专利名称：预测粘附于表面的细菌活性生长的方法
技术领域：
本发明一般地是涉及微生物复制因子和抑制或促进微生物生长的方法。一种方法涉及处理或控制由粘附至表面或表面上的附着细菌引起的细菌感染。本发明的另一方面尤其是涉及处理和控制牙齿表面或内植表面的粘附细菌感染的方法。本发明的另一方面涉及用于引发细菌活性或快速生长或复制的组合物和检测该组合物的新菌株。本发明的另一方面还涉及用组合物控制粘附细菌活性或快速生长的方法，所述组合物可促使或引起细菌的活性生长。发明背景处理和控制细菌感染已成为现代研究的首要任务。抗生素的引入和广泛使用给医疗工作者提供了各种有力的工具来处理和控制患者的细菌感染。尽管已进行了大量的研究并易于得到抵御细菌感染的药剂，但处理和控制细菌感染的问题仍未解决。例如，抗生素的广泛使用已导致了对大多数常用抗生素具有抗性的致病微生物菌株的产生。另外，免疫损害患者数量的增加使医疗工作者面临着新的挑战。而且，医疗工作者早已认识到体内的外源装置，如牙植体，人工心脏瓣膜或导管的存在使患者易受细菌感染的侵袭，并且很难以对由上述外源体引起的感染进行处理和控制。
但是，完全可以预料，由于生物材料和植入方法的提高，装置的植入将会继续增加。尽管预料到在内植生物材料的使用上会不断增加，但目前还无法得到有效的用于处理和控制与使用这些材料相关的细菌的方法和药物。
由于对这类表面的细菌侵染还不太了解，因此控制表面上的细菌侵染和生长仍是悬而未决的问题。虽然细菌可以侵染几乎所有可接近的颗粒表面，但对这些表面上的这类细菌的控制或者造成所述表面上所述细菌生长的原因几乎一无所知。
对于可接近表面上细菌生物量的增加，被认为有影响的机理包括(1)固有的细菌吸附到牙釉质薄膜表面的特异性受体上；和(2)粘附细菌的生长或细胞分裂。据认为粘附细菌的生长很慢。
已经观察到并报告了粘附于表面的细菌明显不同于溶液中或未结合到表面上的细菌。例如，与粘附于表面上的细菌相比，溶液中的细菌对抗生素更易感。因此，了解细菌用于在表面上生长或粘附于表面的过程对于成功地处理或控制直接或间接与表面相关的细菌感染是必不可少的。
另外，还未鉴定或清楚地描述出对于在细胞群体中刺激生长或在个体细胞中引发生长所至关重要的微生物生长因子。从在表面或悬浮液中生长的细菌细胞中鉴定微生物生长因子可能是增加悬浮液或表面上细菌生长或抑制所述细菌生长的重要工具。
显然，有必要了解并预测生物材料表面上细菌的生长并控制与这些材料有关的粘附细菌的繁殖和代谢。也必需鉴定并描述微生物生长因子以便可以增强或抑制细菌在表面或悬浮液中的生长。本发明概述由于现已确定在材料表面上的细菌生长是密度依赖性的，所以本发明针对目前与处理或控制细菌在表面上生长相关的上述鉴定问题提供了一种新溶液。除非粘附细菌群体达到和提高了活性生长细菌与活细菌比例相关的密度，否则不会有细菌生长。从另一个角度讲，粘附于生物材料表面的细菌的实际繁殖和代谢不受时间和营养供应的制约。
因此，本发明的一个方面提供了预测细菌将在表面上表现出活性生长的方法，包括的步骤首先是确定表面上细菌的第一群体密度，然后将第一群体密度与第二群体密度进行比较，在第二群体中，具有被刺激或提高的活性生长细菌与活细菌比例，优选的约400,000细菌/mm2到约6,300,000细菌/mm2的密度，若第一群体密度大于第二群体，则可预测活性细菌生长。该方法可优选地用于测量表面细菌的生长。用下文实施例1中描述的方法，可以很容易确定群体中活性生长细胞与活细胞的比例。
本发明的另一方面是提供预测表面上的细菌生长快速增加的方法，包括的步骤是确定表面上活的生长细菌的群体密度，确定表面上活性生长细菌的群体，计算表面上活性生长的细菌与活细菌的比例，若活性生长的细菌与活细菌的比例在约5×10-4∶1到约20×10-2∶1，则可预测活性细菌在表面上生长。优选的，活性生长的细菌与活细菌的比例在约20×10-4∶1到40×10-4∶1。
本发明还包括通过控制细菌生长以使群体密度保持在与提高或刺激群体中生长细胞与活细胞的比例相关的群体密度以下，从而抑制细菌在表面上生长(即密度依赖性生长)的方法。通过限制细菌与粘附促进剂如碳水化合物的接触或修饰表面的疏水性，可以控制细菌生长。
除上述提到的方法外，本发明还包括控制或处理细菌感染的组合物和方法。因此，本发明包括一种含引发微生物复制的因子，SMR因子，它可以引发与表面结合的细菌的生长过程，分离后，用大小排阻膜过滤测得其分子量不到3000。分离的SMR因子对高压处理，冷冻和冻干均有抗性。
通过培养血液链球菌，然后在细菌处于活性生长期时，从培养基中分离细胞外物质，可以制备含SMR因子的组合物。血液链球菌的悬浮液和琼脂培养物对于SMR因子的制备均是有用的，优选的细菌菌株包括S.gordonii菌株Chillis ATCC保藏号35105(上文称为血链球菌)或E.coli 149 ATCC No.55535。
利用许多方法可以很容易确定SMR因子的存在，包括将含SMR的物质与保存于唾液包被的牙釉薄片上的细菌接触，培养细菌细胞包被的薄片，然后按实施例1中描述的方法，通过掺入放射性标记的核苷酸，确定细菌细胞的活性生长。
确定SMR组合物的其他方法包括测量与未用SMR处理的细菌群体相比，于存在SMR的情况下，固定到表面上的活性生长细胞比例的增长。细胞可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性，但优选的是S.gordoniiChallis ATCC No.35105。也可使用转化的细菌菌株，所述菌株有一个位于启动子控制下的整合的细菌报告基因，其表达受细胞生长的协同调节。
也可将SMR因子用于提高群体中活性生长的细胞与活细胞比例的方法中，优选的是达到约5×10-4∶1到20×10-2∶1的比例。在许多工业和诊断情况下，刺激微生物生长过程可能是很重要的。
本发明提供通过使细菌与抗微生物剂和SMR因子接触以便引发细菌的活性生长，从而提高抗微生物剂功效的方法。本发明还提供鉴别抑制或增强SMR因子的试剂的方法。抑制SMR因子活性的试剂可能是新的化疗药物。增强SMR因子活性的试剂可能是其他新的微生物生长因子。
本发明还提供一种遗传盒及含整合遗传盒的转化细菌。遗传盒由编码细菌报告基因的第一DNA序列连接可同其表达受细菌生长协调调节的基因或其部分杂交的第二DNA序列3′末端组成。第二DNA序列的作用在于使遗传盒或其部分整合到细菌染色体上的基因内。转化的细菌菌株含有整合到细菌染色体位于启动子控制下的位置上的遗传盒，其表达受细胞生长的协调调节。可将转化的细菌菌株用于通过监测每单位细胞每单位时间细菌报告基团的表达，从而在存在或没有SMR因子的情况下，测量微生物生长的方法中。附图的简要描述
图1A图示当群体接近约2,500,000-3,200,000[106.4-6.5]细菌/mm2的细菌密度时，细菌于在体牙植入物上的活性生长。
图1B图示在开始的2至8小时内于在体牙植入物上发生的牙釉质薄膜结合位点的饱和作用。口腔菌丛以200,000-630,000[105.3-105.8]/mm2的密度使这些表面饱和。
图2图示当细菌群体达到约2,500,000-3,200,000[106.4-6.5]细菌/mm2的密度时，存在蔗糖或水的情况下，细菌于在体牙移植物上的活性生长。
图3图示比较在口腔中的牙釉质上和在用十二烷基磺酸钠处理的牙釉质上总的活细菌数量。
图4图示当在任何所述表面上的群体密度达到约2,500,000-3,200,000[106.4-6.5]细菌/mm2时，在牛牙釉质、VISIODISPERS光处理过的复合牙恢复剂(ESPE-Premier，Norristown，PA)和SILUX恢复剂(3M，St.Paul，MN)表面上，活性细菌的生长。
图5A表示将放射性标记的S.gordonii Challis菌株ATCC保藏号35105，(*)和S.parasanguis PW213(●)固定到马来酸酐活化的板上作为每mm2细胞输入的函数。
图5B表示放射性标记的S.gordonii Challis菌株ATCC保藏号35105与下述三个表面的结合作为每mm2细胞输入的函数reacti-bind马来酸酐活化的聚苯乙烯条板(□)(Pierce，Rockford，Ill)；Immulon条板(◇)(Dynateeh Labs)和Easy Wash ELISA带孔(●)(Comig，NY)。
图6表示[3H-甲基]-胸苷在存在分离的SMR因子(*)的情况下向S.gordonii Challis菌株ATCC保藏号35105和对照Todd Hewitt(TH)培养基(□)中的掺入作为SMR或TH培养时间的函数。箭头表示在优选的体外细菌复制检测中，收集的时间。
图7表示质粒pMSP16Samy的遗传和物理图谱。该质粒是通过将与链球菌16S rRNA基因的内片段同源的DNA片段连接到本文所述的pRQ200中而构建成的。
图8表示S.gordonii Challis染色体rDNA的推测结构，含有与16S rRNA启动子(用p表示的)融合的无启动子淀粉酶基团，接着pMSP16Samy通过同源重组整合到Challis染色体上。详细描述本发明公开了处理或控制附着的或粘附于生物材料表面的细菌生长的方法。本发明提供了确定在什么条件下和什么时间，细菌会在表面上表现出增强、受刺激、活性、或迅速生长的方法。细菌的活性生长与群体密度直接相关。密度依赖性生长与在活细胞群体中，刺激或增加活性生长细胞的比例有关。在群体中，活性生长的细胞与活细胞数的比例可以由许多方法确定，但优选的是经将放射性标记的核苷酸掺入到细胞DNA中来测量。刺激或提高生长细胞对活细胞的比例会导致生长细胞对活细胞的比率达到约5×10-4∶1到20×10-2∶1，优选的为10×10-4∶1到40×10-4∶1。若大小为1-2微米的链球菌天然占优势的细菌群体的群体密度达到约400,000[105.6]细菌/mm2到约6,300,000[106.8]细菌/mm2，则可完成密度依赖性活性生长。群体密度优选地是达到约2,500,000-3,200,000[106.4-6.5]细菌/mm2。
此外，本发明还提供引发细菌生长或复制过程，作为试剂或产物的微生物复制因子。在细菌表现出活性生长时，这些微生物复制因子变异体或修饰物也可以允许控制条件和时间。同时还提供了各种方法以确定微生物复制因子对细胞的活性以及鉴定抑制或增强微生物复制因子的试剂。还提供了用微生物复制因子增强或抑制微生物在表面上或悬浮液中生长的方法。在存在或没有微生物生长因子测量微生物生长的方法中，可以使用新的细菌菌株。
本发明还提供遗传盒和转化的细菌细胞。遗传盒含有与第二DNA序列3′末端相连的编码细菌报告基因的第一DNA序列。第二DNA序列使其表达受细胞生长协同调节的遗传盒重组并整合到位于启动子下游的细菌染色体上。转化细胞有一个遗传盒，该盒包括其表达由细胞生长协调调节的、稳定地整合到启动子控制下的细菌染色体中的细菌报告基团。报告基因作为细菌群体中生长细胞比例的指示物。同时还提供存在或没有微生物复制因子的情况下，测量微生物生长的方法。
按本文所用，下列术语有下列含义。
