专利名称：从紫杉的胚胎培养物中产生紫杉酚和塔三烷的方法
技术领域：
本发明涉及从体细胞胚和/或培养基中生产紫杉酚及其衍生物的方法，特别是涉及培养合子胚或体细胞胚以得到体细胞多胚或胚发生愈伤组织的方法。
紫杉酚是一种已从紫杉属植物中分离的生物碱，并对包括B16黑素瘤在内的多种肿瘤细胞系表现有显著的抗肿瘤活性。已知紫杉酚主要含在短干紫杉(Taxus brevifolia)的树皮中，约为其克干重的0.02%。
虽然已证明紫杉酚的总合成方法是成功的，但这种方法因成本高而似乎不适于商业规模生产。此外，也使用浆果赤霉素Ⅲ或10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ成功地半合成了紫杉酚样化合物(例如taxotere)。但这种方法也同样存在上述问题。
因此，只能从这种稀有天然来源，例如收获的紫杉的粗原料得到紫杉酚。因为紫杉树中紫杉酚的含量很低，所以为生产1kg紫杉酚必须伐倒2000至4000棵树，并且，天然来源生产足够需要的紫杉酚将会导致森林经济体系的严重破坏。因此，试图从紫杉种的细胞和组织培养物中生产紫杉酚及其相关化合物。
例如，美国专利5，019，504号公开了一种在营养培养基中培养紫杉种的树皮、形成层、针叶和根组织以产生愈伤组织或悬浮细胞培养物，然后从中回收紫杉酚或紫杉酚样生物碱的方法。但上述方法从1升细胞悬浮培养基中产生1.0-3.0mg紫杉酚。上述专利述及，紫杉树树皮能直接得到最佳产率的紫杉酚，并可通过培养这些组织以诱导未分化的细胞团(愈伤组织)和/或从增殖的愈伤组织构成细胞悬浮培养物而产生紫杉酚。
迄今，上述使用各种紫杉组织的方法尚未商业化，其部分原因是由于相关细胞的紫杉酚产率低，或者由于未能充分建立大规模生产次级目的代谢物的工艺。
国际专利WO92-13961号公开了培养紫杉属植物的组织，特别是其雌性配子母细胞并从愈伤组织或由之得到的悬浮培养细胞中回收紫杉酚。该方法可得到占悬浮培养细胞干重0.05%的紫杉酚。
这些方法不能以工业规模生产足够量的紫杉酚，迄今仍有待改善紫杉酚生产能力。这些事实提示，需要提供一种增加细胞和/或培养基中紫杉酚含量及筛选高紫杉酚生产细胞系的改良方法，以适应工业规模生产的最终目的。
在这些情况下，本发明人为建立一种工业规模生产紫杉酚的方法而进行了深入地研究。结果，我们第一次不可预见地发现合子胚比迄今报导的含紫杉酚的其他组织含有更大量的紫杉酚(基于同样干重)。
因为胚胎本身对于发展工业规模生产紫杉酚的方法来说其体积太小，故本发明人为提供一种增加胚胎质量的方法而作了进一步的探索。结果，我们令人惊奇地发现当将胚胎培养在营养培养基上以诱导体细胞胚或胚发生愈伤组织时，胚胎质量可比原来大小增加几十万倍。
基于上述发现而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是通过提取紫杉的组织生产紫杉酚的方法，特征在于所说的组织是合子胚。
本发明的另一个目的是提供一种培养紫杉的组织并从愈伤组织或培养基中回收紫杉酚以产生紫杉酚或其衍生物的方法，特征在于所说的组织是合子胚。
本发明的再一个目的是提供一种生产紫杉酚或其衍生物的方法，该方法包括下述步骤(a)从紫杉属植物提供活的合子胚并消毒之;
(b)在培养基上培养已消毒的胚胎以从胚胎产生愈伤组织;
(c)培养步骤(b)中得到的愈伤组织以从所说的愈伤组织产生体细胞胚;
(d)培养步骤(a)中得到的消毒的胚胎或步骤(c)中得到的体细胞胚以产生胚胎发生愈伤组织;
(e)液体培养步骤(c)中得到的体细胞胚或步骤(d)中得到的胚发生愈伤组织;以及(f)从培养基中和从细胞中回收紫杉酚或紫杉酚衍生物。
