专利名称：日本血吸虫压电质量免疫传感器的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫传感器的制备及应用，具体涉及一种日本血吸虫分子诊断抗原压电质量免疫传感器的制备及其在免疫分析上的应用。
背景技术：
血吸虫病的免疫诊断一直是血吸虫病防治研究中的重点之一。快速、简便和有效地早期诊断病人病畜，能及时控制传染源，从而达到传播阻断的目的。
现有的免疫诊断方法大多是采用混合复杂的血吸虫抗原来检测病人血清中相应抗体。其中常用的日本血吸虫病免疫诊断方法有酶联免疫吸附实验(ELIAS)、间接血凝实验(IHA)、环卵沉淀反应(COPT)和免疫金银染色法(IGSS)等，这些方法基本上能满足血吸虫病现场诊断的要求，但都具有操作步骤多、检测时间长、难以准确定量病人血清抗体水平和区分病程病期等缺点。为了克服以上方法的不足，长期以来人们一直试图寻找新的诊断技术来代替现有的诊断方法。压电免疫传感器诊断法是近年出现的一种新方法。
压电现象是Curies于1980年发现的，其理论基础是非均质的天然晶体(无对称中心)中产生的电偶极受到机械压力的作用，便会在9-14MHz的频率之间来回振动，有20余种常见的天然压电晶体，包括石英(SiO2)，铌酸锂(LiNbO3)，氧化锌(ZnO)，砷化镓(GaAs)，硫化镉(CdS)，钽酸锂(LiTaO3)等。其中石英是使用最多的一种压电材料，因为它在水溶液中具有化学性质稳定、耐高温、不易丢失压电的特性。
压电免疫传感器是最常见的一种质量测量式免疫传感器，它的原理是石英晶片在振荡电路中振荡时有个基础频率，当样品中的抗原或抗体与包被在晶片上的抗体或抗原结合时，由于负载的增加，晶片的振荡频率会相应减少，其减少值与吸附上去的质量有相关性。这种相关性可用Sauerbrey方程表示ΔF＝-KF2ΔM/A，式中ΔF为晶体吸附外来物质后振动频率的变化(Hz)，K为常数，等于2.26×10-6，ΔM为晶片的质量变化值(g)，A为有效压电面积(cm2)，F为晶片的基础频率(Hz)。
1972年Sonhs等人首先在石英晶体表面涂覆一层塑料薄膜以吸附蛋白质，成功制备了用于测定牛血清白蛋白抗体的压电晶体免疫传感器，从而使压电现象用于免疫测试的构想成为现实。开始阶段该类传感器大多只限于气相测定，即晶片在样品缓冲液中与待测物反应后，还需取出干燥后才能测定频率变化，这样可使晶片起振较容易，避免非特异性吸附对结果的影响，取得了较好的线性关系，但这增加了操作时间，且干燥过程对蛋白质的活性有较大影响，会大大缩短传感器的使用寿命。为了避免干燥过程带来的不利影响，最好的解决办法就是在液相中直接检测晶体表面的质量变化，这样不但克服了上述缺点，还使实时监测抗原抗体反应成为可能。然而由于液相中阻尼较大，晶体不易产生压电谐振，所以尽管早在70年代就有人提出了把低频率振动晶体用于液相的构想，但直到1991年Nomura才通过电解质溶液施加交变电场，使无极晶片在液相中振荡成功。此后有学者认为液相中传感器的响应与界面自由能及界面粘度有关，频率变化值往往比Sauerbrey方程得到的期望值要大，而且液体的性质如粘度和密度对压电晶体的谐振频率有较难克服的影响。
我们通过试验得出结论在液相压电免疫传感器中约有90％的频率变化由吸附所致，仅10％左右的响应由溶液的粘度、密度等性质变化产生，且如此小的比例不会对结果产生较大影响。用液相压电免疫传感器检测日本血吸虫抗体，取得了良好效果。
发明内容
为了弥补目前常规免疫检测方法不能进行定量检测的缺点，我们将日本血吸虫成虫31/32kDa这一优势诊断抗原与压电免疫传感技术相结合，建立了一种能定量、简便、快速准确的诊断血吸虫病的压电免疫传感器。
本发明中，我们采用超凝胶柱层析法纯化得到日本血吸虫成虫31/32kDa抗原，采用直接固定抗原法，将含多个羟基的甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)共聚物涂层，把血吸虫优势诊断抗原分子31/32kDa共价结合固定于石英晶体表面，制作成压电质量免疫传感器。将使用后的石英晶体置四氢呋喃(THF)中浸泡，THF能将抗原抗体复合物解离并从传感表面全部清洗下来，做到了不损害固相抗原或抗体的活性。我们还观察了不同抗原浓度、检测时间及其频移值的变化，并对样品进行重复检测比较。
基于纯化分子抗原建立的压电免疫传感器的主要优势在于1)装置简单且易于操作2)实现了抗体定量检测，弥补了目前常规免疫检测方法不能进行定量测定的缺点。
