专利名称：使用具有血脑屏障的昆虫的筛选方法
技术领域：
本发明涉及旨在反映脊椎动物血脑屏障(BBB)渗透的昆虫模型。BBB渗透的研究在药物开发中具有极其重要的意义；成功的CNS药物需要通过BBB，而外周作用的药物可能由于BBB渗透而引起不想要的副作用。具体而言，本发明涉及昆虫在筛选对于脑或中枢神经系统具有生物学效应和/或对于脑或中枢神经系统的疾病或病症具有效应的物质中的用途。其还涉及此类昆虫在筛选具有想要的生物学活性并且不通过血脑屏障的物质中的用途。
背景技术：
药物开发是昂贵的事件，其中就金钱和时间而言主要花费之一在于体内研究。为了减少这些花费，开发了多种体外模型，并将其用作筛选器以选择最适合进行体内研究的化合物。但是，体外模型经常过于简单化，并且因此可能在作决定的过程中起误导作用。因此，需要这样一种中间模型其比体外模型更值得信赖，并且同时比传统的脊椎动物体内模型更迅速且更便宜。昆虫可以起到该作用，目前EnVivoPharmaceuticals Inc.使用果蝇作为中间体药效学(PD)模型，该公司开发CNS药物。现有的体外测试具有几个问题。不可能通过实施体外测定来解释体内发生的所有生物学事件。存在尚未被理解的生物学事件，或者在现有的体外测定中存在缺陷，例如， 测定中可能缺少存在于体内的重要特征，包括活性转运子分子、代谢酶，或甚至是无法预料的生物学事件。虽然有明显的缺陷，但是在药物开发过程中仍然大量使用体外模型，其中多数制药公司使用大量的体外筛选。在大量的体外测定中测试化合物并不一定总能反映体内行为。事实上，经常见到有些化合物具有可接受的体外特征谱，但最终具有不足的体内特征谱。另一方面，也可能因为错误的原因而丢弃化合物。因此，需要中间的体外/体内模型， 其能够以改善的数据支持药物开发研究，从而减少昂贵的体内实验的数量。体外模型的使用基于以下假设每个模型都反映一个单一的和分离的体内生物学事件。但是，在开发期使用的大量体外模型(Ruiz-Garcia等人，2007)旨在反映体内生物学的复杂性，其中多个生物学事件发生在多个区室(compartment)中。使用很多体外模型的一个主要限制在于缺乏不同生物学事件之间的相互影响，以及不同区室之间的相互影响。 但是，使用昆虫作为中间模型的一个主要优点在于这些模型满足需要不仅是脑屏障结构的不同成分之间的复杂的相互影响的需要，而且是出现在昆虫中的不同区室之间的复杂的相互影响的需要，因为昆虫是具有区室的活的物种，这在很大程度上类似于脊椎动物。脊椎动物血脑屏障(BBB)代表脑组织和血管之间的生理屏障，其限制从血液至脑的溶质交换并调节血液至脑的外源试剂(例如药物)的吸收。中枢神经系统(CNS)的功能需要高度调节的细胞外环境。在解剖学上，脊椎动物中的BBB由通过高度特化的紧密连接(tight junction, TJ)相互连接的微血管内皮细胞组成，其提供了扩散屏障，因此对于渗透具有关键作用。最近鉴定的TJ成分包括claudin，其为4个跨膜区的蛋白的家族，其被认为负责TJ的屏障功能(Turksen and Troy 2004)。BBB的渗透是开发成功的CNS药物的主要障碍之一。另一方面，当发生BBB渗透时，外周作用的药物可能带来不想要的副作用
3(Schinkel 1999)(综述见 Pardridge 2002)。BBB渗透通常分类为基于化学的渗透或基于生物学的渗透。基于化学的渗透与脂介导的被动扩散相关联，其依赖于分子的物理化学特性，即小的疏水性分子倾向于比大的亲水性的分子更容易通过BBB。基于生物学的渗透包括这样的化合物其为内源BBB流入或流出转运系统的底物，例如已经证明很多小分子(例如药物)是P-糖蛋白(P-gp)转运子的底物。P-gp是位于细胞壁的转运蛋白，其构成BBBGchinkel 1999)，并且它们在众多分类如原生动物、植物、昆虫和哺乳动物之间是保守的(见feiertner et. al. 1998)。Ρ-gp存在于很多细胞类型中，并且它们在药物吸收、处置、代谢和毒性中具有重要作用(Xia等人， 2006)。显而易见，在药物开发项目中理解BBB渗透具有关键意义，优选地，这应该不通过过量的体内研究而获得。因此，开发了数个体外BBB吸收模型以预测测试化合物的体内行为。