活细菌指在含适当营养的培养基中可以生长的活细菌。一般是，将含细菌的一份样品加到富含营养的琼脂培养基中，该份样品中的细菌可以生长。通过计算在琼脂上生长的菌落形成单位数，可以很容易确定样品中所含的细菌数。然而，活细菌数不会提供在给定的时间，与所述细菌所处的特定生长状态相关的任何资料。因此，活细菌包括休眠的，潜伏的和活性生长及即将死亡的细菌。
活性生长的细菌指细菌细胞进入相对短的时间或时期内，在这期间与观察到的体眠、潜伏或缓慢生长的细胞的繁殖率、代谢率、生长和复制率相比，细菌进入一个活性或迅速繁殖、代谢、生长和复制的时期。若在液体培养或悬浮液中生长，则通过观察单位时间内活细胞数的增加，可以测量活性生长的细胞。若细菌在液体培养基中处于对数生长期，则以单位时间活细胞数的变化为基础，可以计算双倍的时间。通过测量细胞活性合成的DNA或RNA或多肽的比例，可以确定群体中活性生长细胞与活细胞比例的增加。总细胞量、多肽、RNA和DNA是生长率的函数。(参见Physiology of the Bacterial CellA Molecular Approach，eds.F.C.Neidhardt et al.(1990)Sinauer Associates，Inc.at pages 199-202，216-220)。用实施例1中描述的标记技术，通过测量细胞DNA合成的数量，可以测量活性生长的细胞的比例。
病原菌指对患者有不利的临床影响的细菌属、株或型，其中这种不利影响起因于不必要的细菌生长或不必要的细菌代谢物的存在。病原菌是本领域专业人员熟知的，并在有关的教科书如MedicalMicrobiologyAn Introduction to Infectious Diseases，2d.Edition，John C.Sherris(editor)(1990)Elsivier PublishingCo.，Inc.New York，NY中作了描述。可以理解特定的细菌属、株或型的致病性将随患者的不同而有所不同。然而本领域专业人员很容易确定什么样的特定细菌会对特定的患者造成不利的影响而不必进行过分的检测或实验。也可以理解不是所有的细菌均会对患者有不利影响，并且并不认为在生物材料表面上已知的，相对有益或无害细菌的存在是有害的，而且可能对患者有益。
机会致病菌是那些通常被认为无毒力或致病力有限的微生物，但如果它们到达身体的被保护区或普通的宿主防御机制受到损害，它们就会引起疾病或感染。机会致病菌感染是本领域专业人员熟知的，并在教科书如Medical Microbiology(见上文)中作了描述。
群体密度指被粘附到表面的特定区域或在已知容积的液体中的活细菌数。可用熟知的培养法、平板计数法和活体染料确定所述细菌的群体密度。
生物材料指具有活细菌可以粘附的表面的物品。适宜的生物材料包括各种材料，如树脂、修复材料、复合材料、金属或陶瓷。表面包括可接触液体中所含细菌的材料的暴露表面。
粘附促进剂指促进或增强细菌与表面的粘附能力的材料、物质或组合物。
粘附抑制剂指用于修饰材料的表面特性以便抑制细菌与生物材料表面的粘附能力的材料、物质或组合物。
引发微生物复制的因子，SMR因子指可以增强、刺激、引发细菌细胞成为活性生长的细胞的任何试剂、或试剂的组合。若检验SMR因子对细菌细胞群体的活性，则可发现活性生长细胞对活细胞比例的增加，优选的是群体中活性生长细胞对活细胞的比例为约5×10-4∶1到20×10-2∶1。术语活性生长包括细菌细胞分裂和与细菌细胞的活性生长期相关的细胞代谢、DNA和RNA生产以及其他生物学反应的增加。应理解各种外源因素如培养基类型、浓度、离子强度、离子的存在、氧化-还原潜力、粘度、导电能力以及其他生物学试剂都会影响观察的SMR因子活性。
动力接触角度指按制造商提示的方法，用Wilhelmy天平测量表面或修饰表面与水的相互作用(Wilhelmy天平从Cahn Instruments，得到，Model DCA-332，Cerritos，CA)。用该方法可以确定表面或修饰表面的相对疏水性。
固定的细菌指作为附着于表面的连接子的细菌。固定作用可以包括用化学或生物剂如马来酸酐或支持结合抗体将细菌结合到表面上，粘附细菌指用内生粘合素(adhesin)将细菌与适合的表面相连。结合细菌指与表面有联系的细菌。
细菌报告基因产物指无论活性生长与否，优选的是正常来讲均不存在于细菌细胞中并可作为活性生长细胞指示剂的多肽。基因产物具有可作为时间或生长的函数而测量出的结构和功能特征。
遗传盒指至少两种不同DNA序列(优选的是有不同功能的)的结合，以形成遗传信息单位。
稳定整合指遗传盒被连到细菌染色体以便它可随细菌染色体复制并传到子代细菌。整合的遗传盒相对于遗传工程质粒具有很低的回复率，优选的约105到10-9。
与基因或其部分杂交的第二DNA序列与细菌染色体的互补区有足够的序列一致性(优选的90-100％)，当杂交序列通过转化导入细菌时，形成稳定的、双链杂交DNA分子。可以利用在体内形成的克隆DNA序列间的杂交分子(优选的500-5000bp长)将遗传盒整合到细菌染色体的特定位置。预测表面上细菌活性生长的方法本发明公开了与表面结合的细菌的繁殖和代谢取决于时间和营养供应，并且除非细菌群体在自然表面上达到与密度依赖性生长相关的群体密度，否则所述粘合细菌不会有明显的繁殖或代谢。
事实上，在自然界的每个角落均可发现细菌而且只要有细菌存在，它们就不可避免地试图粘合到可以接触到的表面上，因此，控制所述细菌的方法和过程有着广泛的实用性。具体地说，细菌易达到的表面包括牙科生物材料，体内医用装置，会与液体如血清、体液、其它含多肽，糖蛋白，或碳水化合物的液体以及不含活细菌接触的其他牙科和医用设备。可见于家中、工作和工业环境中的表面对于细菌的粘合是敏感的。
检验在口腔中存在的生物材料可作为一种易于获得的模式来研究粘合到表面的细菌的行为和特性。口腔中的表面很容易达到而且口腔中包括了各种已发现对身体的其它保护区有害的细菌属和种。例如，已经报告过某种存在于口腔中的细菌能够有机会感染通常是处于被保护区且通常无菌的，即一般不被或受细菌污染的心内表面。这类心内感染对于接受修复心脏瓣膜移植的患者有极为不利的影响。由于在身体的所有粘膜表面和通常有关的环境存在多细菌属和菌株，因此期望用于评估、处理和控制粘合到口腔表面的细菌的方法和工艺可以很容易地转用于评估、处理和控制粘合到身体其它部分或环境表面上的细菌。
而且，还期望对于接触血清或其它体液的细菌易接近的表面同样表现出与口腔中细菌行为相似的密度依赖性生长现象。另外，本说明书中公开的方法和过程也适用于评估、处理和控制粘附在口腔或身体外表面的细菌。
在探索影响细菌的方法和过程中，一个要考虑的重要因素是需要选择性地针对致病或机会致病菌，而不会损害与正常菌丛相关的有益的细菌。由于众所周知当细菌处于活性生长期时，它们对抗微生物剂特别敏感，但处于休眠或潜伏生长期时，可以不受抗微生物剂的影响，因此，通过将致病菌与特定的抗微生物剂和引发微生物复制的(SMR)因子一起接触，可以显著提高抗微生物剂的效率。
一种以致病或机会致病细菌的生长为目标的方法是在存在引发微生物复制的因子的情况下，使结合的细菌与特定的抗微生物剂接触。在不意味着限制本发明的情况下，认为附着细菌对抗微生物剂没有抗性，部分原因是由于缓慢的生长速度(Gustina et al.，Biomaterials，8423(1987)和Brown et al.，AntimicrobialChemotherapy，22777(1988))。已经知道生长速度是抗生素作用的一级调节者。通过将细菌与对某类致病或机会致病细菌特异的抗微生物剂和本文描述的微生物复制因子接触，就可将目标指向致病菌。在不以任何方式限制本发明的同时，认为刺激活性生长会提高对抗微生物剂敏感的致病或机会致病菌的比例。对致病和机会致病菌有特异性的抗微生物剂是本领域专业人员熟知的，并在Internal Medicine，4th Ed.，Editor in Chief Stein，Mosby-Year Book Inc.，St.Louis，Missouri or Wilson et al.，Harrison′s Principles ofInternal Medicine，12th Ed.，Vol.1 Eds.，McGraw-Hill.Inc.，New York，NY中作了描述。
可选择地是，由于认为特定的身体保护区是无菌的，即一般不会被或受细菌污染，因此在选择抗微生物剂时，不必考虑有益细菌或正常菌丛的存在。这些身体的保护区包括眼内、包括心脏的心包、内部器官、骨、肌肉和脑。为了控制在这些身体保护区的致病或机会致病性感染，可以将包括广谱药剂的抗微生物剂与微生物复制因子一起施用。
本发明的方法还包括预测与表面结合的细菌会表现出的活性生长。该方法包括将以群体中生长细胞与活细胞比例确定的密度提高到约5×10-4∶1到约20×10-2∶1。细菌群体中活性生长细胞的增加和刺激是密度依赖性的。一旦确定了该密度，就可以预测结合的细菌群体会在何时表现出活性生长。可以比较用各种试剂如微生物因子处理的群体中活性生长细胞与活细胞的比例。
可以用各种方法确定结合到表面的活细菌的密度，例如可以用熟知的方法从表面上移取细菌，将其适当稀释，放在适当的培养基上，培养并计算。其他确定群体密度的测量方法是本领域专业人员熟知的。该方法也可确定活细菌的群体密度，这是到目前为止最精确的牙斑群体密度测量法。
确定群体中活性生长细胞比例的方法包括将一等份同时在测量每测量面积活细菌数的样品与过量的标记核苷酸接触。通常接触时间的长短少于最小细胞分裂时间，存在标记核苷酸的情况下培养细菌会导致该标记物掺入那些正处于活性生长的活细胞的DNA(和/或RNA)中。然后用掺入的标记核苷酸量确定与样品中活细菌相比的活性生长细菌数或部分。可以在不同活细胞表面密度的样品之间比较以活细菌数为基础的活性生长率。
标记的核苷酸可以选自经过修饰的含适当标记的嘌呤和嘧啶衍生物。适宜的标记包括有放射活性的配位体和染料或本领域专业人熟知的其他标记。一种优选的标记核苷酸是[甲基-3H]-胸苷和[C14]-腺嘌呤的混和物。
在图1A中说明了标记核苷酸[甲基-3H]-胸苷掺入活细菌中。在该图中，当活细菌密度达到2,500,000-3,200,000[106.4－6.5]时，活性生长细菌的数目有很大的提高。在密度低于630,000[105.8]或大于6,300,000[106.8]时，则活性生长细菌的水平不高。实施例1中描述了用于得到图1A所示数据的方法和技术。
在本发明的另一方法中，通过将细菌群体保持在与刺激或提高活性生长细胞与活细胞的比例有关的密度下，就可以控制细菌在表面上的生长。各种表面处理可以增强或抑制细菌在表面上的粘附和/或生长。通过限制与粘合促进剂如多肽、糖蛋白和碳水化合物的接触，可以抑制细菌在表面上的粘附和/或生长。可选择地是，通过用疏水物质包被表面，可以抑制细菌在表面上的生长和/或对其的粘附，优选的包被物可产生平均动力接触前倾角为约60-130°和平均动力接触后倾角大于约20°的表面。所述化合的适宜实例包括市售产品如SILUX修复剂(3M.，St.Paul，MN)和VISIO-DISPERS复合物(ESPE-Premier，Norristown，PA)和美国专利No.5,078,988(1992.1.7出版)中公开的试剂。