本发明有别于上面列举的现有技术在于它是基于发现合子胚不可预见地含有大量紫杉酚，并通过诱导体细胞胚或胚发生愈伤组织而进一步增加胚胎的质量，并且因为它使液体培养体细胞胚或胚发生愈伤组织以工业规模生产紫杉酚成为可能而优于现有技术。
通过下列描述，本领域技术人员将很容易了解本发明的其他特征和应用。
图1(A)是标准品塔三烷(taxane)的HPLC层析图。
图1(B)是得自实施例7的纯化之培养基的HPLC层析图。
图2(A)显示实验实施例1中没有处理的大鼠肿瘤细胞的照片。
图2(B)是显示实验实施例中用实施例7的提取物处理的大鼠肿瘤细胞的照片。
图3(A)是ELISA数据的标准曲线。
图3(B)是实验实施例2中所得ELISA数据的曲线。
图4是显示实施例8中生产培养基对紫杉酚生产之影响的图解。
本发明人分析了种植在韩国国家林地的24，000株东北紫杉(Taxus cuspidata)的紫杉酚含量。虽然每棵树的含量有明显的不同，但发现收集自优良树的100g干胚中含有5g紫杉酚。而从同样量干树皮和针叶则分别得到4.5mg和2.0mg紫杉酚。
因此，本发明的第一个目的是提供一种从紫杉属的胚胎中提取紫杉酚的生产紫杉酚的方法。对紫杉树木的种类没有限制，只要是属于紫杉属的，任何树木均可利用，但优选利用的是东北紫杉。
对从胚胎中生产紫杉酚的提取方法没有限制。然而，一般可用在醇，特别是甲醇中浸渍冷冻干燥的胚胎粉末的方法从胚胎中提取紫杉酚。
不幸的是，合子胚的体积很小且胚胎中含有90%以上的水。须用很大量的胚胎才只生产出小量的紫杉酚，而且从经济角度看从胚胎中直接提取紫杉酚是不利的。
因此，本发明人已进行了深入地研究，以提供一种以经济方式生产紫杉酚而没有上文认定的问题的方法，而且作为其结果可因使用组织培养技术，特别是通过诱导体细胞胚和胚发生愈伤组织而使胚胎质量增加几十万倍。因此，本发明的第二个目的是提供一种通过从紫杉属的合子胚诱导体细胞胚或胚发生愈伤组织，使用摇瓶或生物反应器在液体培养基中培养所说的体细胞胚或胚发生愈伤组织，并从培养基和细胞中回收紫杉酚以生产紫杉酚或其衍生物的方法。
本发明的一个特征是本发明可通过诱导体细胞胚或胚发生愈伤组织以使胚胎的质量增加数万至数十万倍，而从除胚胎以外的各种组织简单地进行愈伤组织诱导则难以达到这样一个扩增效果，这可能是由所用分生组织的细胞分化能力不同。具体地说，诱导胚发生愈伤组织有可能使胚胎质量增加几十万倍，因此是很重要的。
下文将描述从合子胚诱导体细胞胚或胚发生的愈伤组织并生产紫杉酚的方法。
为了无菌培养胚胎，应将8至11月份从紫杉树上收集的种子消毒或作表面除菌。可使用常规技术进行表面除菌消毒。例如，将种子在70%乙醇中浸没30-60秒种，用无菌水洗2或3次并用1-3%(v/v)次氯酸钠溶液除菌24小时。用无菌水将表面除菌的种子淋洗5次并分离胚胎。
可按上述提取技术从胚胎中提取紫杉酚。
也可将胚胎放在固体培养基上以由之诱生愈伤组织。可用PEDC(前胚胎发生决定细胞)或IEDC(诱导的胚发生决定细胞)程序进行体细胞胚的诱导。
按下述步骤使用PEDC方式诱导体细胞胚将胚胎培养在添加有1-萘乙酸(以下称为“NAA”)、激动素和愈伤组织诱导用之2.4-D的固体培养基上。一旦诱导了愈伤组织，即将愈伤组织的小片再培养在含有适当浓度主营养素、微量营养素及维生素的培养基上使之增殖。
为了诱导和增殖愈伤组织，可使用常规植物组织培养基而没有什么限制。例如，可使用mB5(改进的Gamborg氏B5培养基)、Durzan，MS((Marashige和Skoog培养基)、WPM(Lloyd & McCown)、DKW(Driver-Kuniyuk-Walnut)、GD(Gresshoff &Doy)、SH(Schenk & Hildebrandt培养基)或LP(Quoirin & Lepiover)。
