一种可高效快速穿透血脑屏障的纳米药物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种能穿透血脑屏障进而将装载的药物高效输运至中枢神经系统并随后立即快速释放的纳米药物。该纳米药物中枢靶向性好、载药量高、释药快，可用于治疗需紧急给药的脑部急性疾病及肿瘤，尤其适用于神经性毒剂中毒后中枢神经系统的救治。
【背景技术】
[0002]I血脑屏障的穿透
[0003]脑部为维持中枢的动态稳定，除了一些氨基酸、己糖类、神经肽类等通过特殊的载体转运穿过血脑屏障之外，超过98%的药物分子不能穿过血脑屏障抵达中枢。
[0004]针对该难题，既往的研究多集中在新型药物分子的设计和结构改构上面，例如增加分子的亲脂性基团、减少分子的正电荷基团、减少分子量等，但由于药物分子内分子电荷、亲疏水性、分子空间位阻等一系列固有因素的限制，以及分子结构的细微改变将极大的影响药物的理化性质和药效，通过分子自身改构的研究方案仍不能有效的实现药物中枢给药，例如救治神经性毒剂中毒的药物重活化剂，虽然对分子结构进行改造，设计合成了了大量的新型重活化剂，但依然未能实现对中枢中毒酶的有效重活化。
[0005]2药物在中枢的释放
[0006]现有的以中枢神经系统为靶向目标的纳米药物中，多数以治疗脑部肿瘤等为治疗目标，缓释型纳米结构即可满足使用要求，即装载药物的内核外包裹了一层高分子层等修饰层，内核药物需要伴随着外层高分子层的舒展才能与外界环境接触，从而开始缓慢释放药物。
[0007]但是以神经性毒剂中毒的解毒为代表的脑部急性疾病的治疗则与此不同，其需要迅速起效。因为神经性毒剂中毒后，可迅速与血液及组织中的乙酰胆碱酯酶结合，进而导致乙酰胆碱酯酶丧失对乙酰胆碱的催化水解作用，引发体内乙酰胆碱大量蓄积，由于乙酰胆碱是体内重要的神经递质，最终会产生以胆碱能系统功能亢进为代表的中毒症状表现。中毒者命悬一线，药物起效快能避免造成多重后遗症。但是现有的报道中尚没有提供能穿透血脑屏障后迅速释药的纳米药物。
[0008]3中枢中毒救治
[0009]对于神经性毒剂中毒救治，最重要的措施之一是重活化，即采用药物干预的方法，使与神经性毒剂结合的乙酰胆碱酯酶重新恢复水解乙酰胆碱的功能。而能够使中毒酶重新恢复水解乙酰胆碱酯酶的药物，称之为重活化剂。
[0010]以梭曼为例进行说明，梭曼(Soman，化学名:甲氟膦酸特己酯)是神经性毒剂一种，也是最为难防难治的神经性毒剂。目前临床普遍应用的酶重活化剂如氯解磷定、双复磷等，对梭曼中毒酶无良好重活化作用；而以H1-6为代表的双季胺单肟类重活化剂，尽管对梭曼外周中毒酶有良好重活化作用，但由于其本身分子结构所具有的强亲水性、分子带正电荷等理化性质显著特点，使其难以穿透血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)而进入中枢，因而无法实现对梭曼中枢中毒酶的重活化作用。其结果导致梭曼中毒后，伤员很快出现惊厥、昏迷为代表的严重中枢中毒症状表现，进而出现难以抑制的迟发性脑损伤。
[0011]德国的Franz Worek研究组在该领域进行了相应的研究工作,他们将人血清白蛋白制备成为纳米颗粒后，利用静电吸附作用在颗粒表面挂载H1-6药物后，模拟体外血脑屏障模型，进行生物学药效评价。从药效评价上看，药物穿透血脑屏障的能力有一定的提升，但是效率低、结构不稳定，依然不能满足神经性毒剂(例如梭曼)中毒救治的需求(MiriamDadparvara, Franz Worek 等，HI_6human serum albumin nanoparticles-Developmentand transport over an in vitro blood - brain barrier model, ToxicologyLetters206 (2011) 60 - 66)。
[0012]综上可知，目前基于分子改构的方法和现有的纳米药物，均未能有效的实现中枢梭曼中毒酶的重活化，目前亟需开发出可以对梭曼中枢中毒酶有重活化作用的有效药物。
【发明内容】
[0013]为了解决这个问题，我们进行了大量的研究工作，最终开发出了本发明的包被有特定蛋白质的载药纳米硅球，有效地实现了药物的血脑屏障穿透和中枢迅速释放，最终提供了新型的纳米药物用于中枢解毒。
