专利名称：一种恶性黑素瘤t细胞纳米抗体、其编码序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，特别涉及一种针对恶性黑素瘤T 细胞抗原表位多肽Martl多肽的纳米抗体。
背景技术：
恶性黑素瘤发病率不高，但是是一种表皮或粘膜的黑素细胞的恶性肿瘤，恶 性程度高，且易发生血行及淋巴转移，预后不良。据上海肿瘤医院的资料，本 病占皮肤恶性肿瘤的1 0 %，占全部肺瘤的1 - 2 %，近年来有增加趋势。治疗 措施手术切除，放射治疗，化学治疗(用于有转移者)和免疫疗法(如用卡介 苗、白介素II、 a-干扰素等作为辅助治疗)或综合以上四种方法结合治疗 《http:〃www.biox.cn/content/20050910/37264.htm》。国外近年在临床试用恶性黑 素瘤T细胞抗原表位多肽(gp100, Martl)的疫苗，其效果也还不能最终肯定。 纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结 合纳米粒子科学的概念，进行的抗体工程革命，而研发的最新和最小的抗体分子， 最初由比利时的科学家(Hamers, R)在骆驼血液中发现。普通的抗体蛋白由两 条重链与两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻 链，这些"重链抗体"能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，而且不像单链 抗体那样互相私连聚集成块。以该"重链抗体"为基础的纳米抗体不仅分子量 只有普通抗体的1/10,而且化学性质也更加灵活，能与酶的活性部位和细胞膜中 镶嵌的标志等特殊的或不暴露的抗原表位结合在一起，因而应用纳米抗体技术研 发新颖肿瘤治疗和斥全测试剂具有广阔的前景。
三
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种针对恶性黑素瘤T细胞抗原表位的纳米抗体，同
4时提供该纳米抗体的编码序列以及该纳米抗体在制备检测和治疗恶性黑素瘤的 药物组合物中的应用。
技术方案本发明的技术解决方案为即
在本发明的第一方面，提供了一种恶性黑素瘤T细胞纳米抗体V朋链，它 的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列
SEQ ID NO:ll所示的CDR1, SEQ ID NO:12所示的CDR2, SEQ ID NO:13 所示的CDR3;或
SEQ ID NO:14所示的CDR1, SEQ ID NO:15所示的CDR2, SEQ ID NO:16 所示的CDR3;或
SEQ ID NO: 17所示的CDR1 ， SEQ ID NO: 18所示的CDR2, SEQ ID NO: 19 所示的CDR3;或
SEQ ID NO:20所示的CDR1, SEQ ID NO:21所示的CDR2, SEQ ID NO:22 所示的CDR3;或
SEQ ID NO:23所示的CDR1, SEQ ID NO:24所示的CDR2, SEQ ID NO:25 所示的CDR3。
较佳地，所述的恶性黑素瘤T细胞纳米抗体VHH链具有SEQ ID NO: 1 、 2 、 3、 4或5所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种恶性黑素瘤T细胞纳米抗体，它针对恶 性黑素瘤T细胞抗原表位Marti多肽GAAGIGILIV,包括两条具有SEQ ID NO:l 、 2、 3、 4或5所示的氨基酸序列的VHH链。
在本发明的第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质 本发明所述的恶性黑素瘤T细胞纳米抗体VHH链或恶性黑素瘤T细胞纳米抗体， 较佳地，所述DNA分子具有选自下组的DNA序列SEQIDNO:6、 7、 8、 9或 10。
在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQIDNO:6、 7、 8、 9 或10所示的核苦酸序列，还包含与所述核苦酸序列操作性相连的表达调控序列。 在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，其含本发明所述的表达载体。 在本发明的第六方面，提供了本所述恶性黑素瘤T细胞纳米抗体用于检测
5恶性黑素瘤的用途。
本发明的最后一方面，提供了一种4全测和治疗恶性黑素瘤的药物组合物，其 含有药学上有效量的本发明所述的恶性黑素瘤T细胞纳米抗体以及药学上可接 受的载体。
有益效果
本发明针对恶性黑素瘤特异性的T细胞抗原表位多肽如Martl多肽一 GAAGIGILIV生物素化后，与亲和素磁珠结合，展示多肽的正确空间结构，以 此形式的抗原筛选非免疫纳米抗体基因库(駱驼重链抗体噬菌体展示基因库)， 而获得了针对恶性黑素瘤特异性的纳米抗体基因，将此基因与表达载体重组，构 建了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体;f朱。
四
图1是MT-弁1纳米抗体蛋白的质粒图； 图2是MT-#5纳米抗体蛋白的质粒图3是高压液相纯化MT-#1， MT-#2纳米抗体蛋白的SDS-聚丙烯凝胶电泳图， 从右至左各蛋白带分别为第1为蛋白分子量标准，从第2到10为MT-#1纳 米抗体高压液相纯化洗脱峰管28， 30, 32, 34， 36, 38, 40， 42, 44;第11到 15为MT-#5纳米抗体高压液相纯化洗脱峰管32, 34, 36， 38, 39,纳米抗体+白喉 内毒素B亚单位分子量约为29KD。
五具体实施例方式
本发明应用针对恶性黑素瘤特异性的T细胞抗原表位多肽Martl多肽一 GAAGIGILIV生物素化后，与亲和素磁珠结合，展示多肽的正确空间结构，以 此形式的抗原筛选非免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)， 而获得了针对恶性黑素瘤特异性的纳米抗体基因，将此基因与表达载体重组，构 建了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体林。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
6实施例1:
针对恶性黑素瘤特异性的T细胞抗原表位多肽Martl多肽一GAAGIGILIV 的纳米抗体筛选过程
(1)用生物素化的Martl多肽一GAAGIGILIV 20孩i克分别与亲和素^兹珠 (Product by Invitrogen company) 100微克在室温下结合2小时。同时用100微 升噬菌体(5x1011 tfu非免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)+100微克亲和 素磁珠+500微升的2%脱脂牛奶O.OIM磷酸盐緩冲液(PBS)， pH7.0,在室温下 作用2小时。(2)去掉(1 )中的生物素-亲和素^兹珠结合物的上清，加入经亲和 素》兹珠吸附过后的的噬菌体，在室温下结合2小时。(3)用0.05%吐温20 (T) PBS (PBST)和PBS各洗5次，以洗掉不结合的噬菌体。(4 )用TEA (triethylamine (7.18M))将与多肽特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠 杆菌TGl,产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。相同筛选过程重复3 4轮。