当然可以对这些培养基进行改动，如加入除去不同的成分，或改变比例。其中优选的是mB5或Durzan。作为体细胞胚发生的一个中间步骤，可使用与用于迅速增殖愈伤组织的培养基相同或不同的培养基进行诱导。从可得到最大数目体细胞胚的角度看，应优先使用mB5培养基。
因为上述的大多数培养基都是可从商业途径得到的或已很成熟的，所以公众可以很容易地取得。因此，确定和/或最佳选择用于诱导和迅速增殖愈伤组织的培养基是本领域技术人员力所能及的。例如，优先用于本发明的mB5培养基是稍加改动的Gamberg′s B5培养基，且其组成如表1所示。
此外，可在另外加有不同的植物生长激素的上文列举的培养基中培养胚胎，以完成生产体细胞胚的IEDC方法。
对于初始培养，加入2-4ppm的2，4-D。当从胚胎表面生成愈伤组织并且细胞团增加10-20倍时，通常使用加入半量浓度植物生长素的同样培养基进行再培养。
因为可能从未繁殖的细胞中分泌酚化合物，而使大多数愈伤组织失去其生长能力，所以要掺入0.5%(w/v)活性碳或1-2%(w/v)聚乙烯聚吡咯烷。在没有生长调节剂的培养基上再培养愈伤组织2-4个月，以从愈伤组织的分生组织生成体细胞胚。
如此生成的体细胞胚含有大量的紫杉酚或紫杉酚衍生物(下文称为“塔三烷”(“taxanes”))并且可将其用以提取塔三烷。可使用常规方法，特别是下文所述方法从体细胞胚中提取塔三烷。但为了进一步增加细胞质量最好使用体细胞胚诱生胚发生的愈伤组织。
根据本发明，可以经提取胚发生的愈伤组织及如上产生的体细胞胚而制得相对高比例的塔三烷。可经培养以上述PEDC或IEDC方法得到的体细胞胚或合子胚来产生胚发生的愈伤组织。生产胚发生的愈伤组织的方法如下所述在添加了1.0-4.0ppmNAA和0.5-2.0ppm激动素，较好添加2.0ppm NAA和10ppm激动素的适于培养愈伤组织的固体培养基中将消毒的胚胎或体细胞胚培养2-4个月。可向培养基中加入1-4ppm 2，4-D以代替NAA加激动素。然后在添加1-5ppm细胞分裂素如苄胺嘌呤、N-异戊烯基氨基嘌呤、激动素或玉米素的同样培养基中将被诱导的愈伤组织培养1-2个月，以在愈伤组织的表面上形成胚状体，并将此胚状体放在添加2-10ppm，2，4-D的同样培养基上，于26℃及16/8小时(光照/黑暗)条件下培养2-3个月。该培养能够以很大量，即高达原胚组织质量数十万倍的量得到胚发生的愈伤组织。胚发生的愈伤组织可显示广泛的颜色，例如从黄色、褐色到绿色。
为了诱生和增殖胚发生的愈伤组织，可没有限制地使用任何一种可用于常规植物细胞和组织培养的培养基。
如上产生的胚发生的愈伤组织含有大量的紫杉酚并可直接用以提取紫杉酚和塔三烷。
可用常规技术，特别是下文所述的方法提取胚发生的愈伤组织。
为了以工业规模扩增胚发生愈伤组织的质量，将胚发生愈伤组织剪切成单个细胞或小的细胞聚集物。为建立细胞悬浮培养物，将10%(V/V)的这些细胞接种到含有50ml添加了2ppm 2，4-D之液体培养基的250ml锥形瓶中。为便于进行连续培养最好使用气升式或叶轮型生物反应器。
可使用两种不同的培养基进行生物反应器培养一种是用于细胞生长的(生长培养基)，另一种是用于产生塔三烷的(生产培养基)。生长培养基较好是添加2-4ppm 2，4-D的mB5培养基，生产培养基较好是添加2-10ppm NAA的MS培养基。
