GBP蛋白及其编码基因在调控植物产量中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及gbp蛋白及其编码基因在调控植物产量中的应用。

背景技术：

随着人口数目的持续增加、耕地大面积的缩水和盐渍化以及淡水资源的短缺问题的加剧，使得环境胁迫更加严峻，这样就势必影响全球的农业生产(rosegrantandcline,2003)。而高等植物本身植根于土壤之中，几乎无自主性移动能力，主要依赖根从土壤中吸收养料和水分来维持生活周期。而且根的发育直接受各种环境因子的炮轰，因此对作物根系发育的研究会直接影响其产量。并且在多细胞植物的胚后发育过程中，幼苗的地上和地下部分的末端出现两类干细胞群即茎顶端分生组织(sam)和根分生组织(rm)，这些干细胞在一定的时空条件下进行分裂，其子细胞除了自我更新外也作为各种组织和器官的细胞来源，维持了植物整个世代的生长发育(weigelandjürgens,2002；laux,2003)。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供gbp蛋白的新用途。

所述gbp蛋白是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

本发明提供了gbp蛋白在调控植物根长和/或分蘖数和/或种子数和/或产量中的应用。

本发明的另一个目的是提供与gbp蛋白相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与gbp蛋白相关的生物材料在调控植物根长和/或分蘖数和/或种子数和/或产量中的应用；

所述与gbp蛋白相关的生物材料为下述a1)至a12)中的任一种：

a1)编码gbp蛋白的核酸分子；

a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；

a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；

a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；

a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；

a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；

a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；

a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；

a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，a1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cdna分子或dna分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码gbp蛋白的cdna分子或基因组dna分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码gbp蛋白的cdna分子或基因组dna分子。

上述应用中，所述调控为提高或降低。

本发明还有一个目的是提供gbp蛋白或与gbp蛋白相关的生物材料的新用途。

本发明提供了gbp蛋白或与gbp蛋白相关的生物材料在培育根长变长和/或分蘖数增加和/或种子数增加和/或产量提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了gbp蛋白或与gbp蛋白相关的生物材料在培育根长变短和/或分蘖数减少和/或种子数减少和/或产量降低的植物中的应用。

本发明还提供了gbp蛋白或与gbp蛋白相关的生物材料在植物育种中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种培育根长变长和/或分蘖数增加和/或种子数增加和/或产量提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育根长变长和/或分蘖数增加和/或种子数增加和/或产量提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中gbp蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的根长和/或分蘖数和/或种子数和/或产量高于受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中gbp蛋白的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达gbp蛋白；所述过表达的方法为将gbp蛋白的编码基因导入受体植物。

上述方法中，所述gbp蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的dna分子。

在本发明的具体实施例中，所述gbp蛋白的编码基因是通过重组载体pmdc32-35s::gbp导入受体植物。所述重组载体pmdc32-35s::gbp为将序列1所示的gbp基因重组到pmdc32载体的attr1(aaacaagtttgtacaaaaaa)和attr2(tttcttgtacaaagtgg)之间，且保持pmdc32载体的其他序列不变后得到的载体。重组载体pmdc32-35s::gbp表达gbp蛋白。

本发明的最后一个目的是提供一种培育根长变短和/或分蘖数减少和/或种子数减少和/或产量降低的植物的方法。

本发明提供的培育根长变短和/或分蘖数减少和/或种子数减少和/或产量降低的植物的方法包括降低植物中gbp蛋白的含量和/或活性，从而减小植物的根长和/或分蘖数和/或种子数和/或产量。

上述方法中，所述根长为主根长，所述分蘖数为单株分蘖数，所述种子数为单株种子数。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体可为禾本科植物；所述禾本科植物具体可为水稻；所述水稻具体可为gbp突变体或野生型水稻日本晴。

本发明首先从野生型水稻日本晴中上克隆到gbp基因，然后获得了gbp基因突变的水稻gbp突变体，并且发现和野生型日本晴nip相比，gbp突变体根系萎缩，单株分蘖数、种子数和产量均有所降低，最后构建了超表达载体pmdc32-35s::gbp，并将超表达载体pmdc32-35s::gbp转入野生型水稻日本晴中，得到t3代转gbp水稻纯合株系。通过实验证明：和野生型nip相比，t3代转gbp水稻纯合株系oe8、oe10和oe13根系更加发达，单株分蘖数、种子数和产量均高于野生型nip。证明gbp在水稻根系生长以及产量生产方面发挥正向调节作用。

