专利名称：具有改变的氧化还原机制和提高的产量的转基因植物的制作方法
技术领域：
此申请要求2009年3月23日提交的美国临时专利申请系列号61/162，427的优先权权益，在此将其全部内容引入作为参考。
背景技术：
人口增加和气候变化使得全球食物、饲料和燃料短缺的可能性成为近年来的尖锐聚焦点。农业消耗70%人类所用的水，同时在世界许多地方降雨量下降。此外，随着从农田改为市区和城郊而对土地使用的改变，较少公顷的耕地可用于种植农作物。农业生物技术尝试通过可以增加作物产量的植物遗传改变来满足人类增长的需求，例如，通过赋予更好的对非生物胁迫的耐受性或通过提高生物量。在此将作物产量定义为每英亩收获的相关农业产品(如籽粒、粮草或种子)的蒲式耳量。作物产量受到非生物胁迫的影响，如干旱、热、盐度和冷胁迫，并且受到植物大小 (生物量)的影响。传统植物育种策略相对缓慢，并且通常在赋予提高的非生物胁迫耐受性中是不成功的。玉米中通过常规育种的谷粒产量提高最近达到了一个平台期。玉米的收获指数，即，收获时产量生物量与总累积生物量的比例，在过去几百年的为谷粒产量的选择性育种过程中，基本保持不变。因此，最近在玉米中发生的产量提高是每单位耕地面积提高的总生物量产生的结果。通过提高种植密度获得了这种提高的总生物量，这导致了适应性的表型变化，如叶角的减小，这可以降低下部叶的遮挡，和雄花穗的大小，这可以提高收获指数。当土壤水分耗尽时或者如果在干旱期间不能获得水，作物产量受到限制。如果叶的蒸腾作用超过来自根部的水分供应，将产生植物水分缺乏。可用的水供给涉及土壤中保持的水量和植物用其根系获得水的能力。水从叶的蒸腾作用与通过气孔的光合作用的二氧化碳固定相关。这两个过程正相关，使得通过光合作用的高二氧化碳流入与通过蒸腾作用的水分丢失密切相关。随着水从叶蒸腾出来，叶水的势能降低，气孔在水力过程中趋于闭合，限制光合作用的量。由于作物产量取决于光合作用中的二氧化碳固定，因此水吸收和蒸腾作用是作物产量的起作用的因素。能够使用较少的水来固定相同含量的二氧化碳或在较低水势能下能够正常作用的植物具有进行更多光合作用的潜能，并因此在许多农业系统中具有产生更多生物量和经济产量的潜能。农业生物技术已经在模式植物系统、作物的温室研究和田间试验中使用了试验， 以尽力研发呈现出提高产量的转基因植物，通过非生物胁迫耐受性提高或通过提高的生物量。例如，水利用率(WUE)是常常与干旱耐受性相关的参数。还利用了植物对干燥、渗透压休克和温度极值的应答的研究来确定植物对非生物胁迫的耐受性或抗性。低水可用性下的生物量的增加可能是由于相对提高的生长效率或降低的水消耗引起的。在选择用于提高作物的性状时，水使用降低，而生长没有变化将在水输入成本高的灌溉农业系统中具有特别的价值。不需要相应的水使用上涨的生长提高对于所有农业系统具有适用性。在许多水供给不受限制的农业系统中，生长提高，即使以水使用增加为代价也提高了产量。
农业生物技术还利用表示转基因对作物产量潜在影响的其他参数的测量。对于饲料作物，如苜蓿、青贮玉米和干草，植物生物量与总产量相关。然而，对于谷类作物，已经使用其他参数来估算产量，如植物大小，如通过总植物干重、地上部分干重、地上部分鲜重、 叶面积、茎干材积、植物高度、莲座(rosette)直径、叶长、根长、根量、分蘖数和叶数所测量的。早期发育阶段的植物大小通常与发育后期的植物大小相关。具有较大叶面积的较大植物通常比较小的植物可以吸收更多的光和二氧化碳，因此将很可能在相同的时间段内获得较高的重量。对于植物大小和生长速率，存在强遗传成分，因此对于许多不同的基因型，一个环境条件下的植物大小很可能与另一个环境条件下的大小相关。这样，使用标准环境来模拟农田中的作物在不同的位置和时间遇到的不同的和动态的环境。收获指数在许多环境条件下是相对稳定的，并且因此植物大小和谷物产量之间的牢固相关性是可能的。植物大小和谷物产量内在地相关，因为大部分谷物生物量取决于植物的叶和茎当前或存储的光合作用生产力。