例如，图2图示将[甲基-3H]-胸苷掺入取自移植的牛珐琅质表面的活性生长细菌中。将这些移植物在体内暴露于水、葡萄糖或蔗糖洗液。已知蔗糖是一种粘合促进剂。在群体密度达到2,500,000-3,200,000[106.4-6.5]时，活性生长细菌数显著增加。如实施例2中所述，这些资料表明细菌迅速生长的增加取决于密度而不依赖于外部因素如蔗糖、葡萄糖或水。粘附促进剂可以加速群体密度达到的时间，但不会显著影响观察到迅速生长增加那时的密度。
在另一实施例中，图4图示使[甲基-3H]-胸苷掺入从同时放在嘴中的牙釉、VISIO-DISPERS或SILUX修复材料中取到的活性生长细菌。VISIO-DISPERS或SILUX是有疏水表面的物质。同样，当群体密度达到2,500,000-3,200,000[106.4-6.5]时，活性生长细菌的数量有明显地增加。如在实施例4中所述的，这些资料说明细菌迅速生长的增加不依赖于表面，而取决于活细胞密度。然而，通过抑制细菌粘附到表面的数量，疏水表面可抑制细菌的粘附和/或生长，因此，群体密度可以保持在与密度依赖性活性生长相关的水平以下。
在本发明的各种实施方案中，对表面上致病菌或机会致病菌的群体密度作了处理或控制，以使细菌的群体密度保持在可观察到的密度生长的密度下。使大小为约1-2微米的细菌进行依赖性生长的密度达到约400,000[105.6]细菌/mm2到约6,300,000[106.8]细菌/mm2的密度，并且，优选的密度在约2,500,000-3,200,000[106.4-6.5]细菌/mm2。在不受理论限制的同时，目前认为，当细菌群体达到与密度依赖性生长相关的群体密度时，在个体细菌间存在一种联系从而引发群体中活性生长的开始。若细菌群体密度保持在与密度依赖性生长相关的密度下，则这种必要的联系并不能影响细菌的协调生长。因此，只有达到与密度依赖性生长相关的密度，才能将致病菌或机会致病菌因生长或代谢产物而产生的有害影响保持或限制在可接受的水平。微生物复制因子(SMR)组合物本发明包括称作引发微生物复制(SMR)的微生物复制因子、获得SMR因子的方法和用SMR因子或其衍生物控制活性细菌生长的方法及工艺。SMR因子引发细菌的活性生长或复制过程。更重要的是，即使细菌的群体密度低于与体内活性生长细胞的刺激或增强有关的密度，SMR因子也能引发细菌的活性生长。
若测量关于SMR因子对结合细菌细胞群体的活性与对照的未处理过的细菌群体中生长细胞与活细胞的比例相比，就可发现生长细胞与活细胞比例的增加。优选的生长细胞与活细胞比例为约5×10-4∶1到约20×10-2∶1。可以按上文所述来确定生长细胞与活细胞的比例。优选地，用实施例7和11中描述的方法可以检测SMR因子活性。
也可以从活性生长细菌的细菌性无细胞上清液中分离SMR因子。优选地，可以在血液链球菌周围的细胞外基质中鉴别SMR因子。一种特别优选的细菌是S.gordonii菌株Challis ATCC No.35105。也可以用包括S.gordonii菌株12和S.gordonii Blaokburn的其他链球菌菌株以及E.coli菌株149，ATCC No.55535。E.coli菌株149已被保藏在ATCC，Rockville，MD(1994.1.7)，保藏号为55535。
也可以按如下步骤从细胞中分离SMR因子。在缓冲培养基中培养血液链球菌或E.coli。细菌的悬浮液和琼脂培养物均可用于制备SMR因子。培养细胞的过程中，收集细菌周围的细胞外物质。在体外检测中，细胞外物质与细菌接触时，通过测量与每单位时间每细胞生长相关的细胞组分的增加，就可以测定物质中的SMR因子。另外，也已鉴定了在唾液提取物中的SMR因子活性，所述唾液提取物来自在其口腔中有自然细菌群体的自愿者。
也可以从革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞的培养物中分离SMR因子。用大小排阻膜过滤法确定出分离的SMR因子的分子量小于3000。无论是得自革兰氏阳性还是革兰氏阴性培养物的分离的SMR因子均可刺激革兰氏阳性或革兰氏阴性培养物的微生物生长。
可以用几种方法检测SMR因子的活性。在一种方法中，优选地使细菌群体与微生物复制因子接触一段足够的时间以引发微生物生长过程。通过比较在处理过的群体微生物的生长与未处理过细菌群体中的微生物生长，可以确定微生物生长的刺激作用。也可以用这种方法确定刺激群体中活性生长细胞与活细胞的比例增加的SMR因子的有效量，优选的所述比例为约5×10-4∶1到约20×10-2∶1。
在另一种方法中，用含细菌报告基因的细菌菌株检测SMR因子，所述基因位于启动子控制下，其表达由细胞生长协调调节。使细菌菌株如S.gordonii MSP812，ATCC Deposit No.69528与SMR因子接触一段足够的时间以引发微生物生长过程。通过将[甲基-3H]-胸苷掺入DNA，可以测量活性生长细胞比例的增加。另外，通过在暴露于SMR因子后，检测每单位时间每细胞细菌报告基因产物量的增加，然后与在对照或未处理细胞中，每单位时间每细胞细菌报告基因产物的数量进行比较，可以测量活性生长细胞的增加。使用SMR因子的方法可以在抑制或增强细菌生长的方法中使用SMR因子，也可鉴定抑制或增强SMR因子活性的试剂。抑制SMR的试剂可能是新的可用于治疗令人讨厌的细菌感染的治疗性抗微生物化合物。
在许多种情况下，用SMR因子刺激或增强细菌的生长。在工业过程中会使用许多种细菌。SMR因子的加入可以提高细菌的产率或生长细菌的效率。另外，可以将SMR因子加到生长培养基中，特别是那些在诊断细菌中所用的。刺激微生物在培养基中生长可以早期诊断感染。还有许多其它刺激或增强微生物生长会有好处的情形。
本发明提供了一种刺激微生物生长的方法。该方法的步骤包括使微生物群体与促使细胞生长，即增加群体中活性生长细胞比例的有效量SMR因子接触。通过使用如实施例7中所述的方法，由标准的剂量反应试验确定针对特定细菌的SMR因子有效量。SMR因子有效量是可使群体中生长细胞与活细胞的比率达到20×10-2∶1的数量。
SMR因子可以与结合细菌或在液体培养基中生长的细菌接触。可以将SMR因子留在培养基中，并可在培养基成份耗尽时或如果细菌是在连续培养系统中生长时，不时补加。
本发明还提供了一种方法以鉴别抑制或增强SMR因子的试剂。该方法的步骤包括将细菌群体与SMR因子和一种被怀疑可能会抑制或增强SMR因子的活性的试剂接触以得到处理过的群体。将群体培养一段时间以便足以检测微生物生长的开始。将处理过群体中活性生长细胞与活细胞的比例与单独用SMR因子处理过群体中的比例进行比较。比例的提高或增加表明该试剂是另一种微生物生长因子。活性生长细胞比例的抑制表明该试剂可用作抗微生物试剂。遗传盒本发明还提供一种遗传盒，它含有与第二DNA序列的3′末端相连的编码细菌报告基因的第一DNA序列。第二DNA序列与其表达由细胞生长协调调节的基因或其部分杂交。该基因位于细菌染色体中。盒中的第二DNA序列用于使遗传盒或其部分重组并整合到细菌染色体中。该盒整合到细菌染色体中使得可在启动子的控制下表达细菌的报告基因产物，该报告基因的表达受细胞生长的协调调节。
细菌报告基因产物是一种具有可检测的结构或功能特征的多肽。在本发明中，细菌报告基因产物用于鉴别处于活性生长的细胞。例如，如果细菌报告基因产物是一种酶，则可通过测量酶活性检测细菌报告基因产物的表达。另外，通过细胞特征如菌落颜色的变化，可以测量细菌报告基因产物。优选的是细菌报告基因不存在于整合有该细菌报告基因的宿主细胞中。另外，优选的是细菌报告基因对细菌宿主细胞无毒。
适宜的细菌报告基因产物的实例是酶，如淀粉酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素-乙酰转移酶和荧光素酶。由于S.gordonii ChallisATCC No.35105没有内源淀粉酶活性，所以对于S.gordoniiChallis ATCC No.35105菌株来说，优选的细菌报告基因产物是淀粉酶。
用如Ausubel等人(Ausubel et al.Current Protocols inMolecular Biology(Greene Publishing Associates and WileyInterscience(1987))描述的标准方法，可以得到编码细菌报告基因的DNA序列。编码特定报告基因的DNA序列在市售的质粒中得到，或参考公开的方法也可获得。例如，可以从来自Dr.Ron Yasbis，(University of Maryland，Baltimore，Maryland)的称为pRQ200的质粒(按Lane et al，Gene，100225-229(1991))所述构建中得到编码细菌淀粉酶的DNA序列。编码细菌报告基因产物的DNA序列优选的是不存在于细菌宿主细胞的基因组中，因此，优选的是从其它细菌种或属得到的异源DNA序列。
用适当设计的引物经PCR或者通过亚克隆至可在细菌细胞中扩增的质粒中，可以扩增编码细菌报告基因的DNA序列。一旦扩增后，就可将编码细菌报告基因的DNA序列与第二DNA序列结合以形成一表达盒，所述第二DNA序列与一种其表达由细胞生长协调调节的基因或其部分杂交。将第一DNA序列与第二DNA序列结合以使第一DNA序列以对表达来说是适当的方向整合到细菌染色体中。第一DNA序列的5′末端与第二DNA序列的3′末端结合。可以用如实施例l0中描述的本领域熟知的方法连接第一和第二DNA序列。
本发明的遗传盒还包括与第一DNA序列相连的第二DNA序列。第二DNA序列与一种其表达受细胞生长协同调节并位于细菌染色体上的基因或其部分杂交。第二DNA序列的功能是使遗传盒或其部分重组并整合到细菌染色体上。细菌细胞优选地含有整合到染色体上位于启动子控制下的位置的遗传盒，其表达受细胞生长的协同调节。通过筛选与一种基因或其部分杂交的第三DNA序列，第二DNA序列就可使遗传盒或其部分有目标地整合在染色体上的特定位置，已知所述基因或其部分的表达受细胞生长的协同调节。编码细菌报告基因的第一DNA序列的5′末端与第二DNA序列的3′端相连。
第二DNA序列与已知其表达受细胞生长协调调节的基因或其部分或者与所选细菌菌株细菌染色体上的随机DNA序列杂交。优选的细菌菌株包括链球菌菌株如S.gordonii Challis ATCC No.35105。已知其表达受所选细菌菌株的协调调节的基因是本领域专业人员熟知的，如核糖体RNA基因和编码核糖体蛋白质的基因。优选的是所述基因以多拷贝存在于细菌染色体上，以便在遗传盒或其部分整合到该基因中时不会破坏细菌的必需功能和/或导致转染细胞的死亡。参考科学文献或检索基因序列数据库如Genbank(在National Institutes ofHealth，Bethesola，Maryland)或RNA数据库(在University ofIllinois/Champaign/Urbana，Champaign，Illinois)可以确定其表达受细胞生长协调调节的基因或部分基因的DNA序列或者所选细菌菌株中细菌染色体的随机片段的DNA序列。