3)能进行实时监测抗原抗体反应，不需分离步骤，即在抗原抗体反应的同时就把反应信号动态而连续地记录下来，有利于抗原抗体反应的动力学分析。
4)相对于其他传感器的优势在于因抗原与抗体的结合具有很高的特异性，从而减少了非特异性干扰，提高了检测的准确性
图1不同抗原浓度固定的效果A)抗原固定后产生的频移值B)抗原抗体反应后的频移值图2抗体浓度为72mg/ml时响应时间与频移值的关系具体实施方式
实施例一日本血吸虫压电质量免疫传感器的制备。
1.仪器材料1.1主要仪器CN3165型高分辨计数器(石家庄无线电器厂)；石英晶振JA5型AT切割，9MHz、两面镀银电极，直径4mm晶片，直径8mm电极，振荡电路为本室自制TTL电路。
1.2实验材料日本血吸虫成虫31/32kDa分子抗原的浓度为1mg/ml。
2方法2.1抗原制备取健康成年家兔，体重2.0-2.5千克，每兔感染1500-2000条日本血吸虫尾蚴，45天后剖杀，灌注法收集成虫，生理盐水漂洗，冻干后置0.2M、pH4.9的枸橼酸缓冲液中匀浆，4℃下14500rpm、30min，得成虫粗提液。
取适量ACA54凝胶(LKB、瑞典)，用0.2M、pH4.9枸橼酸缓冲液浸泡洗涕3次，装柱(1.6×50cm)用上述洗脱液平衡、洗脱，控制流速为20ml/h，待平衡后上样，按每管2ml收集，采用2238型紫外检测仪以A280示踪，自动部分收集，记录描图，采用常规ELISA法测定各管活性。将柱层析后各活性部分收集，超滤浓缩10倍，然后置10mM枸橼酸缓冲液(pH4.9)中，4℃透析18-24h，经离心沉淀，溶解等步骤纯化抗原，采用G752型紫外分光光度计测定蛋白浓度。
2.2抗原包被先将压电石英晶振在四氢呋喃(THF)中浸泡，于空气中晾干，然后在含有甲基丙烯酸羟乙酯(HJEMA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)共聚物的四氢呋喃溶液中浸渍，这样在晶体表面涂覆上一层均匀的聚合物薄膜，于空气中晾干后的石英晶体经CNBr活化处理后，置于0.5mg/ml的日本血吸虫31/32kDa抗原包被液中，37℃恒温1h，以PBS洗涤3次，蒸馏水洗涤3次，吹干。最后置于pH2.4、0.1mol/L甘氨酸溶液中，37℃温育40min，以PBS洗涤3次，蒸馏水洗涤3次，吹干。
3结果3.1抗原纯化粗提成虫可溶性抗原经ACA54柱层析后，可见到4个蛋白峰，ELISA测定2-3峰之间31/32kD活性最高，收集对应管内洗脱液透析后冻干，751G型分光光度计测得冻干后蛋白浓度为1mg/ml。-20℃保存备用。实施例二日本血吸虫压电质量免疫传感器的测定与条件优化。
1.试验材料日本血吸虫IgG抗体采用亲和柱层析纯化，IgG浓度为1.8mg/ml；日本血吸虫不同感染度兔血清感染500、1000、2000、3000条日本血吸虫尾蚴后45天后采集。
2方法2.1抗体制备采用亲和柱层析法纯化IgG抗体并测定其浓度，具体步骤如下(1)采用40％的(NH4)2SO4沉淀兔血清(经成虫31/32kD分子抗原免疫)，测得IgG浓度为1.8mg/ml。
(2)称取1.5g琼脂糖于0.01M Na3PO4(含0.15M NaCl)的缓冲液中溶胀，装柱(1.0×15cm)，用上述缓冲液洗脱平衡。
(3)取35mg沉淀后IgG上样，于4℃下开始洗脱，先用pH7.4的PBS洗脱，洗脱体积为60-70ml，然后以0-3M的NaSCN进行梯度洗脱，洗脱体积为300ml。
(4)pH8.0的PBS洗脱60-70ml→pH7.4的PBS洗脱50ml→pH7.4的PBS(含0.5M的NaSCN)洗脱50ml→pH7.4的PBS的1M的NaSCN洗脱50ml。
(5)0.01M的硼酸钠(含0.15M NaCl)pH9.0洗脱50ml。
(6)采用G752型紫外分光光度计测定蛋白浓度。
2.2测定与再生将上述包被31/32kDa分子抗原的石英晶体置干燥容器中，待谐振频率稳定后，测频率值F1。然后将石英晶振置于不同稀释度的日本血吸虫感染兔血清溶液中，37℃温育、然后同前洗涤吹干。最后于干燥容器中测得频率F2，得频移值ΔF，利用公式ΔF＝-KF2ΔM/A(Sauerbrey方程)就可以计算出晶片的质量变化值ΔM，从而实现定量检测。使用后的石英晶体置THF中浸泡10min，溶解晶体表面共聚物涂层，使之再生。
2.3抗原包被浓度影响实验以pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释配制不同浓度的血吸虫31/32kDa分子抗原包被石英晶体，测其频移值，然后将包被于不同浓度抗原的石英晶体置于1∶10磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)稀释的血吸虫感染兔血清中，测其频移值。
