专利名称：一种鉴别日本血吸虫的引物、相应的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及检验检测领域，具体涉及一种鉴别日本血吸虫的引物、相应的试剂盒及检测方法。
背景技术：
日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的人兽共患性寄生虫病，呈世界性分布，造 成了很大的经济损失，具有重要的公共卫生和社会经济意义。在我国，该病主要流行于 长江流域及其以南的地区，除上海、浙江、福建、广西和广东省达到血吸虫病阻断标准 夕卜，江苏、安徽、江西、湖北、湖南、云南和四川7个省份仍较为严重。据统计，受此 病威胁人口达6000万，其中仅慢性病人就达80多万。2004年，我国将血吸虫病与结核 病、艾滋病一起列为最重要的三大人类传染病。近年来，全球气候变暖、泥石流及洪水 频繁爆发以及实施南水北调工程所引起的水位、气候、植被及微生物等生态环境要素变 化对血吸虫唯一中间宿主钉螺的分布产生了重大影响，使得疫情有所扩散及回升趋势， 给血吸虫病防治工作带来新的严峻挑战。大量研究表明中国大陆日本血吸虫的种群遗传结构与时空分布有密切关系。由 于自然环境长期阻隔，其种群关系大体分为山区(四川和云南)和湖沼(安徽、江西、 湖北、浙江和湖南)两个地域类型。由于气候、环境及中间宿主分布的变化，山区型 和湖区型日本血吸虫的基因交流频率逐渐增加，使得不同地区分离株的变异呈现不规律 性。因而，准确有效的鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫，建立相应的基因信息库并依此 建立我国日本血吸虫溯源检测方法，将为开展血吸虫病的分子流行病学研究和诊断，以 及新发、输入或变异病原体的发生发展规律研究提供重要的理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的引物。本发明另一目的在于提供一种含有上述鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的引物 的检测试剂盒。本发明还有一个目的在于提供一种鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的检测方法。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
本发明通过对来自于不同流行区的日本血吸虫分离株进行线粒体全基因组序列测定 及初步比对分析，发现了线粒体基因组序列中存在一个微卫星(SSR)区域能够用于山 区型和湖沼型日本血吸虫的鉴别。进一步通过对不同地区虫株的大量重测序证明了该特 异SSR位点的存在，其中山区型日本血吸虫比湖沼型日本血吸虫多一个(AG)重复。一种用于鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的引物，其上游引物核苷酸序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。一种包含上述用于鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的引物的试剂盒。
上述试剂盒中，包含如下组分
(1)DNA裂解液核裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液的混合溶液；
(2)PCR反应液dATP、dTTP、dGTP、dCTP、上游引物、下游引物和MgCl2W
混合溶液；
(3)山区型日本血吸虫DNA对照和湖沼型日本血吸虫对照。作为一种优选方案，上述试剂盒中，还可以添加沿V DNA聚合酶。作为一种优选方案，上述试剂盒中，各组分的量如下所示
(1)DNA裂解液，27.5mL:为100个反应的200 μ L核裂解液、50 μ 1 ρΗ 8.0的 0.5mol/L的EDTA、20μ1蛋白酶K禾口 5yL RNase A溶液的混合溶液；
(2)PCR 反应液，2.5mL:为终浓度 200|_miol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP, 终浓度0.25pmol/ μ L的上游引物和下游引物，2mmol/L的MgCl2的混合溶液；
(3)山区型日本血吸虫DNA对照ΙΟΟμ 和湖沼型日本血吸虫DNA对照ΙΟΟμ ； (5) Taq DNA 聚合酶，5U/VL，25μ 。本发明试剂盒的使用方法包括如下步骤
(1)日本血吸虫DNA的提取；
(2)PCR扩增按照扩增样品数取PCR反应液、沿^酶混合，混勻，分装；将山区 型、湖沼型对照液分别加入一个管中，取各样品的DNA加入对应反应管中；离心混勻， 置于PCR扩增仪上反应；