实施例2:
用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选多肽特异性单个阳性克隆 (1 )从上述经3~4轮筛选后含有噬菌体的细菌培养亚中，挑选单个菌落并 接种于96孔细菌培养板中，培养过夜，(2)将其含有噬菌体的上清液转移到经 亲和素预先包被并与生物素化的Martl多肽一GAAGIGILIV结合的ELISA板中， 在室温获37度放置1~2小时，(3)用PBST洗去未结合的噬菌体，(4)加入辣 根过氧化物酶标记的抗噬菌体抗体，作用1小时，(5)TMB显色，于ELISA仪 上，在450nm波长，读取吸收值(OD)。 (5)当样品孔OD值大于对照孔OD 值3倍以上，判为阳性克隆孔。(6) PCR扩增或纯化阳性孔的质粒并进行基因 测序。
依据各个克隆抹的基因序列，把CDR1, CDR2, CDR3序列相同的抹视为同一 克隆林，而其序列不同的林视为不同的克隆林。
实施例3:
特异性纳米抗体表达质粒的构建
PCR扩增所获得的特异性的纳米抗体基因，而获得带有限制性内切酶Bbsl
7和Apal位点PCR产物，用限制性内切酶Bbsl和Apal分别处理PCR产物和载 体(pSCTl质粒-来源于经j资饰的pSJF2质粒)，经连接重组，而获得能在大肠杆 菌中高效表达的质粒MT-#l~MT-#5。
实施例4:
纳米抗体蛋白在大肠杆菌中表达、纯化
(1 )将菌种接种在含氨基苄青霉素的LB培养板上，37度过夜，(2)挑选 单个菌落接种于20毫升的含氨基节青霉素的LB培养液中，37度，摇床培养过 夜，(3 )转种于1升含氨基千青霉素的LB培养液中，37度摇床培养，200转/ 分，培养到OD值达0.6 1.0时，加入IPTG,继续培养过夜。(4)离心，收菌， (5)加融菌酶裂解细菌，离心，收上清中可溶性纳米抗体蛋白。(6)经Ni十离 子亲和层析高压液相制备纯度可达90%以上的蛋白。MT-#1、 MT-弁5的每1升细 菌培养物蛋白得率分别为154.5和23毫克。序列表
<110>无锡胜博生物技术有P艮公司
<120> —种恶性黑素瘤T细胞纳米抗体、其编码序列及应用 <130> —种恶性黑素瘤T细胞纳米抗体、其编码序列及应用 <160> 25
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 骆駝
<400> 1
Glu Val Gin Leu Gin Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Asp 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val 35 40 45
Ala Ala lie Met Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
9Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95
Trp Ser Thr Asp Asp Tyr Gly Val Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Gin100 105 110
Val Thr Val Ser Ser115
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> 骆駝
<400> 2
Glu Gly Gin Leu Gin Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Asp15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Met Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser His20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Leu Gin His Pro Gly Lys Gly Ser Glu Phe Val35 40 45Ser Ala lie Asp Trp Asn Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Ala 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Arg Val Thr Phe Lys Met Arg Thr Ser Leu Arg Ser Thr Ser 100 105 110
Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 3
<211> 118
<212> PRT <213>骆驼
<400> 3
Asp Val Gin Leu Gin Ala Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Phe Gly Asn 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Val Asp Ala Tyr 20 25 30
11Ala lie Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val35 40 45
Ala Ala lie Asn Trp Asn Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Thr Gly Ser Val50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala lie Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn lie Val Asn65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Ala Asp Val Trp Gly Leu Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser115
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> 骆駝
<400> 4
Asp Val Gin Leu Gin Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Gly Phe Gly Ser Tyr 20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45
