用于pH依赖性通过血脑屏障的方法和构建体的制作方法
【专利摘要】本文报道了融合多肽，所述融合多肽包含：i)至少一个结合位点，例如，其包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且其结合内在化的细胞表面受体，和ii)至少一个药学活性化合物，由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH?5.5确定的EC50-值高于该相同结合对在pH?7.4确定的EC50-值，并且报道了该融合多肽用于递送药物活性化合物通过血脑屏障的应用。
【专利说明】用于pH依赖性通过血脑屏障的方法和构建体[0001] 本文报道了融合多肽，所述融合多肽包含至少一个结合位点和至少一个药学活性化合物，由此与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在PH5.5确定的EC5tl-值高于该相同结合位点在PH 7.4确定的EC5tl-值，并且报道了该融合多肽用于递送药物活性化合物通过血脑屏障的应用。
[0002] 发明背景
[0003]通过紧密连接相互连接的内皮或上皮细胞层代表大的极性分子(特别是蛋白)扩散到这些屏障后的组织中的主要障碍。尽管小分子可以通过专门的通道蛋白转运穿过这些屏障，但是蛋白的转运机制仍然是未充分了解的，不过认为生理学最重要的机制是受体介导的胞吞转运作用(receptor-mediated transcytosis, RMT)。
[0004]在RMT过程中，蛋白配体与表达在屏障细胞的腔侧的受体结合，然后其通过内吞作用内在化。内体内容物的分拣在专门的囊泡隔室中完成，并且取决于由受体序列所编码的信号，其介导该受体进入再循环、降解或胞吞转运途径的运输。一个已知的最好的RMT实例是在啮齿动物中通过新生的Fe受体将IgG转运穿过肠上皮细胞。
[0005]对于血脑屏障(BBB)，其由被周细胞和星形细胞围绕的紧密密封的脑内皮细胞组成，也已经描述了一些RMT途径，特别是关于转铁蛋白、胰岛素或低密度脂蛋白的受体。已经表明这些受体的配体包括促进胞吞转运作用的特性，这些特性之一是与其受体的pH-依赖性结合。例如，胰岛素在内在化后当内体内容物被酸化时从其受体中释放出来。
[0006]研究者已经尝试研究受体的胞吞转运作用，以通过将治疗剂与针对这些受体的抗体偶联而将治疗性分子递送通过血脑屏障。然而，这些抗体尚没有一种用在市售药物中，这可能是由于其不充分的转运潜能所致。事实上，还没有关于在多于一种药效学模型中独立地显示的功能性治疗性蛋白穿过BBB胞吞转运的明确证明。
[0007]Kobayashi,等人(Kobayashi, N.，等人,Am.J.Physiol.Renal.Physiol.282 (2002)F358-F365)报道了 FcRn-介导的免疫球蛋白G在人肾近曲小管上皮细胞的胞吞转运作用。Weksler, B.B.，等人在FASEB J.19(2005) 1872-1874中报道了人成体脑内皮细胞系(humanadult brain endothelial cell line)的血脑屏障特异性性质。
[0008]在US 6，030，613中，报道了免疫原的受体特异性跨上皮转运。在WO 02/060919中，报道了具有延长的半衰期的分子、组合物及其应用。WO 93/010819中报道了制备转铁蛋白受体特异性抗体-神经药剂或诊断剂缀合物的方法。在WO 2008/119096中，报道了胞吞转运的免疫球蛋白。WO 2006/056879中报道了人血脑屏障模型。
[0009]EP I 975 178 中报道了胞吞转运模块抗体(transcytotic modularantibody)。US 2008/019984中报道了祀向血脑屏障的抗体。Friden, PM.,等人报道针对人转铁蛋白受体的抗体的表征、受体定位和血脑屏障胞吞转运(J.Pharmacol.Exp.Therap.278 (1996) 1491-1498)。Pardridge 等人.(Pharm.Res.12 (1995) 807-816)报道人胰岛素受体单克隆抗体在体外进行与人脑毛细管的高亲和力结合并且在灵长类动物中在体内快速胞吞转运通过血脑屏障。
[0010]发明概沭[0011]本文报道PH-依赖性结合模式能够使得针对内在化的细胞表面受体(特别是胞吞转运受体)的抗体有效穿过屏障细胞的紧密层，尤其是血脑屏障。例如，已经显示在PH 5.5的结合亲和力(EC5tl值较高)低于其在pH 7.4的亲和力(EC5tl值较低)的抗体，例如，结合人转铁蛋白受体(作为内在化的细胞表面受体的实例)的抗体，被胞吞转运穿过血脑屏障内皮细胞，而在两种PH值处表现出大致相等的亲和力(结合效率大致相等，并且因此，EC50值大致相等)的不同抗体却在细胞内降解。因此，与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH 5.5确定的EC5tl-值高于(大于)该相同结合位点在pH 7.4确定的EC5tl-值。这一标准允许产生并选择针对内在化的细胞表面受体和/或胞吞转运受体的抗体，所述抗体由于对这些受体PH-依赖性的、可逆的结合导致的改变的分拣行为而不在内皮或上皮屏障细胞中被胞内降解。[0012]一方面，本文报道了融合多肽，所述融合多肽包括:
[0013]-至少一个结合位点，所述结合位点结合内在化的细胞表面受体，和
[0014]-至少一个效应器部分，
[0015]由此与内在化的细胞表面受体结合的所述至少一个结合位点在pH 5.5确定的EC50-值高于针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC5tl-值。
[0016]在全部方面的一个实施方案中，所述融合多肽特征在于，i)与内在化的细胞表面受体结合的所述结合位点在PH 5.5确定的EC5tl-值与ii)针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC5tl-值的比率至少为5。在一个实施方案中，所述比率为10或更大。在一个实施方案中，所述比率为15或更大。在一个实施方案中，所述比率约为15。
[0017]在全部方面的一个实施方案中，与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH5.5确定的EC5tl-值是针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC5tl-值的至少5倍。在一个实施方案中，在pH 5.5确定的EC5tl-值是在pH 7.4确定的EC5tl-值的至少10倍。在一个实施方案中，在PH 5.5确定的EC5tl-值约为在pH 7.4确定的EC5tl-值的15倍.[0018]在全部方面的一个实施方案中，所述效应器部分是标记、或细胞毒素、或酶、或生长因子、或转录因子、或药物、或放射性核素、或配体、或抗体、或抗体片段、或脂质体、或纳米粒子、或病毒粒子或细胞因子。
[0019]在全部方面的一个实施方案中，所述效应器部分是药学活性化合物。在一个实施方案中，所述药学活性化合物是抗-Aβ抗体、或抗_tau抗体或抗-α突触核蛋白抗体。
[0020]在全部方面的一个实施方案中，与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH5.5确定的EC50-值为100ng/ml以上、或500ng/ml以上或1000ng/ml以上。