(3)PCR产物观察将扩增后的PCR产物加样于加样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，电泳后置于胶片观察灯上观察结果并拍照分析；
作为一种优选方案，步骤(2)所述沿^酶按每个PCR反应含1.25U加入。作为一种优选方案，步骤(2)所述PCR扩增条件为94°C预变性5min; 94°C 变性 30sec、56°C退火 30sec、72°C延伸 30sec，35 个循环；72°C后延伸 lOmin。作为一种优选方案，步骤(3)所述6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为90V电 压电泳3h。本发明试剂盒PCR反应条件的优化过程为
通过对镁离子浓度和退火温度的调节来对PCR条件进行优化。Mg2+浓度梯度在 l.OmM至3.0mM之间、退火温度在48°C至58°C之间进行调整，以取得用PCR扩增的最佳 Mg2+浓度和最佳退火温度。经试验确定，最佳退火温度为56°C; MgCl2W浓度为2mM; 循环数选择为35个循环。本发明鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的检测方法包括如下步骤
(1)日本血吸虫DNA提取；
(2)用权利要求1所述特异性检测引物进行PCR扩增；
(3)扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析，条带位置与山区型DNA对 照相一致者为山区型日本血吸虫，条带位置与湖沼型DNA对照相一致者为湖沼型日本血 吸虫；
(4)PCR扩增条件为94°C预变性5min ； 94°C变性30sec、56°C退火30 sec、72°C延 伸30 sec, 35个循环；72°C后延伸10 min。(5) 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为90V电压电泳3h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
(1)本发明通过对 来自于不同流行区的日本血吸虫分离株进行线粒体全基因组序列 测定及比对分析，发现山区型日本血吸虫的线粒体基因序列比湖沼型日本血吸虫多一个
(AG)重复，可用于两种地域型的鉴定。本申请人根据此差异设计鉴别山区型和湖沼型 日本血吸虫的特异引物及PCR和聚丙烯酰胺凝胶检测体系，建立了用于鉴别山区型和湖 沼型日本血吸虫的快速、特异、敏感的检测方法；
(2)本发明通过优化反应体系和反应条件，研制出一种鉴别山区型和湖沼型日本 血吸虫的PCR试剂盒，试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客 观，适用于日本血吸虫地理型鉴定与溯源检测等临床及科研用途。
图1为山区、湖沼型日本血吸虫鉴别PCR特异性电泳图谱，其中，M为DL2000 marker ； 1 7分别为日本血吸虫，曼氏血吸虫，埃及血吸虫，肝片吸虫，大片吸虫， 华支睾吸虫和麝猫后睾吸虫；8为阴性对照。图2为山区、湖沼型日本血吸虫鉴别PCR敏感性电泳图谱，其中，M为DL2000 marker ； 1 10为日本血吸虫成虫DNA模板质量分别为8、6、4、2、0.8、0.6、0.4、 0.2、0.1、禾口 0.08 ng; 11 为阴性对照。图3人工感染家兔日本血吸虫病代表性样品鉴别PCR聚丙烯酰胺凝胶 电泳图谱，其中，M为DL2000 marker ； 1-19分别为山区型DNA对照，云南洱 源II (SJYEIIF5)，云南巍山(SJYWMl)，四川天全(SJSTMl)，四川西昌
(SJSXF21)，四川凉山(SJSLMl)，湖沼型DNA对照，湖北武汉(SJHWM3)， 湖南长沙(SJHCM3)，湖南岳阳楼(SJHLF5)，湖南君山(SJHYFl)，湖南汨罗
(SJHMFl)，湖南常德(SJHGFl)，江苏无锡(SJJWF2)，江西南昌(SJJNMl)， 江西樟树(SJJZM1)，江西永修(SJJYM23)，浙江嘉善(SJZJF3)，安徽贵池 (SJAGM3)。
具体实施例方式与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 实施例1试剂盒的组成
试剂盒内含DNA裂解液27.5mL，其中含Nuclei lysis solution、pH8.0的0.5M的 EDTA、蛋白酶 K (20mg/mL)禾Π RNase A solution (4mg/mL) ； PCR 反应液 100 个反应 (25 μ L/反应)，为终浓度各 200μΜ 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP,终浓度 0.25pmol/ μ L的上游引物和下游引物，2mM的MgCl2、Taq Bl 25 μ L (5U/uL)；日本血吸虫山 区型DNA对照和湖沼型日本血吸虫DNA对照各1支。实施例2试剂盒特异性试验