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Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Asp Lys Lys Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Thr Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys 85 90 95
Ala Leu Asp lie Thr Thr Ala Ala Ser Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 5 <211> 124 <212> PRT <213>骆驼<400> 5
Glu Val Gin Leu Gin Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
His Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val 35 40 45
Ala Ala lie Ser Gly Ser Gly Val Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ala Val Arg Ser Leu Tyr lie Thr Thr Ala Gin Ala Glu Tyr Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120<210> 6
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaggtgcagc tgcaggcgtc tgggggagga ttggtgcagg ctggggactc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt acctataaca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg accgtgagtt tgtagcagct attatgtgga gtggtggtag cacatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccaaagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt atttctgttg gagtaccgac 300
gattatggcg tggactcctg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc a 351
<210> 7
<211> 381
<212> DNA <213>人工序列
<400> 7
gagggtcagc tgcaggcgtc tgggggagga ttggtgcagg ctggggactc tctgagactc 60
tcctgtgtaa tgtctggacg caccgtcagt agtcatgcca tgggctggtt cctccagcat 120
ccagggaagg ggagtgagtt tgtgtcagcc attgactgga atggaaatag Ucatactat 180
tcagactccg cgaagggccg gttcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtatat 240ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agcacgagtc 300
acgtttaaaa tgcgtacgtc tttaaggtct acttcgggat atgactactg gggtcagggg 360
acccaggtca ccgtctcctc a
381
<210> 8
<211> 354
<212> DNA <213>人工序列
<400> 8
gatgtgcagc tgcaggcgtc tgggggagga gtggtgcagt ttgggaactc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggacc caccgtcgat gcgtatgcca ttggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaatt tgtggcagct atcaattgga atggtgcaag tacatactat 180
acagggtccg tgaggggccg attcgccatc tccagagaca atcccaaaaa tatcgtaaac 240
ctgcaaatga acagcctgac ctcagacgat tcaggcgtct actattgtgc agcagacgtt 300
tggggcctgg ggUcgacta ctggggtcag gggacccagg tcaccgtctc ctca 354
<210> 9 <211> 351
<212> DNA <213> 人工序列
<400> 9
gatgtgcagc tgcaggcgtc tgggggaggc ttggtgcagc ctgggggttc tctgagactc 60
16tcctgtgtag catctggatt cggcttcggg agtutgaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggcccgagtg ggtctcagcg attaatagcg gtggtgacac atactatgcg 180
gcctccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg acaagaaaac ggtgtatctg 240
caaacgacca gcctgaaacc tgaggatacg gccgtctatt actgUaagc tttggacatt 300
actactgcag catcctactg gggccagggg acccaggtca ccgtctcctc a
accgtctcct ca
351
<210> 10
<211> 372
<212> DM
<213> 人工序列
<400> 10
gatgtccagc tgcaggcgtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcat tctctggacg caccttcagt agctatcaca tgggctggtt ccgccaggct 120
gacgggaagg agcgtgagtt tgtggcggct attagcggga gtggtgtcta cacatattat 180
gcagagtccg tgaagggccg attcaccatc tccaaagaca acgccaagaa cacggggtat 240