如同非生物胁迫耐受性一样，在生长室或温室中的标准化条件下，测量早期发育的植物的大小，是测量由转基因的存在赋予的潜在产量优势的标准实践方法。植物不能移动寻找能量来源或避免捕食或胁迫。因此，植物已进化出多种生物化学途径和网络响应其环境以在不同环境条件下维持对发育中的植物的能量供给。在这些不良条件，例如干旱、极端温度和暴露于重金属下对植物的一大挑战是有些代谢产物是具有高度毒性的。在氧化胁迫的情况下，这些毒素包括超氧化物、过氧化物、羟基自由基的高度活性氧类别(R0Q，及其有机衍生物。ROS对有机分子例如非饱和脂类，核酸和蛋白质具有高度反应性。ROS从这些有机分子中提取氢，导致还原型氧(水或还原型有机产物)和第二种有机ROS的形成，这使链反应持续从而导致对细胞成分持续的破坏直到ROS被清除。ROS 的清除涉及不属于ROS类别的无活性终产物的形成。已知多种氢供体作为ROS清除剂在植物细胞中发挥功能，包括生育酚、抗坏血酸盐、谷胱甘肽和硫氧还蛋白。这些不同的ROS清除剂都有2个共同的特征；它们的氧化形式对其他有机化合物无反应性，和所述氧化形式可被细胞中的代谢反应还原以在循环反应中重生清除剂的还原形式，通过从NAD (P) H处直接或间接获得还原当量。在不良环境条件下，当作为代谢副产物形成的ROS的产生超过植物清除系统将 ROS净化为稳定的终产物的能力时出现氧化胁迫。为了应对氧化胁迫，植物细胞必须含有足够量的能够失活ROS的清除剂或酶。另外，细胞也需要足够的NAD(P)H形式的还原当量的供给，以重生活化形式的清除剂。如果这二者之一不足，则ROS的滴度增加，细胞遭受脂类、 核酸或蛋白质的氧化损伤。在严重的情况下，损伤将导致细胞死亡，坏死和失去生产力。在几乎所有的植物细胞区室中都检测到谷胱甘肽，例如细胞质、叶绿体、内质网、 液泡和线粒体。谷胱甘肽是植物细胞中非蛋白质硫醇的主要来源；正是硫醇基的化学反应性使谷胱甘肽参与多种生物化学功能。谷胱甘肽是水溶性且稳定的，除了使ROS脱毒外，其也保护对抗其他胁迫例如重金属、有机化学品和病原体。可溶性酶，“经典”谷胱甘肽过氧化物酶将还原型单体谷胱甘肽和H2O2转化为其氧化形式，二硫化谷胱甘肽(GSSG)和吐0。细胞的细胞氧化还原平衡指示了 GSH/GSSG比率，有研究表明其涉及ROS感知和信号传导。谷胱甘肽过氧化物酶的第二种形式磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)可能为膜相关的。PHGPx与不同的功能相关，例如信号传导和细胞分化，并可能与硫氧还蛋白途径有关。PHGI^x也还原酯化在膜上的脂质氢过氧化物。因此，PHGI^x与膜脂质过氧化的修复相关。谷胱甘肽也参与谷胱甘肽化(glutathionylation)，谷胱甘肽化通过保护特定半胱氨酸残基免于不可逆的氧化来修饰蛋白质，由此调节某些蛋白质的活性。通过谷胱甘肽化使异柠檬酸裂合酶去活化。异柠檬酸裂合酶催化从异柠檬酸至琥珀酸和乙醛酸的形成， 这是乙醛酸循环的一部分，其中将2分子的乙酰辅酶A转化为1个琥珀酸分子。谷胱甘肽也可通过Y Y-谷氨酰转肽酶的作用被降解，Y-谷氨酰转肽酶催化谷胱甘肽的Y-谷氨酰部分至受体的转移，所述接受体可为氨基酸、肽或水。基于和动物GGT 的同源性，在拟南芥中已发现了 4个基因GGT1，GGT2，GGT3和GGT4。GGTl负责80-99%的活性，除了在种子中以外，在种子中GGT2负责50%的活性。GGT2和GGT4的敲除没有显示明显的表型，但GGTl敲除在开花后不久出现过早的莲座衰老。GGT3的敲除显示降低的长角果数和降低的种子产量。当原子在其氧化态中通过电子转移反应经历变化时发生氧化-还原(氧化还原) 反应。氧化描述了通过失去氢或得到氧获得氧化态的。还原描述了通过得到氢或失去氧失去氧化态。在生物学上，许多重要的能量储存或释放途径都涉及氧化还原反应。细胞呼吸作用将葡萄糖氧化为CO2，并将O2还原为水。