具体地说，生产培养基较好含有诱发剂以增加紫杉酚生产。诱发剂可选自真菌诱发剂、雌性配子母细胞提取物(1-5ml/l)、苯丙酸(50-300mM)和GA3(0.5-1.0ppm)、真菌诱发剂包括由Cytospora abietis ATCC No.38688和Penicillium minioluteum(Dierckx)NRRL18467经粉碎和一系列提取而得到的提取物。另外，也可优先选择和培养Pestalotiopsis的真菌，并将其提取物以0.5-1.0ml/L的量加到培养基中。
紫杉酚存在于细胞中以及分泌到培养基中。因此，培养后可用已知技术培养物或培养基中回收紫杉酚和塔三烷。可用离心法(例如1000xg，5-10分钟)或倾析法从培养基中分离细胞。如果利用后一种技术进行分离，可将培养液放置约24小时以沉淀细胞并倾去培养基。使用吸管经真空抽吸除去仍保留在收集的细胞中的培养基。
可用醇或甲醇与二氯甲烷的1∶1混合物提取体细胞胚或胚发生的愈伤组织以及培养基，以从中回收紫杉酚。可使用超声波粉碎器(Branson 250)破碎离心期间形成的沉淀物，并进行提取。
根据本发明，回收紫杉酚本身及各种紫杉酚衍生物。紫杉酚衍生物包括10-脱乙酰浆果赤毒素Ⅲ、浆果赤霉素Ⅲ、10-脱乙酰紫杉酚、cephanolmanin和7-表-10-脱乙酰紫杉酚(参见图1(B))。紫杉酚衍生物可以如此使用，或者必要时以半合成法转化成紫杉酚。
可用HPLC、细胞毒性试验及使用由NCI提供的作为标准品的紫杉酚及六种(6)紫杉酚衍生物进行的ELISA鉴定由体细胞胚和来源于合子胚的胚之胚发生愈伤组织产生的塔三烷。
下面借助非限制性实施例更详细地描述本发明。
实施例1从紫杉的合子胚中回收紫杉酚从优良的东北紫杉树上收获种子。在约40℃的真空烘箱中干燥胚胎组织3天至水含量少于10%并称重。然后用液氮冷冻胚胎并粉碎之。将粉碎的胚在约含有100倍重量甲醇的约28℃恒温箱中浸大约7天。通过滤膜(孔径0.2um)过滤所得提取物，并使用HPLC方法分析紫杉酚的含量。
处理从同一树上收集的树皮和针叶并按上述同样方法分析紫杉酚含量。结果示于表2中。
表2组织 干组织(100g)中的紫杉酚含量胚胎 5g树皮 4.5mg针叶 2.0mg实施例2使用PEDC方式从胚胎产生体细胞胚。
将从东北紫杉的选择的基因型得到的种子在70%乙醇和2%过氯酸钠中分别浸泡50秒和24小时，并在各步骤终止后用无菌蒸馏水淋洗3至5分钟。
使用添加2.0ppm NAA、0.5ppm激动素和0.5ppm 2，4-D的mB5培养基(具有如上文表1中所示的成分和组成)。在调整到26℃的生长室中体外培养8周。
在前8周培养期间，胚胎增大并从大多数胚的表面诱生了愈伤组织。切掉愈伤组织中的绿色斑点并使之在没有任何生长调节剂的mB5培养基中培养3个月以诱生体细胞胚。
实施例3使用IEDC方式从合子胚产生体细胞胚。
按实施例2中方法消毒东北紫杉的种子并从中分离胚胎。胚胎在添加2ppm 2，4-D的Durzan培养基中23-28℃培养2周。培养2周后，所有胚胎都被从中诱生的愈伤组织完全包被。培养4周后愈伤组织的质量达到原来质量的几十倍。
为了避免因其分泌的酚抑制愈伤组织生成或选成死亡，使用补充约1%聚乙烯聚吡咯烷酮的同样培养基再培养愈伤组织。8周培养后，当愈伤组织的平均直径达到1-1.5cm时将愈伤组织移入不含植物生长调节剂的mB5培养基中，愈伤组织在其生长以诱生体细胞胚。某些胚中观察到根的分化。
实施例4为了诱导胚发生的愈伤组织培养物，用实施例2中灭菌的合子胚和实施例3与4中的体细胞胚作为起始材料。
将上述材料在补充2.0ppm NAA和1.0ppm激动素的mB5培养基中23-28℃培养约2.5个月以诱导愈伤组织。完成愈伤组织诱导后，使用加有3ppm玉米素的同样培养基进行亚培养约6周，以得到绿色到带黄色的胚状体。