[0021]在全部方面的一个实施方案中，与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH
7.4确定的EC5tl-值为100ng/ml以下、或85ng/ml以下或70ng/ml以下。
[0022]在全部方面的一个实施方案中，所述结合位点是结合对，其包括抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。在一个实施方案中，所述结合对选自Fv、Fab、Fab'、Fab’_SH、F(ab' )2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体、全长重链、全长轻链、完整抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体或六特异性抗体。在一个实施方案中，所述结合对是完整的单克隆抗体。在一个实施方案中，结合对至少是完整抗体的片段、免疫球蛋白超家族的成员或具有免疫球蛋白样结构的多肽，其保留对其抗原的结合特异性。[0023]在全部方面的一个实施方案中，所述结合位点选自纤连蛋白，TCR，CTLA-4，单链抗原受体，例如与T-细胞受体相关的单链抗原受体，抗体模拟物，转铁蛋白，载脂蛋白，adnectin,基于 anticalin 的分子，phylomer, avimer, affibody,锚蛋白重复，Kunitz 结构域，F1DZ-结构域，蝎毒素免疫性蛋白(scorpio toxin immunity protein), Knottin,Versabody,绿色突光蛋白和其他具有结合特性的非抗体蛋白支架。
[0024]一方面，本文报道了编码本文所报道的融合多肽的核酸。
[0025]一方面，本文报道了包含本文所报道的核酸的宿主细胞。
[0026]一方面，本文报道了制备融合多肽的方法，所述方法包括培养本文所报道的宿主细胞从而产生所述融合多肽。
[0027]—方面，本文报道了一种药物制剂，所述药物制剂包含本文所报道的融合多肽和任选的药用载体。
[0028]一方面，本文报道了本文所报道的融合多肽用作药物。
[0029]一方面，本文报道了本文所报道的融合多肽用于治疗CNS-相关的疾病。
[0030]一方面，本文报道了本文所报道的融合多肽用于递送药物活性化合物穿过血脑屏障。
[0031]一方面，本文报道了本文所报道的融合多肽在制备药物中的应用。
[0032]在一个实施方案中，所述药物用于治疗CNS-相关的疾病。
[0033]一方面，本文报道了一种治疗患有CNS-相关的疾病的个体的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的本文所报道的融合多肽。
[0034]一方面，本文报道了一种递送药学活性化合物穿过个体中的血脑屏障的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的本文所报道的融合多肽，从而递送药学活性化合物穿过血脑屏障。
[0035]一方面，本文报道了一种递送药学活性化合物穿过个体中或受试者的脑中的血脑屏障的方法，所述方法包括施用与结合对融合的药学活性化合物，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且其结合内在化的细胞表面受体，由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在PH 5.5确定的EC5tl-值高于该相同结合对在pH 7.4确定的 EC5tl-值。
[0036]在全部方面的一个实施方案中，所述融合多肽特征在于与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在PH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC5tl-值的比率至少是5。在一个实施方案中，所述比率是10以上。
[0037]本文报道的一个方面是融合多肽用于递送药学活性化合物穿过血脑屏障的应用，所述融合多肽包含:
[0038]-至少一个结合对，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且其结合内在化的细胞表面受体，和
[0039]-至少一个药学活性化合物，
[0040]由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合对在PH 7.4确定的EC5tl-值的比率为10以上。
[0041]本文 报道的一个方面是对受试者的上皮细胞进行胞吞转运的方法，所述方法包括给所述受试者施用融合多肽，所述融合多肽包含:[0042]-至少一个结合对，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且其结合内在化的细胞表面受体，和
[0043]-至少一个药学活性化合物，
[0044]由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合对在PH7.4确定的EC5tl-值的比率为10以上。
[0045]本文报道了一种递送药学活性化合物穿过个体中的血脑屏障的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的融合多肽，所述融合多肽包含:
[0046]-至少一个结合对，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且其结合内在化的细胞表面受体，和
[0047]-至少一个药学活性化合物，
[0048]由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合对在PH 7.4确定的EC5tl-值的比率为10以上，从而使得所述融合多肽递送药学活性化合物穿过血脑屏障。
[0049]一方面本文报道了融合多肽在制备药物中的应用，所述融合多肽包含:
[0050]-至少一个结合对，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且其结合内在化的细胞表面受体，和
[0051]-至少一个药学活性化合物，
[0052]由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合对在PH 7.4确定的EC5tl-值的比率为10以上。
[0053]一方面，本文报道了一种相对于非缀合形式的一个或多个药学活性化合物穿过血脑屏障的转运而言增加至少一个药学活性化合物穿过个体中的血脑屏障的转运的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的融合多肽，所述融合多肽包含:
[0054]-至少一个结合对，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且其结合内在化的细胞表面受体，和
[0055]-至少一个药学活性化合物，
[0056]由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合对在PH 7.4确定的EC5tl-值的比率为10以上，从而使得所述融合多肽转运所述药学活性化合物穿过血脑屏障。