2.4抗原抗体结合时间实验在同样条件下，用0.5mg/ml分子抗原包被压电石英晶体置于1∶25稀释的感染兔血清中，37℃孵育不同时间，测量免疫反应前后石英晶体的谐振频率变化。
2.5血清样品检测实验取同一条件下制备的4个0.5mg/ml 31/32kDa分子抗原包被的压电膜晶体，分别测试4份感染程度不同的兔血清。
3结果3.1抗体纯化收集日本血吸虫IgG抗体活性峰，测得其浓度为1.8mg/ml。
3.2抗原包被浓度的影响随抗原浓度增大频移值逐渐增大(图1)。抗原浓度较小时，结合到晶体表面的抗体随抗原浓度增大而增多，当抗原浓度＞0.75mg/ml时，晶体表面抗体量增大的趋势减缓，频移值趋于稳定。所以最佳抗原包被浓度确定为0.50mg/ml。
3.3抗原抗体结合时间的影响抗原抗体反应30min后，频移值迅速增大，60min时趋于稳定(图2)。所以最佳抗原抗体结合时间确定为60min。
3.4血清样品检测结果显示，随着感染程度的增强，频移值有明显上升趋势，感染度为500条时，ΔF(Hz)为71Hz，感染度为1000、2000和3000条尾蚴时，其频移值变化数分别为97、142和202Hz。另外，将同一条件下包被抗原的5个石英晶体测量同份稀释度血清，有较好的重现性，其频移值分别为147、143、138、160和150Hz。
权利要求
1.一种压电质量免疫传感器的制备方法，其特征在于制备步骤为(1)抗原制备日本血吸虫感染家兔后45天剖杀动物，灌注法收集成虫，冻干后置缓冲液中匀浆，4℃下14500rpm离心30min，以ACA54凝胶柱层析分离纯化得日本血吸虫成虫31/32kDa抗原，(2)晶体表面预处理先将压电石英晶振在四氢呋喃(THF)中浸泡，于空气中晾干后在含有甲基丙烯酸羟乙酯(HJEMA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)共聚物的四氢呋喃溶液中浸渍，这样在晶体表面涂覆上一层均匀的聚合物薄膜，(3)抗原包被于空气中晾干后的石英晶体经CNBr活化处理后，置于抗原包被液中，37℃恒温1h，以PBS洗涤3次，蒸馏水洗涤3次，吹干。最后置于pH2.4、0.1mol/L甘氨酸溶液中，37℃温育40min，洗涤方法同上，吹干。
2.根据权利要求1所述的压电质量免疫传感器的制备方法，其中(1)所述的酸缓冲液为0.2mol/L、pH4.9的枸橼酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的压电质量免疫传感器的制备方法，其中(3)所述的包被抗原浓度为0.50mg/ml。
4.根据权利要求1所述的压电质量免疫传感器的制备方法，其中(3)所述的包被抗原为日本血吸虫31/32kDa分子抗原。
5.根据权利要求1所述的压电质量免疫传感器的再生方法，其特征在于将使用后的石英晶体置THF中浸泡10min，溶解晶体表面共聚物涂层使之再生。
6.一种利用权利要求1所述的压电质量免疫传感器测定抗体的方法，其特征在于(1)测量方法为将上述包被31/32kDa分子抗原的石英晶体置干燥容器中，待谐振频率稳定后，测频率值F1。然后将石英晶振置于不同稀释度的日本血吸虫感染兔血清溶液中，37℃温育、然后同前洗涤吹干。最后于干燥容器中测得频率F2，得频移值ΔF，利用公式ΔF＝-KF2ΔM/A(Sauerbrey方程)就可以计算出晶片的质量变化值ΔM，从而实现定量检测，(2)采用的抗体为日本血吸虫IgG抗体，其浓度为1.8mg/ml，(3)使用时抗原抗体结合时间为60min。
全文摘要
一种日本血吸虫压电质量免疫传感器，采用直接固定抗原法，将血吸虫优势诊断抗原分子31/32kDa共价结合于石英晶体表面，使用后的石英晶体置四氢呋喃(THF)中浸泡，THF能将抗原抗体复合物解离并从传感表面清洗下来，做到了不损害固相抗原的活性。我们观察了不同抗原浓度、检测时间及其频移值的变化，并对样品进行重复检测比较。集生物学、物理学、化学及医学为一体的压电质量免疫传感器装置简单，易于操作，对阳性血清样品不仅具有较高的识别能力，还能定量测定血清样本中的抗体水平，为一种理想的血吸虫病临床诊断仪器。
文档编号G01N5/02GK1811444SQ20061003119
公开日2006年8月2日 申请日期2006年1月25日 优先权日2006年1月25日
发明者汪世平, 吴朝阳, 沈国励, 温志立, 周松华, 俞汝勤 申请人:汪世平