在16/8(光照/黑暗)小时条件下，将胚状体在含有3ppm 2，4-D的同样培养基中26℃培养2个月，以产生质量达原胚几十万倍的胚发生愈伤组织。所得到的胚发生愈伤组织在形态学上与来源于各种类型紫杉组织的正常愈伤组织差不多，且有时产生合子胚的相似外观。
然而，胚发生愈伤组织的表面由多种不同色泽范围的颜色构成，包括红、黄、暗绿、浅褐、深褐及黑色。用刀片将各个带颜色的细胞团块切成片以得到小的细胞聚集体，然后亚克隆到液体培养基中培养2-4周。从液体培养物中除去大的细胞团后，将单个细胞和/或小的细胞聚集体接种到有20ml培养基的塑料平皿上。掺入的方法是在培养4周后进行液体铺板并选择不同的带颜色细胞系。经常规肉眼选择得到不同的带颜色细胞系。
实施例5于25℃干燥实施例2或3得到的体细胞胚或实施例4中得到的胚发生愈伤组织，并溶解在1μ二氯甲烷中。加入1μl蒸馏水并将此混合物搅拌10秒钟，然后离心(25，000xg)。于25℃干燥沉淀物，溶解在50μl甲醇中并通过0.2μm滤膜过滤以得到提取物。
用装有反相微孔柱进行HPLC，使用外部标准品的标准曲线(校正系数0.999)分析提取物。HPLC结果显示，标准塔三烷的峰和含有上述提取物中的塔三烷的峰在同一滞留时间(14.3分钟)出现。
实施例6按下述方法提取实施例2和3中得到的体细胞胚和实施例4中得到的胚发生愈伤组织，以产生塔三烷将实施例2和3中的体细胞胚和实施例4中的胚发生愈伤组织各0.5g放在离心管中，并加入2μl已烷。用玻璃棒充分混合该混合物并在-20℃保存12小时，然后于25℃，25，500xg离心20分钟。
向沉淀物中加入甲醇氯化乙烯的混合溶液，用使用超声波粉碎器(Branson 250)进行超声处理。离心(25，000xg)所得溶液并于60℃干燥所得沉淀物，得到干燥的提取物。
分离提取的紫杉酚含量并得到下列结果实施例2的体细胞胚的提取物含有0.21-0.27mg/每克干细胞(总紫杉酚含量为0.5-1.2mg);实施例3的体细胞胚的提取物含有0.20-0.27mg(总紫杉酚含量为0.55-1.1mg);且实施例4的胚发生愈佃组织的提取物含有0.23-0.28mg(总紫杉酚含量为0.6-1.4mg)。
实施例7使了大量生产胚发生愈伤组织，使用叶轮型生物发生器培养实施例4的胚发生愈伤组织。
将实例4的胚发生愈伤组织以10%PCV(堆积细胞体积)接种于含有50ml液体mB5培养基(其中加有2ppm的2，4-D)的250ml培养瓶中。当在无菌条件下于25-28℃培养18天时达到静止期。
将培养物放在含有MS生产培养基(补充有2ppm NAA)的5升叶轮型生物反应器中。在通气条件下将培养物于25-28℃保持30天。培养30天后，将培养液放置24小时以沉淀细胞，并从培养基中分离出细胞。用吸管从细胞中彻底除去培养基。
按实施例5中所述的同样方法提取如此分离的细胞和培养基以得到紫杉酚及其衍生物。
HPLC结果显示标准品紫杉酚和其衍生物的峰(图1(A))与含在上述提取物中的紫杉酚和其衍生物的峰(图1(B))出现在同一滞留时间，表明这些化合物是相同的。
已计算出每克干细胞含有0.09mg紫杉酚，而培养基每升约含8mg紫杉酚。
实施例8为了检测不同类型培养基对紫杉酚生产的影响，将实施例7的培养物接种在各种不同的培养基如MS、mB5、WPM、DKW、Durzan、White、LP、GD、B5、DCR或SH培养基上。所有被试培养基均补加2.0ppmNAA，并平衡调整包括微环境条件在内的其他因素。培养周期减少到20天。
结果示于图4中。从图中可以看出，培养基的类型对紫杉酚的产生有很大影响，而且可见MS和mB5可给出最高的紫杉酚产量。