但是，即使是包括P-gp转运子系统的复杂体外模型(Di and Kerns 2003, Summerf ield 等人，200 ，似乎也不能实现TJ的错综复杂性，因此可能无法很好地描述体内行为。在一项深入的BBB吸收研究中强烈证实了这一点，其中在10个不同的体外BBB吸收模型中测试了 22种化合物(Garberg 2005)。这10个模型中没有一个显示出体外和体内渗透性之间的任何关联。这表明特定的BBB模型不一定提供比非BBB衍生的模型更好的预测。此外，人们提出当要作出体内脑分布的预测时，蛋白结合、血流、代谢稳定性和亲脂性，以及BBB中的其它转运子的亲和性是需要考虑的因素。因此，似乎体外模型主要适合于定性测定通过被动扩散而通过BBB的化合物或通过P-gp转运子而流出的化合物(Garberg 2005)。一些无脊椎动物已经作为用于理解很多不同的生物学过程的有用的模型。尤其是果蝇，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)是研究得很透彻的模型研究生物，其对于理解遗传学、神经生物学、分子生物学等具有突出的贡献(Gullan and Cranston 2000)。一般而言，昆虫和脊椎动物具有很多共同的生理特征。它们是具有复杂的区室化神经系统以实现特化功能(例如视觉、嗅觉、学习和记忆)的多细胞生物。昆虫的神经系统以类似于脊椎动物的方式进行生理应答，它们具有很多相同的神经激素和受体。昆虫具有无血管的神经系统，其中血淋巴浸泡着神经节和神经的所有外表面。因此，很多昆虫需要复杂的BBB系统以保护它们的CNS抵抗源自植物的神经毒素并维持神经元的合适的离子微环境。事实上， 在昆虫中，复杂的BBB系统是进化上的优势。在昆虫中，该BBB主要是基于神经胶质细胞系统，在脊椎动物的脑中，其响应于微脉管系统的增加的重要性而转变为依赖于内皮系统。 支持该观点的是神经胶质系统在软骨鱼鱼类中的出现和神经胶质屏障在现代哺乳动物CNS 中的残留。因此，昆虫具有BBB，其为神经系统的包盖(ensheathment)中的重要成分。昆虫中的BBB是高度复杂的，但是在不同的昆虫目中具有结构上的差异。因此，具有含有复杂的整合成分的高度复杂的脑屏障(模拟脊椎动物的屏障)的昆虫将是研究多种分子通过该结构的渗透的优良模型。US2005013M25A1公开了一种转基因苍蝇，其表达人淀粉样-β前体蛋白(APP)的人Αβ 42肽的Italian突变体形式，还公开了一种双转基因苍蝇，其表达Tau蛋白和人淀粉样-β前体蛋白(APP)的人AM2ItaliaJ太。该转基因苍蝇提供了神经退行性病症例如阿尔茨海默病的模型。US2005013M25A1进一步公开了用于鉴定遗传调节剂的方法，以及使用转基因苍蝇来鉴定用于治疗神经退行性病症的治疗性化合物的筛选方法。
W004006854A2公开了一种用于在昆虫群体中筛选测试试剂的效应的方法，其包括以下步骤提供样本的群体，将至少一种测试试剂施用至所述群体，产生数字化影片以显示昆虫的运动，测定具有测试试剂的效应的群体的昆虫的至少一个性状。该文献还提供了制备用于治疗哺乳动物疾病的药物的方法。Marsh和Thompson (Marsh and Thompson 2006)教导昆虫是非常有用的模型系统，因为其具有简便性和迅速繁殖性。一些模型(果蝇)已经证明了它们在测试相关药物中的有效性，并揭示了在苍蝇和哺乳动物中针对例如亨廷顿病、帕金森病和阿尔茨海默病的药物功效的一致性。Marsh 和 Thompson (Marsh and Thompson 2004)提出可以在昆虫例如果蝇 (Drosophila)(果蝇)中真实地模拟人类中的显性神经退行性疾病，因为它们显示出这些疾病的主要特征，例如缓慢进行的退化、发作晚、异常蛋白聚集体的形成等。根据作者认为， 操作此等工程化生物的能力允许鉴定致病机理，并迅速测定潜在的药理学方案。作者提出，目前关于在苍蝇和小鼠中有效抑制病症的病理学处理的良好一致性提供了越来越大的信心无脊椎动物模型生物可以有效地加速鉴定那些可能在治疗哺乳动物疾病中有效的试剂。从上述文献中可知，现有技术主要涉及在苍蝇(果蝇)中测试用于治疗人类神经退行性疾病的化合物。但是，除了通常使用的体外测试方法以外，仍然需要鉴定合适的筛选模型以确定/评估药物的血脑屏障渗透。在这个意义上，应该想到，苍蝇具有被隔膜分开的连接而不是脊椎动物、蝗虫、蛾和蟑螂中的紧密连接。