[0014]首先，本发明在纳米材料的选择上发现无机纳米药物载体纳米多孔硅球可以有效的满足中枢靶向给药的各项要求。首先纳米多孔硅球载体其多孔结构，在保证能大量吸附药物分子的同时，也保持了与外界直接的药物释放通道，而不需要经历外层修饰层的舒展，就能快速地释放所装载的药物分子。
[0015]另外由于硅材料生物安全性高，满足使用要求，经已有文献证实，在小鼠模型上其耐受剂量高达2mg/只，且未引起小鼠炎症、过敏、脱水、脱毛等症状，经组织切片观察，硅球进入体内后未引起体内器官炎症等，并且多孔硅球在4天后94%将排出体外，进入脑部的硅球在96小时后排出体外。
[0016]为测试该纳米药物能否有效的将药物输运至中枢神经系统并迅速释放，本发明选用该纳米药物装载重活化剂H1-6重活化梭曼中枢中毒酶的实验来验证该纳米药物的中枢靶向有效性。
[0017]本发明以多孔纳米硅球为载体装载重活化剂H1-6，利用该载体将原本不能进入中枢的H1-6快速输运至脑部后迅速释放，立即重活化梭曼中枢中毒酶，达到中枢解毒的救治目的。
[0018]为证明本发明的先进性，我们重复了德国的Franz Worek研究组的研究工作，按照该课题组发表的工作所提供的数据合成制备了装载了 H1-6的人血清白蛋白纳米颗粒(HSANP),该课题组报道中仅对该纳米药物进行了初步的体外药效评价，本发明在此基础上进一步进行在体药效学评价，与本发明所涉及药物纳米重活化剂进行对比，证明本发明药物效率远超已报道工作。
[0019]本发明的目的是提供一种新型中枢靶向能迅速释药的纳米药物的结构和制备方法以及相应的药效评价。
[0020]本发明所提供的新型纳米药物如下:其以内部多孔的纳米多孔硅球作为载体，在载体孔内吸附或者装载有目标药物，在载体的表面修饰有蛋白层。
[0021]其中，前述的新型纳米药物上的目标药物可以是重活化剂，优选为双季胺单肟类重活化剂，进一步优选酰胺磷定(H1-6 )、氯解磷定及双复磷中的至少一种，更进一步优选为H1-6。
[0022]其中，前述的新型纳米药物上修饰的蛋白层是通过化学反应键合上的一层蛋白层，蛋白层采用的蛋白优选对血脑屏障穿透效率高的内源性蛋白，其可以辅助实现药物高效进入中枢神经系统。优选白蛋白和转铁蛋白，进一步优选转铁蛋白。
[0023]本发明所提供的纳米药物的制备方法为:(I)利用stober法制备纳米硅球；(2)酸性环境下回流得到多孔结构的纳米硅球；(3)在氮气保护下，在硅球表面键合上硅烷偶联剂；(4)在硅球表面键合上蛋白；(5)完成目标药物载药。
[0024]所述的硅烷偶联剂包括并不限于化合物一端为正硅酸酯基团一端通过烷基链连接上能与氨基反应的活性基团，如APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)，(3-三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐，(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷等，优选(3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷，其活性基团环氧乙基能在室温环境及不加任何催化剂条件下与蛋白上氨基结合，不产生副反应产物。
[0025]其中，步骤(I)中所述stober法具体操作是将氢氧化钠(2mmol/L)和十二烷基溴化铵(CTAB)按照摩尔比(1:3.92 X 15)溶解于水(V水:V NaQH溶液=137:1)后，80°C加热半小时，加入正硅酸乙酯(TE0S，V水:V teos=120:1)和乙酸乙酯(V水:V&配酷=120:1)，回流1min后，关闭加热和搅拌，老化2h，乙醇离心3次，旋干除去溶剂收集产物；
[0026]其中，步骤(2)中所述酸性条件下回流具体操作是将步骤(I)所制样品分散于甲醇(m桂球:m甲醇=1: 1000 )中，加入浓盐酸(V浓盐酸:V甲醇=1:2 )，回流24h后，乙醇离心样品3次，旋干除去溶剂收集产物。
[0027]其中，在步骤(3)中，硅烷偶联剂GMAS ((3_环氧乙基甲氧基丙基))三甲氧基硅烷通过硅烷的水解作用，在多孔硅纳米颗粒外层生成一层超薄硅层，其所含活性基团环氧乙基与转铁蛋白中的氨基发生键合反应，从而在多孔硅球外层修饰上了一层蛋白层。
[0028]其中，步骤(