实施例9可在生产培养基中加入各种诱发剂以增加紫杉酚和塔三烷生产量。按下述方法估计诱发剂时紫杉酚产生的影响(1)为本发明目的，在培养基中加入作为紫杉酚之诱发剂的出现在紫杉中之真菌Pestalotiopsis sp.的提取物。
将植物组织如种子和内层树皮浸在70%乙醇中，使用15%H2O2表示消毒15分钟后再次浸入70%乙醇中。用无菌蒸馏水将组织淋洗4次或4次以上以除去余留的试剂。将如此表面消毒的组织放在培养基上麦芽提取物琼脂培养基(麦芽提取物20.0g、胨5.0g、琼脂15.0g和蒸馏水1升)、生长琼脂培养基(葡萄糖40g、bacto soyton 10g、乙酸钠1g、苯甲酸钠50mg、琼脂20.0g和蒸馏水1升)及水培养基(琼脂20.0g和蒸馏水1升)，并维持在12/12(光照/黑暗)小时光照设备的恒温控制的生长室中。
当Pestalotiopsis sp.真菌在培养后3天内显现时，将真菌进一步在麦芽提取物和生长琼脂培养基(酵母浸膏3g、bacto soyton 5g、MgSO40.5g、葡萄糖5g、蔗糖10g/L)培养4天。收获时，离心培养物以从培养基中分离出细胞。干燥细胞后，粉碎并用甲醇提取以得到碳水化合物部分。
将如此得到的Restalotiopsis sp.的碳水化合物提取物加到生产培养基中至1ppm浓度、并按实施例7中所述方法进行培养和分析。结果示于表3中。
(2)向生产培养基中加入作为诱发剂的雌性配子母细胞提取物2ml/L、苯丙氨酸100mM和赤霉酸1ppm，重复实施例7的方法。结果示于表3中。
实验实施例1使用大鼠肿瘤细胞进行细胞毒性试验，从验证得自紫杉树脂胚胎培养物的紫杉酚。
通常基于紫杉酚能够选择性地杀死处于细胞分裂中间的肿瘤细胞这一事实，而使用大鼠肿瘤细胞进行细胞毒性试验以证实紫杉酚的活性。将由Central Research and Development Center of Pacific Corporation，Kyounggi-do，Korea提供的大鼠肿瘤细胞培养在含有动物细胞培养基的塑料培养瓶中。在培养的早期阶段，当发生细胞分裂时，向一个瓶中加入1滴实施例7的提取物(处理)，而不向另一个瓶内加提取物(对照)。然后检查各肿瘤细胞的细胞分裂和存活性。结果示于图2(A)和图2(B)中。
如可从图2(A)和2(B)中看到的，对照组显示肿瘤细胞的旺盛生长(图2(A))，而处理组则显示肿瘤细胞死亡(图2(B))。在处理后3小时显现有肿瘤细胞死亡，并在其后约24小时完全死亡。因此，不需要检测细胞分裂或存活性。
实验实施例2还按下述方法使用单克隆抗体的ELISA方法(酶联免疫吸附法)鉴定得自紫杉树胚胎培养物的塔三烷本实验中使用购自Hawaii Biotechnology Group的对紫杉酚起特异反应的TA01药盒和对塔三烷起特异反应的TA03药盒。用PBS(磷酸盐缓冲盐水)将紫杉酚和塔三烷稀释100倍，并将各100μl稀释液分加于ELSA板小井中。25℃保温1小时后，用TBS-7(洗涤缓冲液)溶液将平板至少洗4次，并向其中加入50μl PBST(磷酸盐缓冲盐水-吐温)。将紫杉酚标准品、塔三烷标准品或实施例7的提取物以连续三倍稀释方式分配到小井中。
用PBST将紫杉酚抗体和塔三烷抗体分别稀释100倍和1000倍，并分配各50μl稀释液。25℃保温1小时后，用洗涤缓冲液洗平板4次。将用PBST稀释2000倍的100μl HRP(辣根过氧化物酶)分配到小井中并于25℃保温1小时，然后用洗涤缓冲液洗4次。加入200μl OPD(邻苯二胺)并于25℃保温1小时以显色。使用ELISA读数器测出490nm吸光率。图3(A)中所示的紫杉酚的检测结果和图3(B)中所示的实施例7之培养基的检测结果证明了紫杉之胚胎培养物的紫杉酚活性。