[0057]—方面，本文报道了一种选择用于一个或多个药学活性化合物的有效血脑屏障转运的结合对的方法，所述方法包括测量一个或多个结合对与内在化的细胞表面受体在PH5.5和pH 7.4的结合的EC5tl-值的比率，并且选择其中比率为10以上的一个或多个结合对。
[0058]在全部方面的一个实施方案中，所述融合多肽特征在于与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在PH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC5tl-值的比率为15以上。在还有一个实施方案中，所述比率约为15。
[0059]在全部方面的一个实施方案中，与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC5tl-值是与针对该相同受体的该相同结合对在pH 7.4确定的EC5tl-值的至少5倍。在一个实施方案中，在PH 5.5确定的EC5tl-值是在pH 7.4确定的EC5tl-值的至少10倍。在一个实施方案中，在PH 5.5确定的EC5tl-值约是在pH 7.4确定的EC5tl-值的15倍。
[0060]一方面，本文报道如本文所报道的融合多肽用于递送药学活性化合物穿过血脑屏障的应用。
[0061]一方面，本文报道一种对受试者的上皮细胞进行胞吞转运的方法，所述方法包括给所述受试者施用如本文所报道的融合多肽。
[0062]一方面，本文报道一种用于选择抗体或融合多肽的方法，所述抗体或融合多肽包含至少一个结合位点，其中所述抗体或融合多肽关于与内在化的细胞表面受体结合在pH
5.5确定的EC5tl-值高于针对该相同受体的该相同抗体或该相同融合多肽在pH 7.4确定的EC50-值。
[0063]在全部方面的一个实施方案中，所述抗体或融合多肽特征在于与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在PH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合位点在pH
7.4确定的EC5tl-值的比率至少为5。在一个实施方案中，所述比率为10以上。在一个实施方案中，所述比率为15以上。在一个实施方案中，所述比率约为15。
[0064]在全部方面的一个实施方案中，与内在化的细胞表面受体结合的结合位点在pH
5.5确定的EC5tl-值是针对该相同受体的该相同结合位点在pH 7.4确定的EC5tl-值的至少5倍。在一个实施方案中，在pH 5.5确定的EC5tl-值是在pH 7.4确定的EC5tl-值的至少10倍。在一个实施方案中，在PH 5.5确定的EC5tl-值约是在pH 7.4确定的EC5tl-值的15倍。
[0065]在本文所报道的全部方面的一个实施方案中，所述CNS-相关的疾病选自:(i)神经变性疾病或病症，如帕金森病、阿尔茨`海默病或亨廷顿病，或(ii)精神病，如抑郁症、焦虑症、精神分裂症(schizophrenia),或(iii)神经炎症和其他神经病症,如多发性硬化(multiple sclerosis)、肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis)、孤独症(autism)或疼痛，或(iv)CNS的肿瘤，或(v)CNS的病毒和细菌感染。
[0066]发明详沭
[0067]本发明证明了 pH-依赖性结合模式能够使得包含至少一个结合位点的融合多肽多肽和针对胞吞转运受体的抗体有效地穿过屏障细胞的紧密层。例如，表明针对人转铁蛋白受体的抗体，与其在pH 7.4的亲和力相比,其在pH 5.5结合亲和力低,该抗体被胞吞转运穿过血脑屏障内皮细胞，而在这两个PH值处表现出相等的对转铁蛋白受体的有效结合的另一种抗体在细胞内被降解。本发明允许选择和产生针对胞吞转运受体的抗体，所述抗体由于针对这些受体的PH-依赖性的、可逆的结合引起的改变的分拣行为而避免内皮或上皮屏障细胞中的胞内降解。
[0068]1.定义
[0069]术语“亲和力”表示分子(例如，多肽或抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，靶标或抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，当用在本文中时，“结合亲和力”是指反映结合对的成员之间(例如，以多肽-多核苷酸-复合物中，或在多肽与其靶标之间，或在抗体与其抗原之间)的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的的常用方法测量，诸如表面等离子体共振，并且还包括本文所报道的那些方法。分子X对齐结合配偶体Y的较高的亲和力可见于较低的Kd和/或EC5tl值。
[0070]术语“抗体”包括各种形式的抗体结构，包括完整抗体和抗体片段。本文所报道和应用的抗体可以是人抗体、人源化的抗体、嵌合抗体或T细胞抗原消耗的抗体(T cellantigen depleted antibody)。术语“抗体”是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白。识别的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及众多的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在，包括，例如，Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双抗体。全长抗体通常包括两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。重链和轻链多肽中的每一个包含可变结构域(可变区)(通常是所述多肽链的氨基端部分)，所述可变结构域包含能够与抗原相互作用的结合区。重链和轻链多肽中的每一个包含恒定区(通常是羧基端部分)。重链的恒定区介导i)抗体与携带Fe Y受体(FcyR)的细胞(如吞曬细胞)的结合,或ii)抗体与携带新生Fe受体(FcRn)(也已知为Brambell受体)的结合。其还介导与一些因子的结合，所述因子包括经典补体系统的因子，如补体(Clq)。
[0071]免疫球蛋白的轻链或重链的可变结构域又包含不同的节段，即，四个构架区(FR)和三个超变区(CDR)。
[0072]术语“结合对(binding pair) ”表示多肽,其包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。可变结构域可以通过适当的方式如肽键、接头、或连接非肽成分彼此连接。在一个实施方案中，所述结合对选自Fv，Fab，Fab'，Fab ’ SH，F (ab' ) 2，双抗体，线性抗体，单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体，全长重链，全长轻链，完整抗体，双特异性抗体，三特异性抗体，四特异性抗体，或六特异性抗体。在一个实施方案中，所述结合对是单克隆抗体。在一个实施方案中，结合对至少是完整抗体的片段，免疫球蛋白超家族的成员，或保留对其抗原的结合特异性的具有免疫球蛋白样结构的多肽。