用经过DNA有效性验证的曼氏血吸虫、埃及血吸虫、肝片吸虫、大片吸虫、华支睾 吸虫和社猫后睾吸虫6个对照样品DNA各1 μ 1为模板，按照试剂盒的反应条件进行特异 PCR扩增，同时设空白对照。表1 PCR扩增体系
权利要求
1.一种用于鉴别中国大陆山区型和湖沼型日本血吸虫的引物，其特征在于上游引物 序列如SEQ ID ΝΟ:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。
2.—种试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的用于鉴别中国大陆山区型和湖沼型 日本血吸虫的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于包括如下组分(1)DNA裂解液核裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液的混合溶液；(2)PCR反应液dATP、dTTP、dGTP、dCTP、上游引物、下游引物和MgCl2W 混合溶液；(3)日本血吸虫山区型DNA对照和湖沼型DNA对照。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于包括如下组分(1)DNA裂解液，27.5mL:为100个反应的200 μ L核裂解液、50 μ 1 ρΗ 8.0的 0.5mol/L的EDTA、20μ1蛋白酶K禾口 5yL RNase A溶液的混合溶液；(2)PCR 反应液，2.5mL:为终浓度 200|_miol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP, 终浓度0.25pmol/ μ L的上游引物和下游引物，2mmol/L的MgCl2的混合溶液；(3)日本血吸虫山区型DNA对照ΙΟΟμ 和湖沼型DNA对照ΙΟΟμ ；(5) Taq DNA 聚合酶，5U/VL，25μ 。
5.权利要求2 4所述试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤(1)日本血吸虫DNA的提取；(2)PCR扩增按照扩增样品数取PCR反应液、Taq酶混合，混勻，分装；将阳、 阴性对照液分别加入一个管中，取各样品的DNA加入对应反应管中；离心混勻，置于 PCR扩增仪上反应；(3)PCR产物观察取扩增后的PCR产物加样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，90V 电压电泳3h后置于胶片观察灯上观察结果并拍照分析。
6.根据权利要求5所述试剂盒的使用方法，其特征在于步骤(2)中所述PCR扩增 条件为94°C预变性5min; 94°C变性30sec、56°C退火30sec、72°C延伸30sec，35个循 环；72°C后延伸IOmin0
7.利用权利要求1所述引物鉴别山区型和湖沼型日本血吸虫的方法，其特征在于所述 方法包括如下步骤(1)日本血吸虫DNA提取；(2)用权利要求1所述特异性检测引物进行PCR扩增；(3)扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶检测，胶片观察灯上观察，条带与山区 型DNA对照相一致的即为山区型日本血吸虫，条带与湖沼型日本血吸虫相一致的即为湖 沼型日本血吸虫；(4)PCR 扩增条件为 94°C预变性 5 min ； 94°C变性 30 sec、56°C退火 30 sec、72°C 延伸30 sec, 35个循环；72°C后延伸10 min。
8.(5) 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳为90V电压下电泳3h。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别日本血吸虫的引物、相应的试剂盒及检测方法。本发明用于鉴别日本血吸虫的上游引物序列如SEQIDNO:1所示，下游引物序列如SEQIDNO:2所示。本发明还建立了用于快速检测日本血吸虫的方法，可准确区分不同类型的血吸虫。将本发明引物制备成试剂盒，具有操作程序简单化，检测特异性强，敏感度高，结果判定客观等优点，适合推广应用。
文档编号C12Q1/68GK102021247SQ20101057868
公开日2011年4月20日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者宋慧群, 朱兴全, 李娟 , 林瑞庆, 翁亚彪, 袁子国, 赵光辉, 邹丰才, 陈芬 申请人:华南农业大学