A特异结合的■菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1，37°C培养lh，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3_4轮，逐步得到富集。
[0018]实施例3
本实施例用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆，步骤如下:
(I)从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100ug/ml的氨苄青霉素的TB培养基中，生长到对数期后，加终浓度ImM的IPTG，28°C培养过夜。
[0019](2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，室温下放置I小时；
(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入mouseant1-His antibody (鼠抗HIS抗体，R&Dsystem)，室温下放置I小时；
(4)用PBST 洗去未结合的抗体，加入 ant1-mouse alkaline phosphataseconjugate (羊抗鼠AP标记抗体，sigma)。
[0020](5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，在酶标仪上405nm波长读取吸收值。
[0021](6)当样品孔OD值大于对照孔OD值2.1倍以上时，判断为阳性克隆孔。
[0022](7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100ug/ml的氨苄青霉素的TB培养基，提取质粒进行测序。
[0023]根据测序结果，应用Vector NTI? 11.5( Invitrogen, USA)和IMGT?软件分析各个克隆株，把CDR1、CDR2和CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的视为不同克隆株。所筛选建立的特异性SEA纳米抗体的VHH链的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示。VHH链的氨基酸序列，由框架区FR和互补决定区⑶R组成，所述框架区FR包括SEQ ID NO:1所示的FRl，SEQ ID NO:3所示的FR2，SEQ ID NO:5所示的FR3，SEQ ID NO:7所示的FR4 ;所述互补决定区CDR包括SEQ ID NO:2所示的CDRl，SEQ ID NO:4 所示的 CDR2，SEQ ID NO:6 所示的 CDR3。其中，FRl ?FR4 和 CDRl ?CDR3的序列如下所示:
FRl:QVQLQESGGGLVQAGASLRLSCATSA ；
CDRl:RTFNSYSMKffFR ；
FR2:QAPGKEREFVARISRSG ；
CDR2:GTTYYADSVK ；
FR3:GRFTISRDTAKSVVYLQMNSLKPEDTAIYY ；CDR3:CAAAIFDVTDY ；
FR4:ERADYWGQGTQVTVSS ；
基于VHH链的核苷酸序列和氨基酸序列，还可以得到以下产物:
一种SEA纳米抗体，它针对SEA表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的VHH链。
[0024]一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质:上述的针对SEA的纳米抗体的VHH链，或上述的SEA纳米抗体。
[0025]一种表达载体，它含有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0026]一种宿主细胞，它可以表达SEA纳米抗体。
[0027]实施例4
应用筛选得到的特异性SEA纳米抗体进行酶联免疫检测，步骤如下:
为检测所筛选得到的特异性SEA纳米抗体是否能识别SEA抗原，将SEA抗原(2 μ g/mL)加入96孔酶标板，100 μ L/孔，4° C过夜；用PBST洗板3次，后用3%milk封闭酶标板，37° C作用lh，用PBST洗板3次，加入不同稀释浓度的SEA纳米抗体，37° C作用2h;PBST洗板3次后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗His单克隆抗体(AbD Serotec, UK)作用Ih ；PBST洗板3次后，加入TMB底物液后检测，并用构建的锥虫特异性VSG纳米抗体作为阴性对照。
[0028]如图3显示，SEA纳米抗体可以特异性识别SEA，而阴性对照锥虫VSG纳米抗体则与SEA无反应，说明本发明提出的SEA纳米抗体可进一步开发检测SEA的试剂。
[0029]以上所述仅是本发明的优选实施方式，在不脱离本发明原理的前提下，还可对本发明做出改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种针对SEA的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区⑶R，其特征在于，所述框架区FR包括FRl?FR4的氨基酸序列:其中，FRl的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述互补决定区⑶R包括⑶Rl?⑶R3的氨基酸序列:CDR1的氨基酸序列SEQ ID NO:2所示，CDR2的氨基酸序列SEQ ID NO:4所示，CDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的VHH链，其特征在于，它具有SEQID NO:9所示的氨基酸序列。
3.一种SEA纳米抗体，其特征在于，它针对SEA表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ IDNO:9所示氨基酸序列的VHH链。
4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质:权利要求1或2所述的SEA纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的SEA纳米抗体。
5.—种表达载体，其特征在于，它含有SEQID NO:8所示的核苷酸序列。
6.一种宿主细胞，其特征在于，它能表达权利要求3所述的SEA纳米抗体。
7.—种权利要求3所述的SEA纳米抗体在制备SEA检测试剂方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了针对于血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）表位的纳米抗体，同时还公开了编码该纳米抗体的基因序列以及表达该纳米抗体的宿主细胞。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于血吸虫检测试剂的研发。
【IPC分类】C07K16-18, G01N33-68, C12N15-13
【公开号】CN104650224
【申请号】CN201410795870
【发明人】陈睿, 斯蒂芬 马格斯, 陆绍红, 孔庆明, 童群波, 郑斌, 楼涤, 丁建祖
【申请人】浙江省医学科学院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年12月22日