[0073]术语“结合位点”表示能够特异性结合另一多肽的多肽。在一个实施方案中，所述结合位点是结合对。在一个实施方案中，所述结合位点是具有免疫球蛋白样模块结构的多肽，其可以选自由下列各项组成的组:纤连蛋白，TCR，CTLA-4，单链抗原受体，例如，与T细胞受体和抗体相关的那些，抗体模拟物，转铁蛋白，载脂蛋白，adnectins,基于anticalins的分子，phylomers, avimers, affibodies,锚蛋白重复，Kunitz结构域，F1DZ-结构域,蝎毒素免疫性蛋白，Knottins, Versabodies,绿色突光蛋白和其他具有抗原结合特性的非抗体蛋白支架。
`[0074]术语“CNS-相关的疾病”表示中枢神经系统(CNS)的疾病或病症。CNS-相关的疾病为，但不限于，特别是(i)神经变性疾病或病症，如帕金森病、阿尔茨海默病或亨廷顿病，
(ii)精神病，如抑郁症、焦虑症、精神分裂症，(iii)神经炎症和其他神经病症，如多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、孤独症或疼痛，(iv)CNS的肿瘤，或(V)CNS的病毒和细菌感染。
[0075]“化疗剂”是有效用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷基化试剂，如塞替哌(thiotepa)和环磷酰胺(eyelosphosphamide) CYTOXAN? ;烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan) ;口丫丙唳类(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimines)和methylamelamines,包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基憐酉先胺(trietyIenephosphoramide)、塞替哌(triethiyIenethiophosphoramide)和三轻甲蜜胺(trimethy11meIamine);氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、蔡氣芥(chlornaphazine)、胆憐酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard);亚硝基服(nitrosureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(1mustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine);抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、惠霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素 C (cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、carabicin、去甲柔红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、方文线菌素 D (dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、麦考酌 酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、撤揽霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、potf iromycin、票呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物如甲氨噪呤(methotrexate)和 5_ 氟尿啼 P定(5-fluorouracil) (5-FU);叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨噪呤、噪罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；P票呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6_巯P票呤(6-mercaptopurine)、硫咪票呤(thiamiprine)、硫鸟票呤(thioguanine)；啼 P定类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifIuridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5_FU ；雄激素类诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺药(ant1-adrenals)如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补偿物如frolinic acid;醋葡醒内酯(aceglatone);轻醒磷酰胺配糖(aldophosphamideglycoside) ;5_氨基酮戊酸(a`minolevulinic acid);安口丫唳(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate) ;defofamine ;秋水仙胺(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ；依利醋铵(elliptinium acetate);依托格鲁(etoglucid);硝酸嫁(gallium nitrate);羟基服(hydroxyurea);香燕多糖(Ientinan)；氯尼达明(1nidainine);米托胍腙(mitoguazone);米托惠酉昆(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidanmol);尼曲口丫 P定(nitraerine);喷司他丁 (pentostatin);异丙嗪(phenamet)；批柔比星(pirarubicin);鬼曰酸(podonhvllinic acid) ;2_ 乙基酉先月井(2-ethylhydrazide);丙卡巴月井(procarbazine) ；PbK ? 雷佐生(razoxane);西佐喃(sizofiran);错螺胺(spirogermanium);细格抱氮杂酸(tenuazonic acid);三亚月安酉昆(triaziquone) ；2, 2y，2，，_ 三氣三乙月安(2，2’，2，，一trichlorotriethylamine)；乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine) ; 二溴甘露醇(mitobronitol) ; 二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴焼(pipobroman) ；gacytosine ;阿拉伯糖苷(arabinoside) ( “Ara_C” );环憐酸胺；塞替哌(thiotepa);紫杉烧类(taxanes)，例如，紫杉酉享(TAXOL?