2)或（3)的DNA分子：（1)序列表中序列2自5' 末端第889-2301位核苷酸所示的DNA分子；（2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交 且编码所述A链的DNA分子；（3)与（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述 A链的DNA分子。上述严格条件可为在6 X SSC，0. 5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 1XSSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0009] 所述DNA分子乙为如下（4)或（5)或（6)的DNA分子：（4)序列表中序列4自5' 末端第889-1587位核苷酸所示的DNA分子；（5)在严格条件下与（4)限定的DNA序列杂交 且编码所述B链的DNA分子；（6)与（4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述 B链的DNA分子。上述严格条件可为在6 X SSC，0. 5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 1XSSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0010] 本发明还保护一种表达盒组合物，由表达所述DNA分子甲的表达盒甲和表达所述 DNA分子乙的表达盒乙组成。所述表达盒甲具体可如序列表的序列2所示。所示表达盒乙 具体可如序列表的序列4所示。
[0011] 本发明还保护一种质粒组合物，由重组质粒甲和重组质粒乙组成；所述重组质粒 甲为含有所述DNA分子甲或所述表达盒甲的重组质粒；所述重组质粒乙为含有所述DNA分 子乙或所述表达盒乙的重组质粒。所述重组质粒甲具体可为含有所述表达盒甲的PMD18-T 载体。所述重组质粒乙具体可为含有所述表达盒乙的PMD18-T载体。
[0012] 本发明还保护将所述重组质粒甲和所述重组质粒乙共转染哺乳动物细胞得到的 重组细胞。所述哺乳动物细胞具体可为293T细胞。
[0013] 本发明还保护培养所述重组细胞得到的抗体（IgGl抗体)。
[0014] 本发明还保护一种药物，其活性成分为所述单克隆抗体MERS-27 ;所述药物的功 能为如下（I )、（ II )、（III)或(IV): ( I )治疗和/或预防MERS-CoV感染；（II)抑制MERS-CoV 增殖；CHI)抑制MERS-CoV入侵哺乳动物；（IV)治疗和/或预防MERS-CoV引起的疾病。所 述"抑制MERS-CoV增殖"具体可为抑制MERS-CoV在哺乳动物细胞中的增殖。所述哺乳动 物细胞具体可为Huh7细胞。
[0015] 本发明还保护所述单克隆抗体MERS-27在制备药物中的应用；所述药物的功能为 如下（I )、（ II )、（III)或（IV) : ( I )治疗和 / 或预防 MERS-CoV 感染；（II)抑制 MERS-CoV 增 殖；CHI)抑制MERS-CoV入侵哺乳动物；（IV)治疗和/或预防MERS-CoV引起的疾病。所述 "抑制MERS-CoV增殖"具体可为抑制MERS-CoV在哺乳动物细胞中的增殖。所述哺乳动物细 胞具体可为Huh7细胞。
[0016]本发明提供的单克隆抗体能够有效抑制MERS-CoV入侵易感细胞，可作为 MERS-CoV的预防药物或治疗药物，对于MERS-CoV的预防和治疗具有重要的理论指导价值 和广泛的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1为MERS-27溶液的SDS-PAGE电泳图。
[0018] 图2为实施例2的步骤一至步骤四的中和活性结果；纵坐标为中和活性（％)，横坐 标为稀释液中的蛋白浓度以e为底的对数值。
[0019] 图3为实施例2的步骤五的中和活性结果；纵坐标为中和活性（％)，横坐标为稀释 液中的蛋白浓度以e为底的对数值。
【具体实施方式】
[0020] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，
[0021] 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重 复实验，结果取平均值。
[0022] 293T细胞(人肾上皮细胞系）：ATCC，ATCC? CRL-11268?。Huh7细胞(肝癌细胞 系）:JCRB，JCR B04〇3。TZM-BL 细胞（宫颈癌细胞系）：NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (Cat. No. 8129)。pMD18_T 载体：Takara。pcDNA3. 1 (+)载体：Invitrogen 公司。骨架质粒 pNL4-3R-E_luciferase:参考文献：He J，Choe S，Walker R，Di Marzio P，Morgan DO, Landau NR. J Virol69:6705 - 6711，1995.。