第二DNA序列与基因的一部分或细菌染色体随机片段的互补链有足够的序列一致性以使全部或部分遗传盒重组并整合到细菌染色体上的基因或随机位置上。对于重组和整合所需的足够的DNA序列相似性指连续DNA序列的约100到5000个核苷酸与部分所选基因的一部分互补链或细菌染色体的随机片段的互补链有80-100％的一致性。优选地，第二DNA序列与某种基因或其部分的互补链有足够的相似性以便提供足够高效率的整合，从而容易检测整合体。所述频率优选的为约10-6到10-8。
优选的某基因的一部分是实施例10中所述的链球菌16S rRNA基因的内部片段。第二DNA序列还优选地在两个末端均含有约4-8个核苷酸长的附加DNA序列，以提供限制性内切酶裂解位点。限制性内切酶裂解位点的序列是本领域专业人员熟知的。末端的序列可以是相同的限制性内切酶识别序列或不同的识别序列。这些序列使得本领域专业人员可选择适当的限制位点以便克隆到载体中所选的位置上，从而确保第一DNA序列与第二DNA序列的3′端相连。
一旦选定了第二DNA序列，就可以通过任何途径进行制备。例如，可以按实施例10中所述来制备与部分第二DNA序列互补的引物。然后可以用所述引物经聚合酶链反应(PCR)扩增编码一种基因或其部分的染色体DNA序列，所述基因或其部分的表达由细胞生长率协调调节。此外，可以用标准方法来亚克隆所选基因部分，包括用限制性内切酶消化，然后连接到可被扩增的载体中。可以用自动DNA合成法、用PCR扩增或经亚克隆合成所选的随机DNA序列。
在PCR中所用的DNA探针或引物约15到50个核苷酸长，并含有与细菌染色体上基因或其部分或者随机片段互补的序列。用自动的DNA合成法可以制备引物和探针。所述引物的实例是如实施例10所示与编码链球菌菌株16s核糖体RNA的DNA序列互补的引物。通过检测基因部分的DNA序列或随机DNA序列可以设计其他引物或探针。优选地，将引物和/或探针设计成与基因的一部分互补，所述基因的DNA序列在其他细菌菌株中是保守的。例如，通过比较数种16S rRNA基因的序列并鉴别DNA序列的保守区来选择与部分核糖体RNA序列互补的引物。DNA序列保守区优选地有约90-100％的DNA序列一致性。
遗传盒还含有可选择的标记基因。可选择的标记基因与第一和第二DNA序列相连，通常是将所述序列亚克隆到携带选择性标记基因的载体中。优选的选择性标记基因是抗生素抗性基因并在许多市售的载体中可得到。
一旦选择并获得了第二DNA序列，第二DNA序列便与第一DNA序列结合以便第一DNA序列的5′末端与第二DNA序列的3′端相连。用亚克隆到载体如质粒中的标准方法，可以完成DNA序列的结合。可以用在任一末端的限制内切酶位制备第二DNA序列以便容易克隆到质粒中。编码报告基因的第一DNA序列可能已存在于质粒中或可能已从第二DNA序列下游亚克隆。
适用于本发明的载体是可用于将遗传盒导入细菌细胞并使遗传盒或其部分重组并整合到细菌染色体中的载体。适宜的载体包括质粒和病毒。对质粒进行选择以便它们不在所选的细菌宿主细胞中复制以利于遗传盒的整合。许多载体是市售的或可用公开的方法构建。优选的载体含有选择性标记基因。优选的质粒是实施例10中所述的质粒pRQ200。具有稳定整合的遗传盒的细菌菌株一旦按本发明制备了遗传盒，就将其导入宿主细胞。优选的宿主细胞是链球菌菌株。但是，其他细菌也可作为适宜的宿主细胞。优选地用载体将遗传盒导入细胞。优选的所选载体不会在细菌宿主细胞中复制以利于遗传盒的整合。
用标准方法如磷酸钙沉淀法和电穿孔法可以将遗传盒导入细菌宿主细胞。如果细菌细胞为转化感受态，如S.gordonii Challis ATCCNo.35105，那么DNA可与细胞直接混和。遗传盒导入细菌宿主细胞后，筛选转化细胞。
根据转化载体上存在的选择性标记基因开始筛选转化细胞。如果载体不在宿主细胞中复制，则携带选择性标记基因的转化细胞含有整合到染色体上的全部或部分载体。在许多细菌中的重组机制是本领域专业人员熟知的。可以发生单一或双倍交叉重组，以致整合到染色体中的载体数量会有变化。最低限度，转化细胞含有整合的选择性标记基因和功能性细菌报告基因。优选的转化细胞也含有一选择性标记基因。
可以根据细菌报告基因产物的表达筛选转化细胞。对细菌报告基因产物的检测是本领域专业人员熟知的。还可根据细菌报告基因产物的表达由细胞生长协调调节来选择转化细胞。
用标准方法，在存在或没有微生物生长因子的情况下可以测量在转化的活性生长细胞中，报告基因产物的表达。通过测量在存在相对没有微生物生长因子的情况下，每单位时间每细胞报告基因产物的增加，可以确定报告基因产物的协调调节表达。
在实施例10和11中描述了筛选方法和细菌菌株的具体实例。20个转化体中选择2个作进一步的特征描述。已表明生产微生物复制因子的一个菌株是S.gordonii Challis MSP812。S.gordoniiChallis MSP812已寄存在美国典型培养物收集中心(Rockville，MD.，于1994，1，6)，保藏号为No.69528。另一在活性生长细胞中每单位时间生产更多淀粉酶的菌株是S.gordonii Challis MSP818。S.gordonii Challis B2B MSP818已寄存在美国典型培养物收集中心(Rockville，MD，1994，1，6)，保藏号为No.69529。检测微生物生长的方法可以用含有稳定整合的表达盒的细菌菌株测量微生物生长，所述表达盒位于启动子控制下，其表达受细胞生长协调调节。在培养基中接种细菌细胞可以刺激微生物的生物，所述培养基含有该特定细菌菌株生长所需的所有成分。不同细菌菌株生长所需的培养基和条件是本领域专业人员熟知的。通过确定每单位时间生产的报告基因量可以监测群体的生长。
另外，如实施例11所示，用细菌菌株可以测量引发微生物复制的因子的活性，使细菌菌株与引发微生物复制的因子接触，然后培养一段足够的时间以使生长因子刺激群体中活性生长细胞与活细胞比例的增加。与未处理过的细菌群体相比，在应答引发微生物复制因子的细菌群体中，可以测量每单位时间每细胞细菌报告基因产物的增加。
实施例下面的实施例是为了进一步说明本发明的具体实施方案。这些实施例是为了进一步描述本发明但不应用于限制权利要求的范围。实施例1-确定牙釉质植入物上的活性生长群体用在体模型研究20名成年人口腔中牙齿的细菌集群现象。在继续其正常饮食的健康成年受试者中，检测噬菌斑。(选择标准包括没有系统性疾病、怀孕或广泛的修补。指示受试者保持正常饮食和口腔卫生，但不刷实际结合的试验材料(见下文)或用任何商业口腔洗液清洗)。
将检测面积为约10mm2的牛牙釉质片直接固定在定做的牙冠内的6颗对测上前臼齿和第一臼齿(牙齿号为1.4，1.5，1.6，2.4，2.5和2.6)上，以便用公开的方法容易植入并除去牙釉质片。下文详细描述了牙釉质片的构成和牙冠。然后放在每个受试者的6颗牙上，牙釉质片留置不同的时间以积累牙斑。在2、4、8或24小时后，从口腔中取出细菌斑覆盖的牙釉质片，然后用下文详述的方法检测活微生物的组成、总的活细菌数，以及群体活性生长的比例。
这些数据给出有关活细胞数，那些活细胞的微生物种的组成，群体活性生长部分的测量的信息。被植入的表面的集落形成或生物薄层的形成被定义为特定的粘附加细胞分裂。据认为对最终蚀斑细菌生物量有意义的机制包括(1)固有的细菌粘附在牙釉质薄层表面的特异性受体上；(2)在已粘附于釉质的细菌(形成蚀斑)和其他固有细菌间的聚集或粘附(细菌间的粘附或聚集)；和(3)天然粘附细菌的生长或细胞分裂。只对第一种机制已直接进行了在体研究。
以来自这些研究的数据为基础，可经两种途径评估自然粘附。首先，已报告了每mm2的平均活细胞数(Liljemark et al.，OralMicro.& Immun.，85-15(1993))。在口腔中4小时后，发现了约1-2,000,000活细胞/mm2。第二种评估粘附对蚀斑生物量的影响的方法列于图1B。检测18位受试者的每个牙表面，可以观察到薄层结合位点的饱和。该图描述说明薄膜位点在200,000和630,000[105.3到105.8]活细胞/mm2之间达到饱和。这与离体测量口腔链球菌的唾液结合位点结果一致。
以来自相似研究的数据为基础，通过植入被链球菌(该菌株被报道，表现有识别的聚集表面粘合素(adhesin)的大部分特性，所述粘合素在体外引起缓冲液中种间细菌成簇)的连续表面所覆盖的牙釉质植入物，测量体内细菌间的粘附率)(Skopek et al.，Oral Micro.and Immun.，816-23(1993))。相似地可以测量对植入物的体内粘附率(Litjemark et al.，见上文)。
到24小时为止，每mm2约33×106细菌形成蚀斑生物量，显然在蚀斑形成的第一天，细胞分裂是造成蚀斑生物量的主要原因。在薄层上特异位点处于饱和时的粘附仅占24小时蚀斑生物量的1.5％。到24小时为止，对釉质的粘附或由于细菌间粘附占口腔中蚀斑生物量的约10-20％。
固有细菌积累的这些测量结果不会检测出蚀斑细菌是否实际上被分裂。当以个体位点活细胞密度(见图1A)为基础图解说明蚀斑群体的活性生长群体间的相互关系时研究细菌的生长，其生长情况是显而易见的。在密度达到2,500,000-3,200,000[106.4-6.5]细菌/mm2时(达到这样的密度不依赖于所花时间的长短)，活性生长细胞数量有显著的增加。在该群体密度活性生长细菌数的大量增加表明粘附细菌不是分裂或生长缓慢，而是进入一个迅速生长期。
制成并放入体内釉质植入物的方法如下。将来自牛牙齿的釉质片切成带45°分叉壁的正方形，约3×3×1mm。用-SHERE-TUMICA数字卡尺(digital caliper)(Shere-Tumica，St.James，MN)对每片进行测量，然后于4℃存于蒸馏水中直到使用。在每个受试者上颌弓的藻酸盐印模的石模上，加工定做的牙冠，将釉质片压成VISIO-FIL复合物(ESPE-Premier，Norristown，PA)的球形片，用于上颌前臼齿和臼齿的脸面表面。形成的复合物是光滑且与牙釉质连续的，并且牙釉质片位于复合物内，以便只暴露其表面。然后将该牙釉质片放入牙冠中，用一尖探测器的尖端经一在定做的牙冠时制成的小凹槽可以移动。牙釉质片紧嵌在其相应的牙冠中防止除在暴露的表面上外，到处形成蚀斑。然后用一CONCISE正牙学粘结系统(3M，st.Paul，MN)将定做的牙冠用于相应的牙齿。
测量微生物组合物和总活细胞数的方法如下。将釉质片放在厌氧箱(Coy Anaerobic Chamber，Ann Arbor，MI)内的1.0ml预还原的厌氧灭菌(PRAS)稀释剂(L.V.Holdman and W.E.C.Moore，Eds.Anaerobic Laboratory Manual，Virginia PolytechnicInstitute and State University，Blacksburg，VA，124-127，1973)中并经柔和的声波处理20秒(Kontes Cell Disruptor；Kontes，Vineland，NJ)。将一等份的蚀斑样品系列稀释并铺板(Spiral Systems.Inc.Cincinnati，OH)。