，Bristol-Myers SquibbOncology, Princeton,新泽西)和多西他赛(docetaxel) (TAXOTERE ?, Rh6ne_PoulencRorer, Antony,法国);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他滨(gemcitabine) ;6_ 硫鸟嘌呤(6-thioguanine);巯嘌呤(mercaptopurine);甲氨喋呤；钼类似物如顺钼(cisplatin)和卡钼(carboplatin);长春喊(vinblastine);钼；依托泊苷(etoposide) (VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);丝裂霉素C (mitomycins C);米托葸醌(mitoxantrone);长春新碱(vincristine);长春瑞滨(vinorelbine);诺维本(navelbine);诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide);柔红霉素(daunomycin);氨基喋呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊班膦酸盐(ibandronate) ;CPT_II ;35拓扑异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine) (DMFO);视黄酸(retinoic acid);烯二块葸环类抗生素(esperamicins);卡培他滨(capecitabine);以及任何上述物质的药用盐、酸或衍生物。该定义中还包括抗激素剂，其作用调节或抑制对肿瘤的激素作用，如抗雌激素药，例如，包括他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(raloxifene),抑制芳香酶的4(5)-咪唑类(4(5)_imidazoles) ,4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen),曲沃昔芬(trioxifene), keoxifene, LY117018，奥那司酮(onapristone),和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素药，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(Ieuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及任何上述物质的药用盐、酸或衍生物。[0076]“抗血管生成剂”是指阻断或在某种程度上干扰血管发展的化合物。例如，抗血管生成剂可以是与参与促进血管生成的生长因子或生长因子受体结合的小分子或抗体。在一个实施方案中，所述抗血管生成剂是与血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。
[0077]术语“细胞因子”是一般性术语，指由一个细胞群释放的对另一个细胞起细胞间调节剂作用的蛋白。此种细胞因子的实例是淋巴细胞因子(Iymphokines)、单核细胞因子(monokines)和传统的多肽激素。细胞因子中包括的是生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原(proinsulin)；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和促黄体生成素(LH);肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子_a和-P ；苗勒氏管抑制物质(mullerian-1nhibiting substance);小鼠促性腺激素相关肽；抑制素(inhibin);活化素(activin);血管内皮生长因子；整联蛋白(integrin);血小板生成素(TPO);神经生长因子如NGF-p ;血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)如TGF_a和TGF-p ;胰岛素样生长因子-1和-1I ;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子(osteoinductivefactors);干扰素如干扰素-a、_p和-y，集落刺激因子(CSFs)如巨噬细胞-CSF (M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF);和粒细胞-CSF(GCSF);白细胞介素(ILs)如IL_1、IL-1a,IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-1O、IL-11、IL-12 ;肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-P ;和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。当用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白，以及天然序列细胞因子的生物活性等价物。
[0078]术语“fMLP”表示由N-甲酰甲硫氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸组成的三肽。在一个实施方案中，效应子部分为fMLP或其衍生物。
[0079]术语“融合多肽”表示这样的多肽，所述多肽包含至少两个离散的肽或多肽(在天然多肽中不以这种方式一起存在，即，这些部分不天然存在于同一种多肽中或以相同的顺序存在)，或由至少两个离散的肽或多肽(在天然多肽中不以这种方式一起存在，即，这些部分不天然存在于同一种多肽中或以相同的顺序存在)组成。所述融合多肽的各部分通过肽键连接。
[0080]术语“肽接头”表示天然的和/或合成来源的接头，其包含彼此通过肽键连接的氨基酸残基。其由线性氨基酸链组成，其中20种天然存在的氨基酸是单体结构单元。链的长度为I至50个氨基酸残基，在一个实施方案中，3-28个氨基酸残基，在另一个实施方案中，4-20个氨基酸残基。接头可以包含重复的氨基酸序列或天然存在的多肽的序列。接头的功能是确保通过所述接头连接的两种元件可以正确折叠并且由于空间和旋转自由度而正确呈现。在一个实施方案中，接头是“合成的肽接头”，其设计为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。例如，这些残基排列为多至五个氨基酸的小重复单位，如(G)GGGS, (Q)QQQG,或(S) SSSG(SEQ ID NO: 1，2和3)。这种小的重复单位可以重复两次至五次，以形成多聚体单位。其他合成的肽接头包含重复10-20次的单一氨基酸，诸如例如，在接头GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO: 4)中的丝氨酸。在一个实施方案中，接头选自[GQ4J3GNN (SEQ ID NO: 5)，LSLSPGK (SEQ ID NO: 6)，LSPNRGEC (SEQ IDNO: 7)，LSLSGG(SEQ ID NO: 8)，LSLSPGG(SEQ ID NO: 9)，G3 [SGj2SG(SEQ ID NO: 10)或 G3 [SGJ2SG2 (SEQ ID NO: 11)。