在药物开发以及在测试市场上的对于脑功能的效应知之甚少的那些化学品的CNS 毒性中迫切需要更复杂的筛选模型。因此，在药物开发中a)需要有效筛选旨在靶向CNS系统中的靶标的化合物。该筛选优选在具有完整 BBB功能的昆虫模型中进行，并且将促成阳性选择那些渗透BBB的化合物。此筛选包括多种适应症(例如疼痛、癫痫症、帕金森病、精神分裂症、阿尔茨海默病、睡眠失常、焦虑、抑郁症、饮食失调、药物滥用，包括抽烟)的低分子量化合物。b)需要有效筛选靶向CNS之外的功效并且当渗透CNS时可能诱导不可接受的副作用的化合物。c)需要在昆虫模型中有效筛选，所述昆虫模型的特征在于BBB功能的选择性变化。此类筛选包括疾病的低分子量至非常高的分子量的化合物或肽或大分子，所述疾病的特征在于BBB功能的破坏(例如，缺血性中风、创伤性脑损伤、药物滥用、神经退行性疾病， 例如帕金森病和阿尔茨海默病，癫痫症、感染、炎症样脑膜炎和MS、HIV)。还需要筛选上市的那些尚未就潜在的神经毒性进行归类或记录的化学化合物。
发明内容
本发明的总体内容是开发昆虫筛选模型以确定/评估不同化学化合物在脊椎动物例如哺乳动物优选人类中的血脑屏障渗透，以便改善早期药物开发过程中的化合物筛选程序/方法。相对于现有技术而言，该内容提供了很多优势，因为昆虫模型是比现有的体外模型更值得信赖的用于决策制定过程的工具，并且将加速药物筛选过程并降低晚期磨损率。此外，其将减少药物开发过程中杀死的哺乳动物的数目。本发明人令人惊奇地发现，选自蟑螂、蝗虫和蛾的昆虫中的血脑屏障(BBB)与哺乳动物的BBB之间的共同性比之前设想的更高。已经发现这些昆虫中的屏障系统由TJ 构成，而在苍蝇(例如果蝇)中，其由被隔膜分开的连接(SJ)构成(Banerjee and Baht 2007)。因此，本发明的昆虫可作为用于确定化学物质的BBB渗透的中间模型。因此，本发明能够第一次提供筛选用于神经适应症的化合物的合理策略，并且产生了简单的体内系统以测定化合物的脑渗透。本发明能够提供在由于神经病症而模拟BBB 功能障碍的昆虫模型中合理筛选化合物。药物开发是漫长且昂贵的过程，需要大量的化学和生物资源。在本发明中，深入开发了使用昆虫作为模型系统的可能性，以改进化合物选择过程并降低药物开发过程的成本。基于最近的发现，本发明人完全设想到本发明的昆虫模型提供比现有的体外模型更好的基础，以选择在脊椎动物进行测试的化合物。在一个方面，本发明提供了用于筛选测试试剂的BBB渗透的方法，所述方法包括以下步骤将测试试剂施用至选自蜚蠊目(Blattodea)、蝗总科(Acridoidea)、嫩目 (Cheleutoptera)、短角亚目(Brachycera)禾口鱼粦翅目(Lepidoptera)的昆虫；将所述昆虫温育0. 05小时至72小时的时间段；将所述昆虫的脑解剖下来；测定所述测试试剂在所述解剖下来的脑中的浓度。在本发明的优选的实施方式中，所述昆虫选自蝗总科(Acridoidea)(蝗虫)和蜚蠊目(蟑螂)。在本发明的另一个优选的实施方式中，将昆虫温育0.5小时至5小时的时间段，然后将所述昆虫的脑解剖下来，以定量所施用的测试化合物在脑中的浓度。优选在杀死昆虫之后立即进行脑的解剖。或者，从活昆虫解剖并移除其脑。优选地，将解剖下来的脑勻浆并最终裂解以获得反映脑的组成的勻质液体。将所述液体离心并储存上清液直至进行分析。可以通过液相色谱法进行液体的进一步分析，可以通过质谱法检测洗脱的化合物。在进一步的实施方式中，本发明提供了用于筛选在体内显示出想要的生物学活性但也对存在于脑、中枢神经系统和/或眼睛中的靶标显示出不想要的生物学活性的试剂的方法。因此，本发明的筛选方法可用于测定测试物质的生物学活性并测定/评估该测试物质穿过血脑屏障、尤其是人血脑屏障的能力或无此能力，例如，所述方法是通过测定该物质不被直接施用至脑、中枢神经系统或眼睛时，是否有任何显著程度的所述物质出现在这些组织中。在本发明的多个方面和实施方式中提供了以下权利要求中列出的主题。本发明一般适用于靶向多种疾病和病症的任何药物开发程序，具体而言是退行性病症，包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、具有运动神经元包涵体的疾病、Tau病、皮质基底退化；神经精神病症，包括抑郁双相障碍病(D印ression Bipolar disease)、精神分裂症、焦虑和攻击行为。