在各种选择的培养基上完成各细菌种的培养。用含Trypticase大豆琼脂(BBLMicrobiology Systems，Cockeysville，MD)，5％去纤维蛋白的羊血，0.00005％维生素K3，0.0005％高铁血红素和0.001％NAD(Sigma Chemical Compang，St.Louis，MD)的补充血琼脂(SBA)培养基在37℃厌氧培养7天以确定可培养厌氧微生物菌丛的总数。数出SBA培养基上的黑色素沉积的厌氧杆菌，包括Porphyromonas gingivalis，Prevotella intermedia和Prevotellamelaninogenicus。梭杆菌属的菌种在SBA培养基上被鉴定为园形、完整、光滑的彩虹色菌落。在加入了0.1％亚碲酸钾(Difco Labs，Detroit，MI)的Mitis salivarius(MS)琼脂(Difco Labs，Detroit，MI)上数出了链球菌属的菌种。在10％氢-10％二氧化碳-80％氮的环境下，于37℃将这些平板厌氧培养2天，然后在室温厌氧培养24小时。根据已知方法使用立体显微镜和间接光，经菌落形态学可鉴定粘附的硬菌落，这些菌落可能包括血链球菌，Streptococcas gordonii和卵圆链球菌(并称为血液链球菌)。Mitis链球菌是园形、光滑和乳状的，包括温和链球菌和非粘附卵圆链球菌菌落。
用已知方法数MS琼脂和MS-杆菌肽培养基上的变异链球菌。在两种所用的任一种培养基中，变异链球菌的菌落数均是最高的。在改良的Rogosa-SL琼脂培养基(Difeo Labs，Detroit，MI)上数韦荣氏球菌属的菌种并用菌落形态学和革兰氏染色涂片鉴定。在改良巧克力(MC)琼脂上数嗜血杆菌属的菌种，然后按已知方法(Liljemark etal.，Infect Immun.46778；1984)在10％二氧化碳中，于37℃培养3天。在CFAT琼脂(Zycber and Jordan，J.Chin.Microbiology，15253-259，1982)上数放线菌属的菌种。对来自各受试者的代表性菌落类型首先进行过氧化氢酶反应试验。随后使这些菌株与Dr.George Bowden(University of Winnipeg，Winnipeg，Canada)友好提供的抗血清反应。利用该系统，放线菌分成粘性放线菌(类似Actinomyces naeslundii II)Actinomyces naeslundii I和Actinomyces odontolyticus。计算每平方毫米表面的可培养微生物菌丛(活细胞)总数和菌种的菌落形成单位总数。
通过掺入放射性标记的[甲基-3H]-胸苷和[C14]-腺嘌呤，测量薄层表面上活性生长细菌的实际数目。然后将蚀斑样品培养30分钟，从蚀斑样品中提取放射性标记的靶分子DNA和/或RNA，并计数。由于DNA合成贯穿于细菌群体的生命周期，所以这些核苷酸会标记所有的活性生长细胞。标记DNA也是有用的，原因在于它不会反转，因为在非生长细胞中不会发生合成过程。通过计算[甲基-3H]-胸苷的掺入量并被活细胞总数除，就可以计算cpm/细菌，并且该比率可以反映出作为全部活细胞一部分的活性生长细胞数的改变。放射性核苷酸掺入TCA不溶物质中可对实际DNA合成的测量而不是放射性核苷酸代谢有保证。发现在一种不破坏蚀斑形成的方法中，短时期(与最小细胞分裂时间相比)过量使用[甲基-3H]-胸苷和[C14]-腺嘌呤并重复取样是一种确定生长细菌群体的新方法。
活性生长群体的测量方法如下。将一等份声处理的蚀斑(0.3ml与0.1ml的[甲基-3H]-胸苷(45,000mCi/mmol，ResearchProducts International Corp.，Mt.Prospect，IL)和[C14]-腺嘌呤(270mCi/mmol，Amersham Research Products，ArlingtonHeight；IL)的混合物混合，使[甲基-3H]-胸苷和[C14]-腺嘌呤掺入定时的细菌蚀斑的三氯乙酸(TCA)不溶物质中。与蚀斑样品混合的最终核苷酸浓度为150mCi/ml(100-200nmole)[甲基-3H]-胸苷和65mCi/ml(200-250nmole)[C14]-腺嘌呤。蚀斑与放射性标记的核苷酸混合并在厌氧箱内培养30分钟。从箱中取出放射性标记的蚀斑样品，加入2.0ml的冷(4℃)10％(wt/vol)TCA终止培养，然后于4℃再提取30分钟。在Gelman GN-6纤维素滤器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)上收集沉淀，然后用5.0ml冷10％TCA清洗3次。然后将滤器放在小瓶中，干燥，加闪烁液计算。放射标记的掺入表示为每平方毫米釉质表面或每细菌(如由总CFU决定)每分钟[3H]或[C14]数。放射性标记是过量的。例如，如果E.coli细胞每细胞含9×10-15克的DNA，则25％的DNA是胸苷残基，然后将1百万倍以上的106.0细菌胸苷的基因组等同物加到各个反应混合物中。加入1百万以上的腺嘌呤基因组等同物。由于每个样品均被脉冲相同短的时间，所以，脉冲标记避免了确定细胞间比活性和同位素平衡的困难。
在薄层结合位点发生饱和的密度(约200,000-630,000[105.3-105.8])，[甲基-3H]-胸苷掺入细菌细胞的量为约3.7×10-4cpm/细菌。在活性生长时，每活性细胞[甲基-3H]-胸苷的总cpm为平均20×10-4cpm/细菌。若蚀斑样品中的细菌细胞得到稳定的生长能源，如蔗糖洗液，则密度达到约2,500,000到3,200,000细胞[106.4-6.5]时，cpm/细菌为160×10-4。参见实施例2。
表1比较在链球菌体内和体外作为DNA合成测量结果的3H-胸苷的掺入(3H-胸苷cpm每mm2密度 /细菌)x10-4在Todd Hewitt培养基[109细菌中过夜培养 /ml.液体] 2.5在饱和a时，链球菌明 200,000-630,000 3.7显粘附到釉质上a在牙蚀斑釉质SILUX或2,500,000-20(160用VISIO-Dispers中的细菌b3,900,000 蔗糖洗液)固定在马来酸酐平板 625,000 5.4和培养基b上的细菌c固定在马来酸酐平板 625,0000 80和STARTc上的细菌a体内数据，16个位点平均80Zb体内数据，22个位点平均80Zc体外检测，35个实验平均80Z实施例2-检测用蔗糖、葡萄糖或水清洗对细胞生长的影响8名健康成人，4名男性和4名女性参加研究。按实施例1中描述的方法，将牛釉质片放在上颌第一臼齿和第一与第二前臼齿。
对每受试者有6个釉质片的全部8个受试者均进行6个小时的试验。在6小时的试验期间，每隔15分钟每个受试者用10ml水，10％葡萄糖(无蔗糖葡萄糖w/v)或10％蔗糖(w/v)(Sigma，St.Louis，Missouri)漱口1分钟，第一天受试者用葡萄糖洗，第二天用水，第三天用蔗糖。在体内2小时后，将2个釉质片随机从其牙冠中取出。4小时后，又按上述取出2个釉质片，6小时后，取出最后的2片并处理。从口中取出后，立刻按实施例1中所述，就活细胞计数组份对蚀斑样品进行处理。
已知蔗糖是促进粘附和促进细菌生长的物质。预期存在过量蔗糖的情况下，当固有细菌群体粘附到釉质植入物上后，立即表现出高水平的活性生长。意外发现，在正常饮食条件下，与实施例1描述的内生蚀斑相似，活的粘附细菌在其达到2,500,000-3,200,000[106.4-6.5]的密度时，提高了其活性生长水平。并不意外地是活性生长水平超过了未清洗过的釉质植入物的。意外的是这种增加发生在活细胞密度达到2,500,000-3,200,000[106.4-6.5]时。另外，未料到葡萄糖和水清洗均增加活性生长细胞数。实施例3-使用粘附抑制剂的群体密度对照按实施例1中所述，将牛牙釉质片放在牙上。在60℃，用去离子水形成十八烷基硫酸钠盐(Aldrich Chemicals Co.，Milwaukee，WI)溶液，称量十八烷基硫酸钠(SOS)使之足以达到5×10-3M。由于室温下SOS在水中的溶解性问题，所以实际浓度可能多少低于5×10-3。只用澄清的上清液。
将釉质片与SOS的澄清上清液培养30分钟，然后用水洗涤5分钟以除去过量的溶液，只剩下定向的十八烷基硫酸盐单分子层。具有结合SOS的釉质片称为SOS-牙釉质。
从两人中收集parafilm刺激的全部唾液，以10,000×g离心10分钟澄清。1ml澄清并混合的唾液然后与牙釉质片或SOS牙釉质片培养，在室温缓慢振动培养15分钟。对照组与磷酸盐缓冲液一起培养(Gibbons and Etherden。Infect.Immun.，3652-58(1982))。用磷酸缓冲液洗涤唾液包被的牙釉质片(SC-牙釉质)和唾液-包被的SOS-牙釉质片(SC-SOS-牙釉质)(Gibbons和Etherden，见上文)。
用Wilhelmy Balance(Cahn Instruments，DCA-322，Cerritos，CA)评估牙釉质，SOS-牙釉质，SC-牙釉质和SC-SOS-牙釉质的疏水性。薄片的周长为17.84mm。浸没的时间间隔为1秒钟，平台速度为148.39微米/秒，表2中列出了牙釉质和用SOS处理的牙釉质，和SC-SOS-牙釉质的动力接触角。
将3个牙釉质片和3个SOS-牙釉质片随机放在实施例1中所述定做的牙冠中，将SOS处理的牙釉质对体内蚀斑形成的影响与两受试者中的釉质比较。在2，4，8和24小时后，每个受试者检测两次蚀斑的形成。按实施例1中所述，数出牙釉质和SOS-牙釉质上的活细菌总数。在2，4，8和24小时后，如图3所示，发现SOS-牙釉质相对牙釉质上，活细菌数很低(几何平均数)。
表2牙釉质角度次数1 2 3Ad 40 0 0Re 0 0 0Ad 64 35 29Re 0 0 0SOS-牙釉质角度次数1 2 3Ad 10371 56Re 13 19 22Ad 10360 60Re 28 33 34SC-SOS-牙釉质角度次数1 2 3Ad 57 0 0Re 0 0 0Ad 68 51 49Re 33 34 36实施例4-使用疏水物质的群体密度对照用一种相似的在体模型研究8名成人口腔中牙齿的细菌集落现象。在本试验中所用的8名成人受试者是牙科学生或专业微生物学家。将牛牙釉质片，SILUS修复剂片(3M，St.Paul，MH)，VISIO-DISPERS光-治疗的复合物牙修复剂片(ESPE-Premier，Norristown，PA)(每片的面积为约10mm2)直接并同时固定在6个对侧前臼齿和第一臼齿的定做牙冠内，并放置不同的时间间隔以积累牙蚀斑细菌。
按上文实施例1中所述，将来自拔出的牛牙的牛釉质片切成正方形。在EXPRESS乙烯聚硅氧烷注册物质(3M，St.Paul，MN)制成的模型中，形成复合树脂片，VISIO-DISPERS光处理的复合牙修复剂(ESPE-Premier，Norristown，PA)，和SILUX修复剂(3M，St.Paul，MN)，其中用预先制成的牛牙釉质片在EXPRESS聚硅氧烷物质中形成一个模子。将复合物质用于预先制成的模子，并在上面压一个聚酯薄膜带以形成一个光滑平整的表面。然后将复合物光处理40秒。从模子中取出复合树脂片，将边缘作最后加工，并测量表面面积。用中等大小精细的SOF-LEX盘(3M，St.Paul，MN)抛光薄片的外表面以刺激用于临床的复合物质并除去富树脂层。