[0081]术语“前体药物”用在本申请中是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其较亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒性更小并且能够被酶活化或转化为更具活性的亲本形式。例如，参见Wilman, " Prodrugs in Cancer Chemotherapy (癌症化疗中的前体药物)"Biochemical Societv Transactions (生物化学学会学报)，14,第 375-382 页，615thMeeting Belfast (1986)和Stella等人，"Prodrugs: A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery,(前体药物:革巴向药物递送的化学方法)"Directed Drug Delivery (定向药物递送)，Borchardt等人，(编辑)，第247-267页,Humana Press (1985) ?可以用作效应子部分的前体药物包括，但不限于，含磷酸盐的前体药物，含硫代磷酸盐的前体药物，含硫酸盐的前体药物，含肽的前体药物，D-氨基酸修饰的前体药物，糖基化前体药物，含β -内酰胺的前体药物，任选取代的含苯氧基乙酰胺的前体药物或任选取代的含苯基乙酰胺的前体药物，可以被转化为更具活性的无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟胞嘧啶前体药物。可以被衍生成用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括，但不限于，本文所述的那些化疗剂。
[0082]术语“细胞毒性部分”是指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞破坏或死亡的物质。细胞毒性剂包括，但不限于，放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32、pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药(例如，甲氨喋呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素 C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂(intercalating agents));生长抑制剂；酶及其片段，如核水解酶；抗生素；毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及本文所公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
[0083]药剂、例如药物制剂的“有效量”是指以需要的剂量并且持续所需的时间阶段有效获得需要的治疗结果或预防结构的量。
[0084]术语“EC5Q-值”表示多肽(例如抗体)在确定系统(例如ELISA)中诱导在基线值和最大值之间的50%的反应的半最大有效浓度。这是对治疗性药物功效的量度。因此，EC5tl-值为基于与导致50%效果的药物物质的浓度相对应的实验数据计算的浓度。减小的EC50-值表示较高的药物亲和力和功效。
[0085]“人抗体”是具有与由人或人细胞产生的抗体或利用人抗体全体成员或其他编码人抗体的序列而来源于非人资源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化的抗体。
[0086]“人源化”抗体是指包含来自非人HVRs的氨基酸残基和来自人FRs的氨基酸残基的嵌合抗体。在特定的实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、通常两个如下可变结构域，其中所有或基本上所有HVRs (例如CDRs)对应于非人抗体的HVRs，且所有或基本上所有FRs对应于人抗体的FRs。人源化抗体任选还将包含至少部分来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。[0087]“免疫缀合物”是与一个或多个非抗体来源的分子缀合的抗体或抗体片段，所述非抗体来源的分子包括，但不限于，结合对成员，核酸或效应子部分。
[0088]“个体”或受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化的动物(如奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物诸如猴子)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
[0089]术语“内在化的细胞表面受体”表示一组细胞表面受体，其包括至少下述成员:脱唾液酸糖蛋白受体，α (2，3)唾液酸糖蛋白受体，白喉毒素受体(DTR，其为肝素-结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)的膜结合的前体)，叶酸受体，谷氨酸受体，谷胱甘肽受体，胰岛素受体，胰岛素样生长因子(IGF)受体，瘦蛋白受体，低密度脂蛋白(LDL)受体，LDL-相关蛋白I受体(LRP1，B型)，LRP2受体(也已知为megalin或糖蛋白330), LRP4受体，LRP5受体，LRP6受体，LRP8受体，甘露糖6-磷酸盐受体，清除受体(A或B类，1、II或III型，或⑶36或⑶163)，P物质受体，硫胺素转运蛋白，转铁蛋白-1和-2受体，和维生素B12受体。
[0090]术语“单克隆抗体”是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体抗体(例如，该变体抗体包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)之外，构成群体的各个抗体相同并结合相同的表位。与多克隆抗体制剂相反，所述多克隆抗体制剂典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同的抗体，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，要用于本文所报道的融合多肽中的单克隆抗体或单克隆抗体片段可以通过多种技术制备，所述技术包括，但不限于，杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和使用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，所述方法和其他示例性的用于制备单克隆抗体的方法在本文中描述。
[0091]术语“药物制剂”是指一种制备物，其以允许其中包含的活性成分的生物活性有效的形式存在，并且其不包含对将要给药所述制剂的受试者有不可接受的毒性的另外的成分。
[0092]“药用载体”是指药物制剂中除活性成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0093]术语“跨细胞转运”表示分子、特别是大分子或生物聚合物如抗体转运穿过细胞的细胞质的多步骤过程。在跨细胞转运的第一步中，胞外空间物质/分子或细胞表面-缔合或-结合的分子被包绕在囊泡中。该步骤称为胞吞。囊泡扩散穿过细胞的细胞质。然后，胞吞步骤倒转，即，囊泡与细胞膜融合并且囊泡内部被释放到胞外空间中。例如，跨细胞转运发生在上皮细胞、血脑屏障的细胞、神经元或肠细胞中。