附图说明

图1为水稻gbp基因表达量下降后根系萎缩，表达量上调后根系发达。

图2为水稻gbp基因表达量下降后分蘖数降低，表达量上调后分蘖数增加。

图3为统计了水稻gbp基因表达量下降后单株种子数降低，表达量上调后单株种子数增加。

图4为统计了水稻gbp基因表达量下降后单株分蘖数降低，表达量上调后单株分蘖数增加。

图5为野生型日本晴nip和gbp突变体中gbp基因表达量检测。

图6为水稻gbp基因表达量下降后根长变短，表达量上调后根长变长。

图7为水稻gbp基因表达量下降后主根长变短，表达量上调后主根长变长。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、水稻gbp基因的克隆

1、rna的提取

提取野生型水稻日本晴叶片的rna。

2、cdna的获得

以步骤1获得的rna为模板，反转录得到cdna。

3、pcr扩增

以步骤2获得的cdna为模板，采用引物5′-caccatggcgacgatgtctcgccgc-3′和5′-aacgttgaaccggaaaagcatg-3′进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

4、测序

将pcr扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并送交测序。测序结果表明：pcr扩增得到大小为1296bp的扩增产物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，并将序列1所示的基因命名为gbp基因，gbp基因编码序列表中序列2所示的蛋白质，将序列2所示的氨基酸序列命名为gbp蛋白。

实施例2、gbp突变体的获得及其性状检测

一、gbp突变体的获得

1、gbp突变体的获得

将突变体种子(购买于韩国水稻基因沉默突变体公司，种子编号为pfg2b_30061)在30度培养箱中暗培养4天，移到营养液中培养10天，然后再移植到大田中，待一个月后取材提取dna，鉴定纯合体，得到突变体植株，将其命名为gbp突变体。

对gbp突变体进行测序。测序结果表明：gbp突变体和野生型水稻日本晴的基因组序列相比，gbp突变体仅是在序列1所示的gbp基因第275-439位插入一段t-dna序列，其余序列与野生型日本晴全部相同。

2、gbp基因表达量检测

提取野生型日本晴nip和gbp突变体的根的rna，然后反转录形成cdna。以获得的cdna为模板，采用引物gbp-f1：5′-gcgcactcggctctgcgttc-3′和gbp-f2：5′-acatcgcacaacctgaaggatggaa-3′进行pcr半定量，并以ostubulin-rt-f:tcttccaccctgagcagctc和ostubulin-rt-r:aaccttggagaccagtgcag作为内参引物。

结果如图5所示。从图中可以看出，内参基因tubulin在野生型日本晴nip和gbp突变体中均能正常转录表达，而用引物gbp-f1和gbp-f2均只能在野生型日本晴nip中有扩增条带，gbp突变体中无扩增产物，说明由于t-dna插入导致gbp突变体中的gbp基因不能正常转录表达。

3、gbp纯合突变体的获得

采用如下引物：gbp-f1：5′-gcgcactcggctctgcgttc-3′、gbp-f2：5′-acatcgcacaacctgaaggatggaa-3′和gbp-f3：5′-aacgctgatcaattccacag-3′对gbp突变体进行pcr鉴定，得到gbp纯合突变体。

若引物gbp-f1和gbp-f2未扩增出大小为1425bp的条带，且引物gbp-f2和gbp-f3扩增出大小为498bp的条带的gbp突变体为gbp纯合突变体。

二、gbp突变体的性状检测

分别将步骤一中获得的gbp纯合突变体植株(gbp)和野生型水稻日本晴(nip)种子在30℃黑暗培养箱中萌发四天，然后移植到营养液中，生长两周，再将苗种植于水稻大田，六个月的正常生长，得到gbp纯合突变体植株(gbp)和野生型水稻日本晴(nip)。实验重复3次，结果取平均值。比较gbp纯合突变体植株(gbp)和野生型水稻日本晴(nip)的根系生长情况，并统计单株分蘖数和种子数。

结果如图1、图2、图3、图4、图6和图7所示。从图中可以看出：在正常条件下，和野生型日本晴nip相比，gbp突变体根系萎缩，主根长变短，单株分蘖数和种子数均低于野生型日本晴nip，在产量上有很大程度的降低。表明gbp在水稻根系生长以及产量生产方面发挥正向调节作用。