[0023] 实施例1、单克隆抗体的发现
[0024] 通过序列和模型分析发现MERS-CoV可能有一个潜在的受体结合域（Receptor Binding Domain, RBD)，将RBD和可溶性DPP4蛋白共结晶，解析蛋白的结构，发现RBD中有 与DPP4结合的关键氨基酸位点。利用纯化的RBD进行动物免疫，发现其具有较强的诱导中 和抗体产生的能力。利用RBD筛选展示在酵母表面的人类非免疫scFvs文库（scFvs的英文 全称为"single-chain variable fragments"),得到了若干具有中和活性的单克隆抗体。 将其中一个单克隆抗体命名为单克隆抗体MERS-27 (属于IgGl抗体)。
[0025] 实施例2、单克隆抗体MERS-27的制备
[0026] 1、合成序列表的序列2所示的双链DNA片段甲，然后将DNA片段甲插入pMD18-T 载体，得到重组质粒甲。
[0027] 序列表的序列2中，自5'末端第1-888位核苷酸为CMV启动子，第889-2301位核 苷酸为单克隆抗体MERS-27的重链的编码基因，第2302-2429为ployA。序列表的序列2所 不的双链DNA分子编码序列表的序列1所不的蛋白质。
[0028] 2、合成序列表的序列4所示的双链DNA片段乙，然后将DNA片段乙插入pMD18-T 载体，得到重组质粒乙。
[0029] 序列表的序列4中，自5'末端第1-888位核苷酸为CMV启动子，第889-1587位核 苷酸为单克隆抗体MERS-27的轻链的编码基因，第1588-1715为ployA。序列表的序列4所 不的双链DNA分子编码序列表的序列3所不的蛋白质。
[0030] 3、将重组质粒甲和重组质粒乙共转染293T细胞(转染剂量：每IX105个细胞转染 2微克重组质粒甲和2微克重组质粒乙，采用的培养基为含10%FBS的DMEM培养基)，37°C静 置孵育8小时，然后将培养基更换为含2%FBS的DMEM培养基并37°C静置孵育72小时(实际 应用中，48-72小时均可)，然后收细胞培养上清，4°C、4000rpm离心1小时，收集上清液。
[0031] 4、取步骤 3 得到的上清液，加入 protein A beads (Pierce?Protein A Agarose; Thermo公司），4°C振荡孵育12小时，离心取上清液，即为含有单克隆抗体MERS-27的溶液 (简称MERS-27溶液)，4°C保存。
[0032] MERS-27溶液的SDS-PAGE电泳图见图1。由图1可以观察到，MERS-27溶液中并 无其它杂蛋白。分别回收两个条带并测序，一个条带的前10位氨基酸残基为序列表的序列 1的前10位，另一个条带的前10位氨基酸残基为序列表的序列3的前10位。
[0033] 实施例3、单克隆抗体MERS-27的应用
[0034] 一、检测单克隆抗体MERS-27对MERS-CoV假病毒的中和活性
[0035] 表达MERS-CoV全长膜蛋白的质粒(命名为MERS-CoV膜蛋白质粒）和骨架质粒 pNL4-3R-E-lu CiferaSe共转染293T细胞，孵育后能够得到具有感染性但没有复制能力的 MERS-CoV假型病毒，其感染性同活病毒相似。
[0036] 将序列表的序列5所示的双链DNA分子（MERS-CoV全长膜蛋白的编码基因）插入 pcDNA3. 1 (+)载体的Hindlll和Xhol酶切位点之间，得到MERS-CoV膜蛋白质粒。
[0037] 1、MERS-CoV假病毒的制备
[0038] 将MERS-CoV膜蛋白质粒和骨架质粒pNL4-3R-E_luciferase共转染293T细胞， 37°C静置孵育，转染48小时后收集细胞培养上清，即为含有MERS-CoV假病毒的病毒液(简 称MERS-CoV病毒液)。利用p24定量检测的ELISA试剂盒（HIV P24抗原定量检测试剂盒， KEY-BIO, 96T)检测MERS-CoV病毒液的病毒滴度，MERS-CoV病毒液的0D45Qnm (吸光值为1 (1021TCID50/ml)，吸光值越大说明病毒含量越高。
[0039] 2、检测单克隆抗体MERS-27对MERS-CoV假病毒的中和活性
[0040] (1)采用含10%FBS的DMEM培养基将实施例2制备得到的MERS-27溶液倍比稀释， 依次得到蛋白浓度为 50. 000000 ii g/ml、16. 666670ii g/ml、5. 555555ii g/ml、l. 851852ii g/ mUO. 6172839 u g/mUO. 2057613 u g/mU0.0 685871