按实施例1中所述制成规定大小的片状牙套。按实施例1所述，在各种选择培养基上培养各细菌种。在前述的间隔取出釉质片并放在如实施例1中所述的1.0ml PRAS稀释剂中，然后声波处理。按实施例1中所述，将[甲基-3H]-胸苷和[C14]-腺嘌呤掺入定时的细菌蚀斑的三氯乙酸不溶物质中。
图4说明由于只有少数薄片达到与刺激或活性细菌生长相关的群体密度，因此，少数VISIO-DISPERS(ESPE-Premier，Norris town，PA)或SILUX(3M，St.Paul，MN)片表现出活性生长细菌的快速生长。当用Wilhelmy天平检测有关的疏水性时，这些表面比牙釉质有更强的疏水性，而且唾液包被的VISIO-DISPERS(ESPE，Norristown，PA)和唾液包被的SILUX(3M，St.Paul，MN)也比唾液包被的牙釉质有更强的疏水性。具体地说，8个重复的平均(±SE)后斜角测量值如下牙釉质16.1(±2.3)，SC-牙釉质4.99(±2.6)，VISIO-DISPERS复合物23.5(±0.64)，SC-VISIO-DISPERS复合物14.1(±2.3)，SILUX恢复剂29.2(±2.7)，SC-SILUX恢复剂14.6(±0.89)。唾液包被的所有表面的疏水性均显著地低于未包被的原始表面(配对的t-检验)。另外，用重复测量ANOVA，经Scheffe f检验发现SC-SILUX恢复剂颗粒的疏水性明显高于SC-牙釉质的。意外发现这种疏水性的“透过”，而且保存的唾液薄片可能被修饰以便传递绝大部分的疏水性。实施例5-制备含SMR因子的组合物从S.gordonii Challis ATCC No.35105菌株的上清液和琼脂培养物中分离含SMR因子的组合物。简而言之，将从含Challis菌株的SBA平板(在SBA上将细胞菌苔培养过夜)刮下的接种物加到Klett烧瓶(300ml容量，每20ml TH培养基倒一个平板)中，然后在Todd Hewitt培养基(TH培养基，Difco Labs，Detroit，MI)中于37℃培养接种物(Klett约25)。细胞密度开始增加后(Klett约26-28)，在不同生长阶段，即生长早期(约10分钟)、对数生长中期(约60分钟)和静止期(约160分钟)取出无细胞上清液。
然后从琼脂板表面刮下在SBA平板上作为菌苔培养的菌株Challis细胞，在TH培养基中于室温下培养1小时(每10ml TH培养基1个刮过的平板)，然后离心从培养基中除去细胞。另外，除去培养的细胞后，在10ml TH培养基中，将刮过的SBA平板培养1小时，离心(10,000×g，10分钟)从培养基中除去残余的细胞。
此外，将从自愿者中收集并在约0℃冷冻的所有澄清唾液用磷酸盐缓冲液(Gibbons and Etherden，Infect Immun.，3652-58，1982)稀释(1∶1，体积/体积)并用过滤器灭菌。用上述方法，制得下面的培养液磷酸盐缓冲液(对照)，TH培养基(对照)，唾液/磷酸盐缓冲液，生长早期上清液，对数生长期上清液，SBA刮下的细胞，刮过的SBA平板。实施例6-用组合物体外引发细菌生长从上文实施例1中所述的牙釉质片制备细菌细胞包被的牛薄片。在Kofler橡胶底(Coe Labs，Chicago，IL)内的无菌平顶微离心管(1.5ml，Fischer Scientific，It asca，IL)中制作用于牙釉片的定做的薄片套。从2-4名志愿者收集全部唾液，在约0℃冷冻，以10,000×g离心10分钟澄清，然后滤器灭菌。放置的牙釉片与无菌唾液培养30到45分钟，缓慢倒出唾液，用无菌磷酸盐缓冲液清洗2次未粘着的唾液。
然后用S.gordonii challis ATCC No.35105覆盖唾液包被的牙釉片。简而言之，细菌在Todd Hewitt培养基(TH培养基，DifcoLabs，Detroit，MI)中培养过夜。从培养箱中直接取出细菌，与培养物上清液混合，将1.0ml混合物放在含唾液包被的牙釉片的微离心管中。含细菌的微离心管以10,000×g在室温离心10分钟。离心后，从粘附的S.gordonii ATCC No.35105细胞中倒出非粘附细菌，然后将含粘附细胞的试管放在厌氧箱中。
然后在存在上述实施例5中，含SMR因子的培养液的情况下，培养细菌包被的牙釉片。
为了评估细菌生长，将薄片移到24孔平底箱(Corning GlassWorks，Corning NY)中，随后与细菌生长抑制剂或促进剂一起培养。将12个牙釉片植入为每个试验准备的定做的合适的套中。试验材料紧贴在橡胶底内，使细菌不会粘附在其后面或其周围。
生长评估包括将下列表3所列的各种液体与12个牙釉片放在一起进行2小时的培养。对于每个薄片，按实施例1和2中所述确定细菌细胞生存性(每mm2表面的活细胞数)。
为了确定活细胞数，取出薄片，放在厌氧箱(Coy AnaerobicChamber，Ann Arbor，Michigan)内1.0ml预还原的厌氧灭菌稀释剂(PRAS)中，声波处理20秒(Kontes Cell Disruptor，Kontes，Vineland，NJ)。将蚀斑样品系列稀释并铺(Spiral Systems，Ine.，Cincinnati，OH)在血液补充的琼脂和Mitis-salivarius(DifcoLabs，Detroit，MI)琼脂培养基上。
表3培养2小时后以缓冲液为基培养液 的CFU/mm2础的百分数磷酸盐缓冲液(对照) 16,000 100％TH培养基(对照) 16,800 105％唾液/磷酸盐缓冲液 40,000 250％对数早期上清液 78,000 488％对数中期上清液 41,000 256％SBA上刮下的细胞 98,800 618％刮过后的SBA平板 34,000 213％实施例7-SMR活性的体外检测为了评估SMR活性，开发另一种体外检测法。
细菌(0.01－2.5×107)优选地与Reacti-BindTM马来酸酐活化的聚苯乙烯带状平板(Pierce，Rockford，Ill)结合，根据制造商的说明优选的浓度为1×108ml(200μl每孔或2×107每孔)，在30-35℃以3000rpm离心10分钟(PR-6000 International)。可替换的，细菌在Immulon(Dynateeh Laboratories)96孔平板或Coming Brand Easy Wash ELISA Strip孔上离心(以相似的浓度，优选的为2×107每孔)。优选的细菌是S.gordonii Challis ATCCNo.35105，平板是96孔马来酸酐活化的平板。细菌浓度优选的是覆盖约20-40％孔表面积的量。
将热(35-37℃)的含SMR的上清液和对照上清液或分离的SMR制备物加到孔中，于37℃培养30分钟。培养30分钟后，加入放射性标记的核苷酸(见实施例1)，并将细菌再培养30分钟。在存在放射性标记核苷酸的情况下培养后，洗涤各孔，然后加到闪烁瓶中计数。与核苷酸培养后，在纤维素滤器上洗涤前，还要不时捕捉在SMR放射性标记的培养液中的游离细胞。不时从平板中除去细菌和TCA沉淀，然后分折TCA不溶物质中的放射活性。在大多数情况下，掺入到TCA不溶物质中的放射活性量与未用TCA沉淀的平板中检测到的放射活性量相同。时常将平板培养更长的时间。
将用马来酸酐进行的平板上的细菌固定作为加到每mm2孔中细菌量的函数进行分析。用10μCi/ml[甲基-3H]-胸苷预标记的结合细胞，确定被结合的细菌(Liljemark and Bloomguist，Infect.Immunol.，34935-941(1981))。结果列于图5A。该结果表明每mm2马来酸酐结合的细菌数随加到孔中的细菌数线性增加。按所述完成细菌与马来酸酐、Immulon和Easy Wash带状平板的结合。结果表明细菌数随加到孔中的细菌数而增加，参见图5B。
图6表示于存在或没有分离的SMR因子(见实施例8)的情况下，将[甲基-3H]-胸苷掺入到与马来酸酐结合的S.gordoniiChallis细胞中。结果表明与纯化的SMR制品一起培养60分钟后，与对照细胞(见箭头)相比，在暴露于SMR因子的细胞中，[甲基-3H]-胸苷的掺入增加了约15倍。
将[甲基-3H]-胸苷掺入到体外暴露于SMR因子的结合S.gordonii Challis中的量与[甲基-3H]-胸苷掺入体内粘附蚀斑群体的进行比较，按实施例所述，作为密度的函数。结果列于实施例1的表1中。
结果说明在密度为约2,500,000到3,900,000[20106.4-106.5]时，[甲基-3H]-胸苷掺入蚀斑细菌体内的量为约20×10-4cpm/细菌，在密度为约630,000细菌/mm2时，掺入粘附于马来酸酐的细菌中的量为约80×10-4cpm/细菌。密度为200,000-630,000时体内蚀斑细菌与密度为625,000没有SMR因子时的体外细菌相比，掺入相同程度的[甲基-3H]-胸苷。实施例8-分离并描述SMR因子特征从链球菌菌株以及E.coli ATCC No.55535的生长培养物中可以得到SMR因子。优选的生产菌株是S.gordonii Challis ATCC No.35105。
在实施例5中描述了从细菌培养物得到SMR的方法。在另一种可替换的方法中，可以使用下列生产SMR的方法。在37℃于Todd-Hewitt培养基(TH)中使细菌生长16-24小时以制备接种物(链球菌用厌氧，E.coli用厌氧或有氧)。制备100μl接种物和2mlTH培养基的混合物，然后放在琼脂培养平板的上部。优选的，如实施例1中所述，琼脂培养基是补充血的琼脂。另外，也可以用TH琼脂或RMP1-1640肉汤(JRH Biologicals Inc.，Lenera，Kansas)加1.5％琼脂(Difco)。优选地是，TH与接种物混合。可替换地使用RPMI-1640或FMC肉汤(Terlecky et al.，Infect.Immunol.，11 649-655(1975)；Terlecky and Shockman，Infect.Immunol.，11656-664(1975))。将含培养基加细菌-琼脂界面的平板于37℃竖直厌氧培养16-24小时。
培养后，各平板加入5ml培养基。优选地是，培养基为TH或FMC肉汤，可替换地用RPMI-1640。从润湿的平板上刮下细胞，然后与加入的液体混合。室温下约20分钟后，以10,000×g将液体混合物离心10分钟，以得到含SMR因子的全培养基。离心后，按制造商的说明，用Centriprep浓缩器(Amicon Inc.，Beverlg，MA)离心处理无细胞上清液，并除去分子量约3000的部分。这样得到SMR因子，含分子量低于约3000的部分。
用相同的方法(培养、刮平板、离心、离心制备(centriprep)，从E.coli ATCC No.55535生产SMR。也可以用其它菌株制备SMR。
不用细菌接种物，经相同的方法(培养、刮平板、离心、离心制备)生产对照液，制成对照制品，根据培养后用于接种和/或加到平板上的培养基命名，例如，TH对照。
通过确定在前述的细菌中[甲基-3H]-胸苷的掺入量，检测不同来源的SMR因子在不同培养基中刺激三种不同细菌菌株生长的能力。结果列于表4。