此外，本发明适用于靶向外周靶标的药物开发程序，其中不能容忍CNS驱动的副作用，或筛选那些对于CNS功能的效应未知的化学化合物。因此，本发明同样适用于筛选显示出改变中枢神经系统、脑或眼睛的活性或功能的生物学效应的试剂，可以是正常的或由于疾病或病症；适用于筛选显示出作为疾病或病症的迹象或症状的改善的生物学效应的试剂。此外，本发明提供了作用于外周的药物和毒性试剂例如杀虫剂是否非故意性渗透BBB的可能性。使用根据本发明的任意方面或实施方式的筛选方法鉴定出具有想要的生物学活性的测试物质之后，可以将该测试物质配制成包含至少一种其它成分例如药学上可接受的介质、载体或赋形剂的组合物。发明详述本发明提供了用于筛选进入血流的化学物质的BBB渗透的新方法。一般而言，本发明对于高通量筛选在靶向多种疾病和病症的药物开发程序中开发的试剂中是特别有用的，具体而言是退行性病症，包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、具有运动神经元包涵体的疾病、Tau病、皮质基底退化；神经精神病症，包括抑郁双相障碍病、精神分裂症、焦虑和攻击行为。此外，本发明适用于靶向外周靶标的药物开发程序，其中不能容忍CNS驱动的副作用。此外，本发明适用于筛选在靶向饮食失调和睡眠失常等病症的药物开发程序中开发的试剂。本发明涉及但不限于使用选自下列目的昆虫(根据Djurens V3rld,Ed B. Hanstrom; Forlagshuset Norden AB,Maolmo, 1964 的分类法)
权利要求
1.确定测试试剂是否可以被运输跨过脊椎动物的血脑屏障(BBB)的方法，所述脊椎动物优选为哺乳动物，例如人，所述方法包括以下步骤 将测试试剂施用至具有BBB的昆虫； 温育所述昆虫； 将所述昆虫的脑解剖下来；和 测定所述测试试剂在脑中的浓度。
2.权利要求1的方法，其中所述昆虫选自蜚蠊目(Blattodea)、双翅目(Diptera)、 幢总科(Acridoidea)、嫩目(Cheleutoptera)、短角亚目(Brachycera)和鳞翅目 (Lepidoptera)。
3.权利要求1的方法，其中将昆虫温育0.5小时至5小时的时间段，然后将所述昆虫的脑解剖下来，以定量所施用的测试试剂在脑中的浓度。
4.权利要求1的方法，其中在杀死昆虫之后立即进行脑的解剖。
5.权利要求1的方法，其中所述测试试剂的浓度这样测定将解剖下来的脑勻浆，优选将勻浆物离心；并通过液相色谱法分析勻浆物中的测试试剂的浓度，可以通过质谱法检测洗脱的化合物。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其中通过肠胃外或经口施用测试物质。
7.根据前述权利要求任一项的方法，包括测定躯体脑中的测试物质浓度梯度，以定量测定BBB渗透。
8.根据前述权利要求任一项的方法，包括比较存在血脑屏障的情况下中枢神经系统中的具有想要的活性的测试试剂的相对功效。
9.根据权利要求7的方法，包括测定测试试剂是否被血脑屏障代谢。
10.选自蜚蠊目(Blattodea)、双翅目(Diptera)、蝗总科(Acridoidea)、嫩目 (Cheleutoptera)、短角亚目(Brachycera)和鳞翅目(L印idoptera)的昆虫在测定测试试剂是否被运输跨过脊椎动物的血脑屏障中的用途，其中所述脊椎动物优选为哺乳动物，例如人。
全文摘要
提供了旨在反映脊椎动物血脑屏障(BBB)渗透的昆虫模型。BBB渗透的研究在药物开发中具有极其重要的意义；成功的CNS药物需要通过BBB，而外周作用的药物可能由于BBB渗透而引起不想要的副作用。具体而言，本发明涉及昆虫在筛选对于脑或中枢神经系统具有生物学效应和/或对于脑或中枢神经系统的疾病或病症具有效应的物质中的用途。其还涉及此类昆虫在筛选具有想要的生物学活性并且不通过血脑屏障的物质中的用途。
文档编号G01N33/50GK102159945SQ200980136930
公开日2011年8月17日 申请日期2009年9月16日 优先权日2008年9月22日
发明者G·安德松, P·阿达尔尼尔森 申请人:恩托莫法玛有限责任公司