[0094]当用于本文时，“治疗”(及其语法变化，如“进行治疗”或“正在治疗”)是指尝试改变被治疗的个体的天然进程的临床干预，并且可以为预防的目的进行或在临床病理学的病程过程中进行。需要的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发，症状减轻，消除疾病的任何直接或间接的病理学后果，防止转移，减慢疾病进展速度，改善或减轻疾病状况，和缓和或改善预后。在一些实施方案中，本文所报道的融合多肽用于减缓疾病的发生或减慢疾病的进展。
[0095]术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链参与抗体与其抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FRs)和三个超变区(HVRs)(例如，参见T.J.，等人.，Kuby Immunology, 6thed., ff.H.Freeman and C0., N.Y.(2007),第 91 页)。单个 VH 或 VL 结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以用VH或VL结构域分别筛选互补VH或VL结构域的文库从结合抗原的抗体中分离(例如`，参见Portolano，S.，等人.，J.1mmunol.(免疫学杂志)150 (1993) 880-887, Clackson, T.,等人.,Nature (自然)352(1991)624-628)。
[0096]术语“载体”用在本文中是指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括自复制核酸结构的载体以及结合到已经引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
[0097]冠词“一个”("a"和"an")用在本文中是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法宾语。例如，“一个抗体”意指一个抗体或多于一个抗体。
[0098]“多肽”是由肽键连接的氨基酸组成的聚合物，而不管是天然产生的还是合成产生的。少于约20个氨基酸残基的多肽可以称为“肽”，而由两个或更多个多肽组成的分子或包含一个多于100个氨基酸残基的多肽的分子可以称为“蛋白”。多肽还可以包含非氨基酸成分，诸如碳水化合物基团，金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可以由表达多肽的细胞加入，并且可以随细胞类型而变化。多肽在本文中根据其氨基酸骨架结构或编码其的核酸定义。诸如碳水化合物基团的添加通常不指定，但是也可以存在。
[0099]术语“特异性结合”表示结合位点或多肽或抗体或抗体片段与其靶标以KT5M以下的解离常数(Kd)结合，在一个实施方案中，以10_7M-10_13M的解离常数(Kd)结合，在另一个实施方案中，以10_7m-10_9m的解离常数(Kd)结合。该术语还用于表明所述多肽不与其他存在的生物分子结合，即，其以10_4m以上的解离常数(Kd)结合其他生物分子，在一个实施方案中，以10_4M至IM的解离常数(Kd)结合其他生物分子。[0100]术语“药学活性化合物”表示其活性需要被递送至作用位置的任意分子或分子组合。药学活性化合物包括，但不限于，药物(例如，多肽、抗体)，标记，细胞毒素(例如，假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素，蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，白喉毒素等)，酶，生长因子，转录因子，放射性核素，配体，脂质体，纳米颗粒，病毒颗粒，细胞因子等。
[0101]I1.组合物和方法
[0102]本文报道的是融合多肽，使用其可以将治疗剂(生物活性化合物)如多肽、抗体或毒素转运穿过细胞膜，特别是穿过血脑屏障。因此，本文所报道的融合多肽利用一种通用的转运机制，即，受体介导的胞吞作用和利用内在化的细胞表面受体的胞吞转运作用。
[0103]在一个实施方案中，本文报道融合多肽，所述融合多肽包含:
[0104]-至少一个结合位点,所述结合位点结合内在化的细胞表面受体,和
[0105]-至少一个药学活性化合物，
[0106]由此与内在化的细胞表面受体结合的所述结合位点在pH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合位点在PH 7.4确定的EC5tl-值的比率为10以上。
[0107]在一个实施方案中，所述比率为15以上。
[0108]在一个实施方案中，所述比率为100以上。
[0109]在一个实施方案中，所述比率为10-100。
[0110]在一个实施方案中，所述结合位点在pH 5.5确定的EC5tl-值为700ng/ml以上。在一个实施方案中，所述结合位点在PH 5.5确定的EC5tl-值为850ng/ml以上。在一个实施方案中，所述结合位点在PH 5.5确定的EC5tl-值为1000ng/ml以上。
[0111]在一个实施方案中，所述结合位点为结合对，其包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。在一个实施方案中，所述结合对选自Fv、Fab、Fab'、Fab’_SH、F(ab' )2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体、全长重链、全长轻链、完整抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体或六特异性抗体。在一个实施方案中，所述结合对是完整的单克隆抗体。在一个实施方案中，所述结合对至少是完整抗体的片段、免疫球蛋白超家族的成员或具有免疫球蛋白样结构的多肽，其保留对其抗原的结合特异性。
[0112]在一个实施方案中，所述结合位点选自纤连蛋白，TCR，CTLA-4，单链抗原受体，例如，与T细胞受体和抗体相关的那些，抗体模拟物，转铁蛋白，载脂蛋白，adnectins，基于anticalins 的分子,phylomers,avimers,affibodies,锚蛋白重复,Kunitz 结构域,PDZ-结构域，蝎毒素免疫性蛋白，Knottins，Versabodies，绿色荧光蛋白和其他具有结合特性的非抗体蛋白支架。
[0113]在一个实施方案中，所述结合位点是特异性结合转铁蛋白受体的全长抗体或抗体片段。
[0114]不希望受理论束缚，图1显示pH-依赖性胞吞转运机制的示意图。负载铁的完整的转铁蛋白(holo-transferrin)(中间图)用来自脑内皮细胞的顶侧膜的转铁蛋白受体胞吞转运。当内体酸化时，铁从所述完整的转铁蛋白释放，这由该受体的转铁蛋白-结合结构域的构象变化起始。Apo-转铁蛋白保持与所述受体结合。在穿过分拣内体后，该受体再循环到顶侧膜或胞吞转运到底外侧膜中。在囊泡膜融合后，在PH 7.4对所述受体无亲和性的apo-转铁蛋白从所述受体解离并且离开细胞。相反(左图)，转铁蛋白-受体抗体mAb 128.1，其在pH 7.4和在pH 5.5以高亲和力与受体结合，即，具有小于5的EC5tl值比率(1.3)，其与所述受体形成紧密的复合物，该复合物在内体中在该pH值也是稳定的。pH-稳定的复合物的存在防止再循环和胞吞转运，而不是诱导该受体重新进入到⑶63-阳性晚期内体中。具有PH依赖性结合特性的抗-转铁蛋白-受体抗体(由抗体MEM-189示例，其在内体pH的减少的(酸性)pH值表现出减少的受体结合；右图，大于10的EC5tl值比率(15.6))能够进行胞吞转运和再循环，不受理论束缚，可能通过在内体隔室中与转铁蛋白-受体的可逆的、低亲和力相互作用进行。