表4[甲基-3H]-胸苷的掺入cpm×10-4/细菌SMR因子 用于生产SMR 固定的菌株S.gordoniiS.gordonii的细菌源的培养基ChallisaS7dE.colibS.gordonii TH 801.1 39ChallisaRPMI-1640 48ND NDFMC58ND NDE.colibTH 411.4 14对照cTH 5.8 1.4 6.5RPMI-1640 10ND NDFMC12ND NDa＝S.gordonii Challis ATCC No.35105。b＝E.coli 149，ATCC No.55535。c＝SMR因子培养和分离的对照。d＝S.gordonii菌株S7(SKB)。ND＝无数据。
结果表明在三种肉汤中，由S.gordonii Challis ATCC No.35105或E.coli ATCC No.55535生产的SMR对于刺激Challis或E.coli的微生物生长均是有效的。这些研究结果表明革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均生产SMR因子，而且革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌对两种来源的SMR因子均可产生反应。Challis的SMR因子活性最大。
进行3000分子量膜排阻前全培养基在TH肉汤中生产的SMR因子用各种试剂处理并暴露于不同条件，然后分析SMR活性。相似地处理、暴露对照TH培养基。用蛋白酶K、胰蛋白酶、DNAase，和RNAase(Sigma)在每种酶的标准条件下处理全培养基SMR。酶处理的SMR仍有生物学活性。全培养基SMR、分离的SMR因子在煮沸、冷冻和高压灭菌后仍有生物学活性。这些结果表明TH培养基的SMR有抗胰蛋白酶、蛋白酶K、DNAase、RNAase的特征，并且抗热和冷冻。实施例9-SMR因子对于增强[甲基-3H]-胸苷掺入不同种细菌的能力将不同种和属的细菌固定在96孔马来酸酐平板上以便由[甲基-3H]-胸苷的摄取确定分离的SMR因子是否可刺激微生物生长。如前所述(实施例7)将细菌与SMR因子或对照制品一起培养。按实施例8所述从S.gordonii Challis菌株ATCC No.35105得到SMR因子，然后分离。结果列于表5。
用与TH对照一起培养的相同细菌菌株的cpm/孔除与SMR因子一起培养的这些细菌的cpm/孔，确定[甲基-3H]-胸苷掺入的增加倍数。
表53H胸苷的掺入超过细菌 对照的增加倍数Streptococcus gordonii S7 0.8S.gordonii Blackburn 12.8S.gordonii 12NA 7.6Streptococcus Darasanguis FW213 8.5变异链球菌IB1600 18.2血链球菌133-791.6肺炎链球菌7.4化脓链球菌10.5粪链球菌ATCC 292129.4粪链球菌ATCC 1943 7.5金黄色葡萄球菌7.4表皮葡萄球菌 7.4铜绿假单胞菌 11.1E.coli ATCC No.55535 9.1E.coli菌株TL 6.3副流感嗜血杆菌HP-28 7.4这些结果表明来自S.gordonii Challis菌株ATCC No.35105的SMR因子可刺激革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌菌株的微生物生长。实施例10-制备带有指示微生物生长的报告基因的遗传工程S.gordonii Challis菌株表达淀粉酶的细菌菌株说明了SMR生长因子的生长刺激作用。已将淀粉酶基因插入S.gordonii Challis ATCC No.35105菌株的16S核糖体RNA基因(16S rDNA)，因为在SMR诱导的生长突进期间，有可能核糖体基因的转录显著提高。在16S rDNA中其它报告基因的插入，或者在其它SMR可诱导的细菌操纵子中，报告基因的插入可能会相似地促进研究改进SMR检测方法。S.gordonii Challis ATCC No.35105菌株没有内源淀粉酶基因或酶活性。优选地是选择宿主细菌细胞中不存在的报告基因和基因产物。
按如下所述构建该检测法中所用的细菌菌株。用聚合酶链反应(PCR)经酶法扩增链球菌菌株Challis即ATCC No.35105 16S rDNA的一内部片段。按Bensing等人(J.Bacteriol.，1757421(1993))的描述，由该菌株纯化基因组DNA。经检查保存在Ribosomal DNA数据库，Ribosomal Data Base，(Dept.of Microbiol.，Univ ofIllinois at Urbana/Champaign)中的链球菌rDNA的保守序列，在预测的该基因的高度保守区内选择一20bp和一18bp的序列。按制造商的说明，用一Applied Biosystems 391自动序列仪合成寡核苷酸引物。用5′-TCAGGAATTCGGCTAACTACGTGCCAGCAG-3′(SEQ IDNO1)和5′-GAGCGGATCCCCCGGGAACGTATTCAGC-3′(SEQ ID NO2)这些序列作为PCR引物，它们大约相当于S.gordonii ChallisATCC No.35105 16S rRNA基因的碱基554-573的预测序列和碱基1462-1479的互补物(将一个EcoRI限制性裂解位点加到5′末端，一个BamHI位点加到3′末端)。用由75ng S.gordonii ChallisATCC No.35105染色体DNA，1μM的各引物，300μM的各dNTP，10％二甲基亚砜和4mM MgCl2组成的模板完成PCR反应(F.M.Ausubel et.al.，Current Protocol in Molecular Biology，NewYork，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1987))。
用来自New Engladn Biolabs的Vent DNA聚合酶，在Hybaid热循环器中完成扩增。PCR后，用琼脂糖凝胶电泳检测为PCR的初级产物的、预测大小(900bp)的扩增DNA片段。用EcoRI和BamHI酶切该片段(由于在扩增的DNA中存在一个内部的EcoRI位点，所以从该片段的5′末端去掉了100bp)，用标准的重组DNA方法连接到载体pRQ200的位点中以产生如图7所示的质粒pMSP16Samy。按Lane等人(见上文)所述可构建质粒pRQ200，而它实际得自马里兰大学的Dr.Yasbin。将该质粒转化到E.coli DH5αMCR(BRL/Gibco)。选择红霉素抗性转化体。
在图7中标出了与无启动子淀粉酶基因相邻的rDNA序列的位置。然后将pMSP 16Samy加到感受态S.gordonii Challis ATCC No.35105细胞中，以便按Macrina等人(Gene，19345(1982))所述，，经感受态细胞转化来摄取pMSP 16Samy。按Lane等人(见上文)所述，该质粒不能自我复制，因此，只有在经克隆的rDNA序列和基因组中的序列之间的重组将该质粒整合到染色体中，才能得到表达pRQ200红霉素抗性标记的转化体。图8中列出了所述重组体的预测结构。由于相信在细菌如S.gordonii Challis ATCC No.35105中有约7个rDNA基因的重复序列，所以可能会在不同转化体中的不同位置上发生整合。因此挑出并纯化了约20个不同的转化体，检测淀粉酶活性。在下面描述的检测中，用该方法得到两个表达淀粉酶的菌株MSP812和MSP818(分别是ATCC 69528和ATCC 69529)，它们被选用于在该检测中。
菌株MSP812是一个在微生物生长过程中产生淀粉酶活性的S.gordonii Challis ATCC No.35105菌株，并于1994年1月6日寄存在ATCC，Rockville，MD，保藏号为69528。菌株MSP818是一个淀粉酶活性为微生物生长的函数的S.gordonii Challis ATCC No.35105菌株，并于1994年1月6日寄存在ATCC，Rockville，MD，保藏号为69529。这些微生物的其它相关特征为它们是以链状生长的革兰氏阳性球菌并且是红霉素抗性。实施例11-在携带有关生长报告基因的遗传工程细菌菌株中，微生物生长的体外检测法用按实施例10所述构建的细菌菌株检测SMR因子。用淀粉平板淀粉酶检测法，监测细菌中淀粉酶的生产，在存在或没有分离的SMR因子的情况下培养。在Todd Hewitt培养基(TH，Difco)中使S.gordonii Challis ATCC No.35105(阴性对照)、S.gordoniiChallis ATCC No.65928，或S.gordonii Challis ATCC No.69529的细菌培养物于37℃厌氧生长过夜(约109细胞/ml)。离心收集细菌，用等体积TH洗涤，并重悬在等体积TH中。在含需检测的SMR因子或对照提取物的TH中，将这些重悬的细菌稀释10倍。将4μl这些悬浮液接种到含0.2％淀粉的Todd Hewitt琼脂平板上。制备一系列含相同接种物的复制平板，在厌氧箱中于37℃培养。在30分钟的间隔，从培养箱中取出平板并浸在Lugol′s溶液(0.5％碘，1％碘化钾)中。
表6中列出了淀粉平板检测结果。在淀粉酶活性降解淀粉区形成一个清楚区的平板区域明显对映该细菌生长的清晰区周围的黑色背景。在SMR因子活性存在的情况下，将有一个或两个SMR处理的细菌生产更多淀粉酶的时间点(通常2-3小时)，因此与在相同平板上生长的对照处理的细菌相比，在细菌生长区周围有一个更强的清楚的“晕”。数据列于表6。
表6菌株 清晰区在于1小时 1.5小时 2小时 2.5小时 3小时 4小时Challis0 00 00 0ATCC No.35105pMSP812(对照) 0 00 01 3pMSP812(开始) 0 02 33 3ATCC No.69528pMSP818(对照) 0 00 12 3pMSP818(开始) 0 12 33 3ATCC No.695290-细菌菌落周围没有清晰区1-围绕细菌菌落边缘有清晰区2-清晰的可观察区小于1mm3-细菌菌落周围有明确的清晰区。
在体外试验中还要检测转化的和非转化的Challis菌株应答SMR因子的能力。简而言之，按实施例7所述，将S.gordonii ChallisATCC No.35105，S.gordonii Challis ATCC No.65928，或S.gordonii Challis ATCC No.65929结合到马来酸酐平板上。
表7[甲基-3H]-胸苷cpm×10-4/细菌的掺入细菌菌株 SMRTH(对照)Challis菌株ATCC No.35105 805Challis菌株MSP812ATCC No.69528 107 4Challis菌株MSP18ATCC No.69529 147 5结果表明转化菌株对SMR因子的反应与非转化菌株相似。这并不意味着限制本发明，在所描述的是否应答SMR因子的淀粉酶检测中，转化菌株具有测量微生物生长的实用性。
序列表(1)一般资料(i)申请人Bloomquist，Cynthia G.
Douglas，William H.