ctgcaaatgg acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agcagtacgg 300
agtctttata ttactacggc tcaggccgag tatgactact ggggccaggg gacccaggtc 360
372
<210> 11 <211> 5<212> PRT <213> 人工序列
<400> 11
Ser Thr Tyr Asn Met 1 5
<210> 12
<211> 16
<212〉 PRT
<213> 人工序列
<400> 12
lie Met Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 15 10 15
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Thr Asp Asp Tyr Gly Val Asp Ser 1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
18<213> 人工序列 <400> 14
Ser Ser His Ala Met 1 5
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
lie Asp Trp Asn Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Ala Lys Gly 15 10 15
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Val Thr Phe Lys Met Arg Thr Ser Leu Arg Ser Thr Ser Gly Tyr Asp 15 10 15
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
19<400> 17
Asp Ala Tyr Ala lie 1 5
<210> 18
<211> 16
<212> PRT <213>人工序列
<400> 18
lie Asn Trp Asn Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Thr Gly Ser Val Arg Gly 15 10 15
<210> 19
<211> 8
<212> PRT <213>人工序列
<400> 19
Asp Val Trp Gly Leu Gly Tyr Asp 1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列<400> 20
Ser Tyr Asp Met Ser 1 5
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
lie Asn Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly 15 10 15
<210> 22
<211> 8
<212> PRT <213>人工序列
<400> 22
Leu Asp lie Thr Thr Ala Ala Ser 1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT <213>人工序列
<400> 23
21Ser Tyr His Met Gly 1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
lie Ser Gly Ser Gly Val Tyr Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly 15 10 15
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Val Arg Ser Leu Tyr lie Thr Thr Ala Gin Ala Glu Tyr Asp 1 5 10
2权利要求
1.一种恶性黑素瘤T细胞纳米抗体VHH链，其特征在于它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO11所示的CDR1，SEQ ID NO12所示的CDR2，SEQ ID NO13所示的CDR3；或SEQ ID NO14所示的CDR1，SEQ ID NO15所示的CDR2，SEQ ID NO16所示的CDR3；或SEQ ID NO17所示的CDR1，SEQ ID NO18所示的CDR2，SEQ ID NO19所示的CDR3；或SEQ ID NO20所示的CDR1，SEQ ID NO21所示的CDR2，SEQ ID NO22所示的CDR3；或SEQ ID NO23所示的CDR1，SEQ ID NO24所示的CDR2，SEQ ID NO25所示的CDR3。
2. 根据权利要求1所述的恶性黑素瘤T细胞纳米抗体VHH链，其特征在于它具有SEQIDNO:l、 2、 3、 4或5所示的氨基酸序列。
3. —种恶性黑素瘤T细胞纳米抗体，其特征在于，它针对恶性黑素瘤T细胞抗原表位Marti多肽GAAGIGILIV,包括两条具有SEQ IDNO:l、 2、 3、 4或5所示的氨基酸序列的VHH链。
4. 一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质权利要求1或2所述的恶性黑素瘤纳米抗体Vfffl链，或权利要求3所述的恶性黑素瘤纳米抗体。
5. 如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列SEQIDNO:6、 7、 8、 9或10。
6. —种表达载体，其特征在于，它含SEQIDNO:6、 7、 8、 9或10所示的核苷酸序列。
7. 如权利要求1所述的表达载体，它还包含与所述核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。
8. —种宿主细胞，其特征在于含有权利要求7所述的表达载体。，SEQ ID NO: 13,SEQIDNO:16，SEQIDNO:19,SEQIDNO:22，SEQIDNO:25
9. 权利要求3所述恶性黑素瘤T细胞纳米抗体用于检测恶性黑素瘤的用途。
10. —种检测和治疗恶性黑素瘤的药物组合物，其特征在于，含有药学上有效量的权利要求3所述恶性黑素瘤T细胞纳米抗体以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及针对恶性黑素瘤T细胞抗原表位多肽Mart1的纳米抗体，本发明还公开了同时提供该纳米抗体的编码序列，表达或能够表达所述纳米抗体的宿主细胞，该纳米抗体能在大肠杆菌中高效表达，能应用于制备检测和治疗恶性黑素瘤的药物组合物。
文档编号G01N33/577GK101550191SQ20091002780
公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月15日 优先权日2009年5月15日
发明者王大升 申请人:无锡胜博生物技术有限公司