酶中(图13)，因为装载不能穿透血脑屏障，致使其中枢乙酰胆碱酯酶仅能达到3%,而纳米药物由于人血清白蛋白纳米颗粒的转运作用，能部分携带药物进入中枢实现中枢中毒酶的重活化，重活化率达到了 10%，但其值远低于本发明装载H1-6的修饰转铁蛋白的纳米多孔硅球的20%的重活化率。
[0092]通过比较实施例3和9的结果可知，外层修饰蛋白、载药模式等相同的情况下，装载了 H1-6的纳米药物的治疗效果，远高于装载其它重活化剂的纳米药物。
[0093]实施例9:人血清白蛋白纳米颗粒的制备
[0094]将20mg人血清白蛋白溶解于lml NaCl溶液(1mM)中，用NaOH溶液(0.1N)将溶液pH调至8.3，再用0.22 μ m水系滤头过滤溶液；在100rpm转速搅拌下，将续滤液缓慢匀速(lml/min)滴入5ml96%乙醇中；搅拌3min后调大搅拌速度至1500rpm，将8%戊二醛22 μ I注入溶液中继续搅拌反应lmin，向溶液中再加入22 μ I戊二醛溶液，室温避光反应24h。反应停止后，收集HSA NPs混悬液，40C、HOOOrpm下离心12min ;再用蒸馏水离心洗涤样品2次，除去残留的戊二醛、乙醇等物质。离心后得到的纳米粒超声分散于2ml去离子水中，4°C避光保存，用于下一步实验。图14为已制备得到的HSA纳米颗粒。
[0095]实施例10:装载H1-6的人血清白蛋白纳米颗粒对梭曼中枢中毒酶重活化效果的药效学评价
[0096]除纳米药物组为装载了 H1-6的人血清白蛋白纳米颗粒，其余操作制备步骤与实施例3相同，药效评价结果如图15所示，在血酶中H1-6水溶液、纳米药物均使乙酰胆碱酯酶复活率达到了 20%以上，证明我们的纳米药物能有效的释放其所装载的HI6，能达到相同剂量的自由药物的治疗效果；而在脑酶中(图16)，因为H1-6不能穿透血脑屏障，致使其中枢乙酰胆碱酯酶仅能达到4%，而纳米药物由于人血清白蛋白纳米颗粒的转运作用，能部分携带药物进入中枢实现中枢中毒酶的重活化，重活化率达到了 8%，但其值远低于本发明修饰转铁蛋白的纳米药物的20%的重活化率。
[0097]通过比较实施例3和10的结果可知，因为外层修饰蛋白、载药模式等不同，本发明(实施例3所测试药物)对中枢梭曼中毒酶的重活化率远远高于目前已有报道纳米药物人体血清白蛋白纳米颗粒(实施例10)，从而证明了本发明的先进性。
[0098]本发明的优点和有益效果
[0099]本发明与现有技术相比，有以下区别:1.纳米药物的载体材料选择不同。该报道中采用人体血清白蛋白纳米颗粒作为载体，而本发明以无机纳米多孔硅球作为载体；2.外层靶向修饰不同。该报道中纳米药物未采进行外层靶向修饰，而本发明中采用转铁蛋白作为外层靶向修饰；3.载药方式不同。该报道中采用外层吸附挂载药物分子，而本发明中采用内部多孔吸附药物分子；4.评价手段不同。对梭曼中毒动物中枢中毒酶重活化是评价药物是否穿透中枢并迅速起效“金标准”，该报道中未进行药物对中枢酶重活化率评价，本发明进行了相应的药效评价。
[0100]另外更加详述本发明的技术效果如下:
[0101]⑴修饰转铁蛋白的载体能有效的携带药物进入中枢。人员沾染神经性毒剂后，亲脂性的神经性毒剂能迅速穿越血脑屏障进入脑部损害中枢神经系统。而相应的救治药物重活化剂却由于药物亲水性及所含基团的限制不能进入中枢重活化中毒酶，在采用分子改构和普通纳米药物递运未能有效提升重活化率的情况下，本发明率先采用了纳米硅球系统装载药物进中枢，能将原本因亲水性等原因不能进入中枢系统的重活化剂输运至脑部，从而实现有效的中毒救治。
[0102]⑵硅球载体能装载大量的重活化剂，且释药迅速。基于药物使用特殊性，纳米药物需能携带大量药物进入中枢后迅速释药重活化中毒酶。现有的纳米中枢给药系统主要应用于抗癌药物领域，载药量高但释药缓慢而不适用于该体系，而纳米多孔硅球载药系统却能有效的满足中枢中毒酶救治的使用要求。硅球内部的孔洞结构能有效的装载目标药物分子，且多孔结构与外界环境相同使得药物释放拥有足够的释放通道，无需外层修饰高分子层、蛋白质层的舒展或代谢，因而能获得较快的药物释放速度。大量文献已证实，硅材料生物安全性高，已大量应用在了药物载体领域。纳米多孔硅球以上诸多特点尤其适用于作为中枢神经中毒救治药物纳米药物的载药平台。