Dunny，Gary M.
Liljen′ark，Wiliam F.
Reilly，Bernard E.
(ii)发明题目治疗或控制细菌感染的组合物和方法(iii)序列数2(iv)通讯地址(A)收件人Merchant & Gould(B)街道3100 Norwest Center(C)城市Minneapolis(D)州Minnesota(E)国家U.S.A.
(F)邮编55402(v)计算机可读形式(A)介质类型Floppy盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)目前的申请资料(A)申请号(B)申请日
(C)分类(vii)优先权申请资料(A)申请号US 08/029,675(B)申请日11-MAR-1993(C)分类(vii)优先权申请资料(A)申请号US 08/004,971(B)申请日15-JAN-1993(C)分类(viii)代理人/代理资料(A)姓名Kowalchyk，Katherine M.
(B)注册号36,848(C)参考/备案号600.289-US-01(ix)电讯资料(A)电话612-332-5300(B)电传612-332-9081(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO1TCAGGAATTC GGCTAACTAC GTGCCAGCAG30(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO2GAGCGGATCC CCCGGGAACG TATTCAGC28
权利要求
1.一种预测粘附于某一表面的细菌何时会表现出活性生长的方法，该方法包括下列步骤a)确定在表面上活细菌的第一群体密度，b)将第一群体密度与第二群体密度进行比较，所述第二群体有刺激或增强的活性生长细菌与活细菌比例，和c)在第一群体密度大于第二群体密度时，预测活性细菌生长。
2.权利要求1的方法，其中所述(b)的密度在约400,000细菌/mm2到约6,300,000细菌/mm2之间。
3.权利要求1的方法，其中细菌生长发生在对细菌感染敏感的表面上。
4.权利要求1的方法，其中细菌生长发生在牙植入物表面。
5.权利要求1的方法，其中细菌生长发生在植入的生物材料上。
6.一种预测某一表面上细菌活性生长的方法，该方法包括下列步骤a)确定在表面上活性生长细菌的群体密度，b)确定在表面上活性生长细菌的群体，c)计算在表面上活性生长细菌与活细菌的比率，并d)当步骤c中的比率为约5×10-4∶1到20×10-2∶1时，预测在表面上的活性细菌生长。
7.权利要求6的方法，其中通过将过量的标记核苷酸加到细菌中，经过少于细菌最小细胞分裂时间的一段时间，让细菌生长一段时间以使标记核苷酸掺入细菌中，鉴定掺入到细菌DNA中的标记核苷酸的量，从而确定活性生长细菌群体。
8.权利要求7的方法，其中标记核苷酸选自放射性元素标记的嘌呤类和嘧啶类化合物。
9.权利要求7的方法，其中标记的核苷酸选自[甲基-3H]-胸苷和[C14]-腺嘌呤和其混合物。
10.权利要求6的方法，其中步骤c的比率在约10×10-4∶1到40×10-4∶1之间。
11.一种抑制在某一表面上细菌生长的方法，该方法包括下列步骤a)通过将细菌的群体密度保持在与增强或刺激的群体中生长细胞与活细胞的比例有关的群体密度下，来控制表面上的细菌群体。
12.权利要求11的方法，其中通过限制粘附促进剂与细菌的接触，来控制细菌在表面上的群体密度。
13.权利要求12的方法，其中粘附促进剂选自多肽，糖蛋白和碳水化合物。
14.权利要求11的方法，其中通过用粘附抑制剂修饰表面的疏水性，来控制细菌在表面上的群体密度。
15.权利要求14的方法，其中粘附抑制剂是十八烷基硫酸钠。
16.权利要求11的方法，其中通过选择平均动力接触前倾角大于约60°和平均动力接触后倾角大于约20°的物质来控制细菌在表面上的群体密度。
17.权利要求16的方法，其中平均动力接触前倾角大于约90°。
18.权利要求11的方法，其中细菌生长发生在含水液体中，所述含水液体选自体液、血清、含碳水化合物的液体、含多肽的液体、含糖蛋白的液体，或水。
19.含有引发微生物复制因子的组合物，其中，引发微生物复制因子是由细菌生产的，并且用大小排阻膜过滤法测量，其分子量小于约3000。
20.权利要求19的组合物，其中引发微生物复制因子对高压灭菌有抗性。
21.权利要求19的组合物，其中引发微生物复制因子是从血液链球菌中分离的。
22.权利要求19的组合物，其中引发微生物复制因子是从S.gordonii Challis ATCC No.35105菌株中分离的。
23.根据权利要求19的组合物，其中引发微生物复制因子是从E.coli 149，ATCC No.55535菌株中分离出的。
24.根据权利要求19的组合物，其中引发微生物复制因子刺激细菌生长。
25.权利要求19的组合物，还含有选自阳离子、阴离子、酶、转运多肽、辅酶、辅因子和多肽的组分。
26.权利要求19的组合物，其中在群体密度低于与增强或刺激的群体中活性生长细胞与活细胞的比例相关的密度下，引发微生物复制因子刺激细菌的生长。
27.权利要求19的组合物，其中引发微生物复制因子刺激或增强群体中细菌细胞的生长，以使群体中生长细胞与活细胞的比率达到约5×10-4∶1到20×10-2∶1。
28.权利要求19的组合物，其中引发微生物复制因子是从在表面上生长的细菌中分离的。
29.权利要求20的组合物，其中引发微生物复制因子是从悬浮液中生长的细菌中分离的。
30.一种提高抗微生物剂效力的方法，该方法包括下列步骤于存在权利要求19的引发微生物复制因子的情况下，将细菌与抗微生物剂接触以引发细菌的活性生长。
31.根据权利要求30的方法，其中抗微生物剂是细菌特异性的。
32.确定一种试剂是否抑制或增强引发微生物复制因子的活性的方法，包括下列步骤a)将细菌群体与待测的增强或抑制引发微生物复制因子的试剂和权利要求19的引发微生物复制因子接触，以形成处理过的群体，b)确定处理过的群体中生长细菌的比例；和c)通过将处理过的群体中生长细菌的比例与经引发微生物复制因子接触的细菌群体中的生长细胞比例进行比较，来确定待测试剂对引发微生物复制因子起增强或是抑制作用。
33.根据权利要求32的方法，其中通过测量每细菌放射性元素标记的核苷酸的掺入量来确定生长量。
34.根据权利要求32的方法，其中的细菌是S.gordoniiChallis ATCC No.35105。
35.根据权利要求32的方法，其中的细菌是与表面结合的。
36.根据权利要求32的方法，其中待测的抑制或增强引发微生物复制因子的试剂是与表面结合的。
37.一种测量引发微生物复制因子对细菌的活性的方法，包括下列步骤a)将细菌群体与权利要求19的引发微生物复制因子接触以形成处理过的群体；和c)通过将处理过的群体中的微生物生长与未处理过的细菌群体中的微生物生长进行比较以确定微生物生长的刺激量。
38.根据权利要求37的方法，其中通过测量每细菌放射性元素标记的核苷酸的掺入量，确定微生物的生长。
39.根据权利要求37的方法，其中细菌群体是S.gordoniiChallis ATCC No.35105的在生物学上纯一的群体。
40.根据权利要求37的方法，其中细菌群体是与表面结合的。
41.一种刺激微生物生长的方法，包括下列步骤将一群体与对于增加细菌群体中活性生长细胞与活细胞的比例有效量的权利要求19的引发微生物复制因子接触。
42.根据权利要求41的方法，其中使群体中活性生长细胞与活细胞的比例增加到约5×10-4∶1到20×10-2∶1的比率。
43.根据权利要求40的方法，其中细菌群体是与表面结合的。
44.根据权利要求41的方法，其中细菌群体在悬浮液中。
45.一种遗传盒，含有a)与第二DNA序列3′末端相连的编码细菌报告基因的第一DNA序列，b)与其表达受细胞生长协调调节并位于细菌染色体上的基因或其部分杂交的第二DNA序列，以形成遗传盒，其中第二DNA序列用于使遗传盒或其部分重组并整合到细菌染色体上的基因中。
46.根据权利要求45的遗传盒，其中第一DNA序列编码细菌淀粉酶。
47.权利要求45的遗传盒，其中第二DNA序列编码链球菌16S核糖体RNA基因部分。
48.根据权利要求45的遗传盒，还含有与第一和第二DNA序列相连的选择性标记基因。
49.一种含有权利要求45的遗传盒的质粒。
50.一种含有权利要求45的遗传盒或其部分的细菌菌株，所述遗传盒或其部分被稳定地整合到位于启动子控制下的细菌染色体上，其表达受细胞生长的协调调节。
51.根据权利要求50的细菌菌株，其中细菌宿主细胞是S.gordonii Challis菌株MSP818 ATCC No.69529。
52.根据权利要求50的细菌菌株，其中细菌宿主细胞是S.gordonii Challis菌株MSP812 ATCC No.69528。
53.一种含有权利要求45的遗传盒或其部分的细菌菌株，其中细菌菌株没有编码细菌报告基因产物的内源DNA序列。
54.一种测量引发微生物复制因子的活性的方法，包括下列步骤a)提供一细菌群体，其中细菌群体含有在启动子控制下的、其表达受细胞生长协调调节的稳定整合的遗传盒或其部分，其中该盒含有(i)编码细菌报告基因产物的第一DNA序列，它相连于第二DNA序列的3′末端，(ii)与其表达受细胞生长协调调节并位于细菌染色体上的基因或其部分杂交的第二DNA序列，以形成遗传盒，其中第二DNA序列与所述基因或其部分有足够的序列一致性以使所述遗传盒或其部分重组并整合到细菌染色体上的基因中。b)将细菌群体与引发微生物复制因子接触以形成处理过的群体；和c)通过与末处理过的群体中每单位时间每细胞报告基因产物的数量进行比较，测量处理过的群体中每单位时间每细胞报告基因产物的数量，来确定微生物生长的量。
55.一种测量微生物生长的方法，包括下列步骤a)提供一细菌群体，其中细菌群体含有在启动子控制下的、其表达受细胞生长率协调调节的稳定整合的遗传盒或其部分，其中所述盒含有(i)编码细菌报告基因产物的第一DNA序列，它与第二DNA序列3′末端相连，ii)与其表达受细胞生长协调调节并位于细菌染色体上的基因或其部分杂交的第二DNA序列，以形成所述遗传盒，其中第二DNA序列使所述遗传盒或其部分重组并整合到细菌染色体上的基因中；和b)确定群体中报告基因产物的数量。
全文摘要
本发明提供一种引发微生物复制因子，以及检测并使用引发微生物复制因子的方法。可以用引发微生物复制因子刺激悬浮液中或与表面结合的细菌的生长。还鉴定了抑制或增强引发微生物复制因子的试剂。本发明还描述了处理或控制结合于表面上的细菌生长的方法。粘附于表面上的细菌的繁殖和代谢均不依赖于时间和营养供应。粘附细菌的生长是密度依赖性的。本发明还提供一种预测表面上的细菌生长何时会呈现出快速生长的方法。本发明还提供新的转化细菌以改用该细菌菌株在存在或没有引发微生物复制因子的情况下，测量微生物生长的方法。转化细菌含有在启动子控制下，其表达由细胞生长协调调节的细菌报告基因。
文档编号C12N1/21GK1117743SQ94191184
公开日1996年2月28日 申请日期1994年1月14日 优先权日1993年1月15日
发明者C·G·布卢姆奎斯特, W·道格拉斯, G·邓尼, W·利耶马克, B·赖利 申请人:明尼苏达大学评议会