在光合作用中，在光系统II中CO2被还原为糖， H2O被氧化为02。在光系统I中，电子梯度将辅因子NAD+还原为NADH。质子梯度产生，驱动ATP的合成，如在呼吸链中所发生的，其泵出H+ ；H+转运ATP合酶与H+摄取偶联以合成 ATP。在非光合作用生物例如大肠杆菌中，氧化还原作用可交换电子并利用氢作为能量来源从而允许厌氧生长，这需要氢化酶的作用。细胞的氧化还原态主要反映为NAD+/NADH或NADP+/NADPH的比率。此平衡反映在代谢物例如丙酮酸和乳酸的量中。植物生长需要碳、ATP、NADH和NADPH的供给。这些需要通过糖酵解和磷酸戊糖途径得到满足，上述途径提供了重生NADPH的氧化途径、以及从代谢中的遇到的己糖产生核糖和其他戊糖的非氧化途径。转醛酶是在非氧化磷酸戊糖途径中的酶，其催化三碳酮醇单元从景天庚酮糖-7-磷酸至甘油醛-3-磷酸以形成赤藓糖-4-磷酸和果糖-6-磷酸的可逆转移。转醛酶和转酮酶一起提供了糖酵解和磷酸戊糖途径之间的连接。半乳糖代谢构成了细胞代谢中的一部分，其为果糖和甘露糖代谢、核苷酸糖代谢和糖酵解提供葡萄糖。半乳糖至葡萄糖-1-磷酸的转化需要3种酶通过Leloir途径的作用半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶和UDP-半乳糖4-差向异构酶。途径的第一步中，半乳糖激酶使用ATP特异性磷酸化半乳糖以形成半乳糖-1-磷酸。尽管在植物中已表征了一些涉及胁迫应答，水利用和/或生物量的基因，但迄今为止，培育具有提高产量的转基因作物的成就仍有限，并且这样的植物没有商业化。因此需要鉴定具有提高作物产量的能力的其他基因。发明概述本发明的发明人已发现改变植物中与ROS清除系统相关的基因表达可提高植物产量。当如本文描述的靶向时，表1中所列的多核苷酸和多肽能够提高转基因植物的产量。表权利要求
1.用表达盒转化的转基因植物，所述表达盒包含有效相连的a)分离的编码启动子的多核苷酸，所述启动子能够提高叶中的基因表达；b)分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；和c)分离的编码包含SEQID NO 18的第22至550位氨基酸的全长异柠檬酸裂合酶多肽的多核苷酸，其中转基因植物与相同品种的不含有表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量。
2.对转基因是纯种的种子，所述转基因包含有效相连的a)分离的编码启动子的多核苷酸，所述启动子能够提高叶中的基因表达；b)分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；和c)分离的编码包含SEQID NO 18的第22至550位氨基酸的全长异柠檬酸裂合酶多肽的多核苷酸，其中由所述种子生长得到的转基因植物与相同品种的不含有所述转基因的野生型植物相比显示了提高的产量。
3.提高植物产量的方法，所述方法包括以下步骤a)用表达盒转化植物细胞，所述表达盒包含有效相连的i)分离的编码启动子的多核苷酸，所述启动子能够提高叶中的基因表达； )分离的编码线粒体转运肽的多核苷酸；和iii)分离的编码包含SEQ ID NO 18的第22至550位氨基酸的全长异柠檬酸裂合酶多肽的多核苷酸；b)从转化的植物细胞再生转基因植物；和c)选择与相同品种的不含有所述表达盒的野生型植物相比显示了提高的产量的转基因植物。
全文摘要
本发明公开了多核苷酸，其能够提高经转化以包含这些多核苷酸的植物的产量。本发明还提供了使用这些多核苷酸的方法，以及包含这样的多核苷酸作为转基因的转基因植物和农产品，包括种子。
文档编号C12N15/82GK102361988SQ201080013251
公开日2012年2月22日 申请日期2010年3月17日 优先权日2009年3月23日
发明者B·麦克尔西 申请人:巴斯夫植物科学有限公司