[0103]⑶该纳米药物能有效重活化梭曼中枢中毒酶。依据对梭曼染毒小鼠中枢中毒酶评价结果，本发明药物对梭曼中枢中毒酶具良好重活化作用，重活化率超过20%，远超过目前已有的所有类型的重活化剂，达到了目前已报道的最高药效。根据已知文献，小鼠脑部乙酰胆碱酯酶重活化率达到10%后，即可有效的对抗毒剂，而该结果为首例报道的梭曼中枢中毒酶超过10%的工作，实现了梭曼中毒救治工作质的飞跃。
【主权项】
1.一种纳米药物，其特征在于:所述纳米药物以内部多孔的纳米多孔硅球作为载体，在载体孔内吸附或装载目标药物，在载体的最外层修饰有蛋白层。
2.权利要求1的纳米药物，所述的目标药物选自水溶性高而不能穿透血脑屏障的药物。
3.权利要求1的纳米药物，其中的目标药物选自对外周梭曼中毒酶有重活化效果的重活化剂，优选为双季胺单肟类重活化剂。
4.权利要求1的纳米药物，其中的目标药物选自酰胺磷定(H1-6)、氯解磷定及双复磷中的至少一种，优选为H1-6。
5.权利要求1的纳米药物，所述的蛋白层采用的蛋白是内源性蛋白，优选转铁蛋白。
6.权利要求1的纳米药物，所述的蛋白层是通过化学反应键合上的一层蛋白层。
7.权利要求1的纳米药物，所述的纳米多孔硅球直径在10nm左右，内部孔洞为2-4nm。
8.权利要求1-7中任一项所述的纳米药物在制备用于中枢解毒药物或者脑部急性疾病治疗药物中的用途。
9.权利要求1-7中任一项所述的纳米药物的制备方法，其包括步骤: (1)利用stober法制备纳米娃球； (2)酸性环境下回流得到多孔结构的纳米硅球； (3)在氮气保护下，在硅球表面键合上硅烷偶联剂； (4)在硅球表面键合上蛋白； (5)完成载药。
10.权利要求9的方法，其特征在于所述步骤(I)具体如下: 将氢氧化钠和十二烷基溴化铵按照摩尔比(1:3.92)溶解于水后，与正硅酸乙酯和乙酸乙酯回流一定时间，优选将875μ L NaOH (2mmol/L)和CTAB (十二烷基溴化铵，0.25g)溶解于120ml水80°C加热半小时后，加入TEOS(正硅酸乙酯正硅酸乙酯，Iml)和乙酸乙酯(Iml),回流1min后，关闭加热和搅拌，老化2h，乙醇离心3次，旋干除去溶剂收集产物； 步骤(2)中所述酸性条件下回流具体操作是将步骤(I)所制样品分散于10ml甲醇中，加入浓盐酸50ml，回流24h后，乙醇离心样品三次，旋干除去溶剂收集产物； 步骤(3)中所述的硅烷剂键合的具体操作步骤是将步骤(2)产物80mg分散于1ml甲苯中，加入硅烷偶联剂GMAS ((3-环氧乙基甲氧基丙基)三甲氧基硅烷)，氮气保护下，避光60°C反应5h后，乙醇离心样品3次，旋干除去溶剂收集产物； 步骤(4)中所述的硅球表面键合蛋白是将Iml转铁蛋白溶液加入步骤(3)中的水溶液中，室温避光搅拌Ih后即得到产品，低温冻存； 步骤(5)中所述的载药的具体操作是将步骤(4)产物分散于8ml水中，加入一定量的目标药物后，避光室温搅拌Ih。
【专利摘要】本发明涉及一种能将药物高效输运至中枢神经系统并随后立即快速释放的纳米药物。更具体而言，该纳米药物以纳米多孔硅颗粒为内核载体装载目标药物分子，将目标药物分子迅速输运至脑部后迅速释放，达到迅速治疗脑部急性疾病的目的。所装载的目标药物，尤其适用于因水溶性强等原因无法穿透血脑屏障的药物。该纳米药物，尤其适用于神经性毒剂中毒后中枢神经系统中毒乙酰胆碱酯酶的救治。
【IPC分类】A61K31-444, A61K9-51, A61K47-04, A61K47-42, A61K31-4425, A61P39-02, A61P25-00
【公开号】CN104840448
【申请号】CN201410051997
【发明人】王永安, 杨军, 王飞剑, 程凤, 房彤宇, 李万华, 骆媛, 聂志勇, 隋昕
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2014年2月17日