[0115]图3中，显示本文所用的胞吞转运测定的验证，其通过胞吞转运1251-转铁蛋白穿过hCMEC/D3脑内皮细胞进行。将在胶原-包被的滤器插入物上的hCMEC/D3细胞用1251-标记的转铁蛋白装载I小时。然后，洗涤该插入物并且在37°C (图3A)或4°C (图3B)转移到新平板中。在所示的时间点，通过在TCA沉淀后的Y计数(CPM)测量细胞裂解物(黑色正方形)、顶侧(灰色柱)和底外侧(白色柱)介质隔室中的放射性活性。每个时间点的放射性活性的总和显示为白色三角形。尽管在37°C，转铁蛋白以相等的量离开细胞层进入顶侧或底外侧介质隔室(A)，但是在4°C，其停留在细胞内(B)，这证明转运过程是能量依赖性的。
[0116]在图4中，显示针对人转铁蛋白受体的mAb 128.1不离开hCMEC/D3细胞。1251-标记的mAb 128.1允许被hCMEC/D3细胞摄入，并且如上述在细胞、顶侧和底外侧介质隔室中确定放射性活性(图3)。没有完整的抗体离开细胞进入顶侧或底外侧隔室。相反，细胞内放射性活性缓慢降低，这提供抗体胞内降解的提示。
[0117]在图5中，显示针对人转铁蛋白受体的mAb 128.1，与转铁蛋白不同，在内在化后于晚期内体标记⑶63共同定位。将在胶原包被的盖玻片上生长的hCMEC/D3细胞用mAb 128.1或FITC-标记的转铁蛋白温育十分钟，然后处理用于免疫荧光。mAb 128.1用Alexa-488-标记的二级抗体检测(A)，图C显示转铁蛋白-FITC荧光。两种制备物都用针对晚期内体标记⑶63的抗体和Alexa-594-标记的二级抗体复染色(B，D)。尽管mAb 128.1显示与CD63共同定位，但是在晚期内体/溶酶体隔室中没有发现转铁蛋白，这表明通过mAb128.1转铁蛋白受体离开再循环/胞吞转运重新进入降解交通途径。
[0118]在图6中，显示针对人IGF-1受体的抗体(抗-1GF-1R抗体)不被胞吞转运，而是再循环到胞外介质中。胞吞转运实验如上述(参见图2和3)进行，不同之处在于抗体定量不通过放射性活性计数进行而是通过使用高灵敏性的人IgG ELISA进行。可以看出，抗-1GF-1R抗体不被胞吞转运，而是再循环到顶侧隔室中，这证明IGF-1受体专有地在血脑屏障内皮细胞中再循环。
[0119]在图7中，显示针对人转铁蛋白受体的mAb MEM-189，与mAb 128.1不同，被再循环并被胞吞转运。实验按上述(见图6)进行，使用小鼠IgG ELISA进行定量。与mAb 128.1相反，mAb 128.1不存在于顶侧或底外侧隔室中(见上述，图4)，mAb MEM-189以相等的量再循环和胞吞转运，其转运速率略低于转铁蛋白的转运速率(也参见图3A)。
[0120]在图8中，显示mAb MEM-189以pH-依赖性方式与转铁蛋白受体结合，而mAb128.1不显示pH-依赖性的结合。通过ELISA测量抗体128.1和MEM-189与人转铁蛋白受体胞外结构域在pH 7.4(胞外pH)或pH 5.5(内体pH)的结合。尽管mAb 128.1在这两个pH值处与该受体以相似的亲和力结合(pH 7.4为三角形，pH 5.5为十字形)，但是mAbMEM-189在pH 5.5(倒三角形)表现出与pH 7.4(圆形)相比强烈减少的结合。在pH 7.4，mAb MEM-189与受体的结合比mAb 128.1与受体的结合弱(见下表中的EC5tl-值)。在下表中，显示针对细胞表面受体的各种抗体的EC5tl值及其各自的EC5tl值比率。
[0121]表
[0122]
【权利要求】
1.一种递送药学活性化合物穿过个体中的血脑屏障的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的融合多肽，所述融合多肽包含: -至少一个结合对，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且所述结合对结合内在化的细胞表面受体，和-至少一个药学活性化合物， 由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合对在PH7.4确定的EC5tl-值的比率为10以上，从而递送药学活性化合物穿过血脑屏障。
2.融合多肽用于递送药学活性化合物穿过血脑屏障的应用，其中所述融合多肽包含: -至少一个结合对，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且所述结合对结合内在化的细胞表面受体，和 -至少一个药学活性化合物， 由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合对在PH 7.4确定的EC5tl-值的比率为10以上。
3.一种对受试者的上皮细胞进行胞吞转运的方法，所述方法包括给所述受试者施用融合多肽，所述融合多 肽包含: -至少一个结合对，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且所述结合对结合内在化的细胞表面受体，和-至少一个药学活性化合物， 由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在PH5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合对在PH 7.4确定的EC5tl-值的比率为10以上。
4.融合多肽用于制备药物的应用，所述多肽包含: -至少一个结合对，所述结合对包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，并且所述结合对结合内在化的细胞表面受体，和-至少一个药学活性化合物， 由此与内在化的细胞表面受体结合的结合对在pH 5.5确定的EC5tl-值与针对该相同受体的该相同结合对在PH 7.4确定的EC5tl-值的比率为10以上。
5.根据权利要求4的应用，其特征在于所述药物用于治疗CNS-相关的疾病。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法或应用，其特征在于所述比率为15以上。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法或应用，其特征在于所述比率为大约15。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法或应用，其特征在于与内在化的细胞表面受体结合的所述结合对在PH 5.5确定的EC5tl-值为1000ng/ml以上。
【文档编号】C07K16/28GK103502273SQ201280018897
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年4月18日 优先权日:2011年4月20日
【发明者】贝恩德·博尔曼, 佩尔-奥拉·弗雷斯克加德, 阿德里安·胡根马特, 埃哈德·科佩茨基, 埃克哈德·默斯纳, 延斯·涅沃纳, 哈达萨·苏穆·萨德, 巴勃罗·乌马纳 申请人:罗氏格黎卡特股份公司