实施例3、转gbp水稻的获得及其性状检测

一、转gbp水稻的获得

1、重组载体pmdc32-35s::gbp的构建

利用gateway方法将实施例1中克隆得到的序列1所示的gbp基因连入pentr^tm/sd/d-topo载体(invitrogen，货号为1711243)，得到重组载体pentr^tm/sd/d-topo-gbp，并对其进行测序验证。经过测序表明：克隆的gbp基因没有任何点突。

将重组载体pentr^tm/sd/d-topo-gbp、pmdc32载体(biovectorntcc)和重组酶(invitrogen)混匀，于22℃，过夜反应，使序列1所示的gbp基因重组到pmdc32载体的attr1(aaacaagtttgtacaaaaaa)和attr2(tttcttgtacaaagtgg)之间，得到重组载体pmdc32-35s::gbp。重组载体pmdc32-35s::gbp表达gbp蛋白。

2、重组菌的获得

将重组载体pmdc32-35s::gbp转入农杆菌eha105(biovectorntcc)中，得到重组菌pmdc32-35s::gbp/eha105。

3、转gbp水稻的获得

(1)用75％乙醇和2.5％次氯酸钠消毒野生型nip水稻种子，然后均匀的铺在诱导培养基上28℃避光培养28天，诱导愈伤组织。

(2)将诱导28天的愈伤组织来回猛摇几次，从脱离的愈伤组织中挑选光滑、黄色并且较硬的大小在2-3mm的胚性愈伤，之后放在ms培养基上，28℃避光培养7天。

(3)刮取已活化3天的步骤2中获得的重组菌pmdc32-35s::gbp/eha105，放入nbco液体培养基中，打散混匀，调od600至0.125。再将胚性愈伤放入上述nbco培养基中，静止15-20分钟，倒去菌液吸干均匀的铺在已加滤纸的nbco共培养基中。于22℃避光培养3天。

(4)共培养愈伤用灭菌水洗三次，后用植物羧苄为500mg/l的灭菌水浸泡15分钟，吸干放入选择培养基中。

(5)挑取新长出的愈伤放入预分化培养基中，暗培养一周

(6)将(5)中暗培养的愈伤放入分化培养基，光照培养直到产生叶绿素；

(7)将产生叶绿素的阳性愈伤转移到生根壮苗培养基中，28℃光照培养，直到长成阳性幼苗；

(8)将阳性幼苗移植到大田，收到的种子即为t1代；

(9)将t1代的种子用潮霉素筛选，将有抗性的小苗移植到水稻田，然后单株收种子即为t2代；

(10)将单株收到的t2代的种子分别用潮霉素筛选，查看种子萌发比例，全部萌发的即为转基因纯和株系。然后将全部萌发的t2代的苗转移到大田，收种子即为t3代转gbp水稻纯合株系。

4、pcr鉴定

用引物gbp-f1：5′-gcgcactcggctctgcgttc-3′和gbp-f2：5′-acatcgcacaacctgaaggatggaa-3′对t3代转gbp水稻纯合株系进行pcr半定量鉴定。结果如图5所示。t3代转gbp水稻纯合株系oe8、oe10和oe13中均高表达gbp基因。

二、转gbp水稻的性状检测

分别将步骤一中获得的阳性t3代转gbp水稻纯合株系oe8、oe10和oe13及野生型水稻日本晴(nip)种子在30℃黑暗培养箱中萌发四天，然后移植到营养液中，生长两周，再将苗种植于水稻田，六个月的正常生长，每个不同品种的水稻取10株进行统计，实验重复3次，结果取平均值。比较t3代转gbp水稻纯合株系和野生型水稻日本晴(nip)的根系生长情况，并统计单株分蘖数和种子数。

结果如图1、图2、图3、图4、图6和图7所示。从图中可以看出：在正常条件下，和野生型日本晴nip相比，t3代转gbp水稻纯合株系oe8、oe10和oe13根系更加发达，主根长变长，单株分蘖数和种子数均高于野生型日本晴nip，在产量上有很大程度的提高。上述结果表明，gbp在水稻根系生长以及产量生产方面发挥正向调节作用。

序列表

<110>河北师范大学

<120>gbp蛋白及其编码基因在调控植物产量中的应用

<160>2

<210>1

<211>1296bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggcgacgatgtctcgccgcgcactcggctctgcgttcgcgggattcacgcggacacca60

gctatgactccgacggccaccttgccttcctcgtgcgcgtccccggcgcgtctcctgcgg120

tggcgccggagcgcgggtgtaggcgcccggcggttcgcgtccggccgcaacgcgcggatt180

agcatgagcctccgcgccggcatcgtcggcctgcccaacgtcggcaagtccacactcttc240

aatgccattgttgaaaatgggaaggcacaagctgcaaactttcccttctgcaccataaac300

cccaacgttggtgttgtggctatcccagatgctcgcttgcatgtgctctcaaaattaagc360

aagtctaaggagacaatcccaacatccatagagcttgtggatattgcaggtctcgtcaaa420

ggagcaagcaaaggagagggactaggaaaccaatttctttcgaacatccgtgaggttgat480

tccatccttcaggttgtgcgatgttttgaagatgatgatattgttcatgtgagtgggaaa540

gttgatcccaaatcagatattgatgtaattaatctggagcttatattttctgatcttgac600

cagatagagaaaagactggataagcttaaaaagagcaaaactaaagaccagcaagtaaag660

gtcaaggaacaagcagagaggactggattggaaaaaattcagactgtacttatggatgga720

aaacctgctagatctgttgatttggctgaccatgagaaagaagctatccaacatctttgt780

ctactaactatgaaacctgtcatttatgttgccaacgtaactgaatctgatcttgctgaa840

cctggtaacaaccctcatgtcaaagaggtagccaaactagcaacagacttggaatctggc900

atggttacaatatcagctcaggttgaggctgaacttgctgaactgccattagaagagaga960

gtcgaatatctaaaatcccttggtgttactgaaagtggactaggaaatttggtaaaggca1020

acatatgaccttctgggattgaggacttatttcacaactggagataaggaaacaaaagct1080

tggactattcttgcaggcatgactgcacctcaagcagcaggagttattcacagtgacttt1140

cagaaaggcttcattagagctgaaactgtatcatatgatgattttgtcgcggcgggttct1200

cttggagttgcaagggagaagggattgttgaggttggaagggaaggattacatcgtgcag1260

gaaggcgatgtcatgcttttccggttcaacgtttga1296

<210>2

<211>431

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

metalathrmetserargargalaleuglyseralaphealaglyphe

151015

thrargthrproalametthrprothralathrleuprosersercys

202530

alaserproalaargleuleuargtrpargargseralaglyvalgly

354045

alaargargphealaserglyargasnalaargilesermetserleu

505560

argalaglyilevalglyleuproasnvalglylysserthrleuphe

65707580

asnalailevalgluasnglylysalaglnalaalaasnpheprophe

859095

cysthrileasnproasnvalglyvalvalalaileproaspalaarg

100105110

leuhisvalleuserlysleuserlysserlysgluthrileprothr

115120125

serilegluleuvalaspilealaglyleuvallysglyalaserlys

130135140

glygluglyleuglyasnglnpheleuserasnilearggluvalasp

145150155160

serileleuglnvalvalargcysphegluaspaspaspilevalhis

165170175

valserglylysvalaspprolysseraspileaspvalileasnleu

180185190

gluleuilepheseraspleuaspglnileglulysargleuasplys

195200205

leulyslysserlysthrlysaspglnglnvallysvallysglugln

210215220

alagluargthrglyleuglulysileglnthrvalleumetaspgly

225230235240

lysproalaargservalaspleualaasphisglulysglualaile

245250255

glnhisleucysleuleuthrmetlysprovaliletyrvalalaasn

260265270

valthrgluseraspleualagluproglyasnasnprohisvallys

275280285

gluvalalalysleualathraspleugluserglymetvalthrile

290295300

seralaglnvalglualagluleualagluleuproleuglugluarg

305310315320

valglutyrleulysserleuglyvalthrgluserglyleuglyasn

325330335

leuvallysalathrtyraspleuleuglyleuargthrtyrphethr

340345350

thrglyasplysgluthrlysalatrpthrileleualaglymetthr

355360365

alaproglnalaalaglyvalilehisserasppheglnlysglyphe

370375380

ileargalagluthrvalsertyraspaspphevalalaalaglyser

385390395400

leuglyvalalaargglulysglyleuleuargleugluglylysasp

405410415

tyrilevalglngluglyaspvalmetleupheargpheasnval

420425430