应明确的是，上文的详细描述只是以举例说明的方式给出的，显然可以在不背离本发明精神和范围的情况下对发明作出改动和改变。
权利要求书按照条约第19条的修改1.(删除)2.培养紫杉的组织并从愈伤组织或培养基中回收紫杉或其衍生物以生产紫杉酚或其衍生物的方法，特征在于所说的组织是合子胚。
3.根据权利要求2的方法，其中该方法包括以下步骤(a)从紫杉的种子提供活的合子胚并消毒之，(b)培养接种至培养基中的所说的消毒的胚胎以由胚胎产生愈伤组织；(c)培养(b)中得到的愈伤组织以从所说的愈伤组织产生体细胞胚；(d)培养(a)中得到的消毒的胚胎或(c)中得到的体细胞胚以产生胚发生的愈伤组织；(e)液体培养(c)中得到的体细胞胚或(d)中得到的胚发生的愈伤组织；以及(f)从培养基中和细胞中回收紫杉酚或紫杉酚衍生物。
4.根据权利要求3的方法，其中步骤(c)是利用PEDC(前胚发生决定细胞)或IEDC(诱导的胚发生决定细胞)程序诱导体细胞胚而完成的。
5.根据权利要求3的方法，其中液体培养(e)由使用生长培养基的生长阶段和使用生产培养基的紫杉酚生产阶段组成。
6.根据权利要求5的方法，其中生长培养基是改动的含2－5ppm，2，4－D的Gamborg B5(mB5)培养基，且生产培养基是添加1－2ppm NAA的MS或mB5培养基。
7.根据权利要求5的方法，其中生产培养基含有作为诱发剂的得自存在于紫杉中之真菌的碳水化合物部分提取物、紫杉的雌性配子母细胞的提取物、苯丙氨酸或赤霉酸，用以提高紫杉酚生产能力。
8.根据权利要求7的方法，其中真菌是pestatotiopsis sp.。
9.根据权利要求3的方法，其中步骤(d)是经在含有1.0-4.0ppm NAA和0.5-2.0ppm激动素的固体培养基中培养步骤(b)中的胚胎或步骤(c)中的体细胞胚以由之诱生愈伤组织、在含有1－5ppm细胞分尿素、苄胺嘌呤、N－异戊烯基氨基嘌呤、激动素或玉米素的同样培养基中培养愈伤细胞以在愈伤组织表面上形成胚状体，并在含有2－10ppm、2，4－D的同样培养基中培养胚状体以产生胚发生的愈伤组织。
10.根据权利要求3的方法，其中提取步骤(c)中的体细胞胚以产生紫杉酚或其衍生物。
11.根据权利要求3的方法，其中提取步骤(d)中的胚发生的愈伤组织以产生紫杉酚或其衍生物。
12.根据权利要求2的方法，其中紫杉种是东北紫杉。
13.(删除)14.(删除)
权利要求
1.提取紫杉的组织以生产紫杉酚的方法，特征在于所说的组织是合子胚。
2.培养紫杉的组织并从愈伤组织或培养基中回收紫杉或其衍生物以生产紫杉酚或其衍生物的方法，特征在于所说的组织是合子胚。
3.根据权利要求2的方法，其中该方法包括以下步骤(a)从紫杉的种子提供活的合子胚并消毒之，(b)培养接种至培养基中的所说的消毒的胚胎以由胚胎产生愈伤组织;(c)培养(b)中得到的愈伤组织以从所说的愈伤组织产生体细胞胚;(d)培养(a)中得到的消毒的胚胎或(c)中得到的体细胞胚以产生胚发生的愈伤组织;(e)液体培养(c)中得到的体细胞胚或(d)中得到的胚发生的愈伤组织;以及(f)从培养基中和细胞中回收紫杉酚或紫杉酚衍生物。
4.根据权利要求3的方法，其中步骤(c)是利用PEDC(前胚发生决定细胞)或IEDC(诱导的胚发生决定细胞)程序诱导体细胞胚而完成的。
5.根据权利要求3的方法，其中液体培养(e)由使用生长培养基的生长阶段和使用生产培养基的紫杉酚生产阶段组成。
6.根据权利要求5的方法，其中生长培养基是改动的含2-4ppm，2，4-D的Gamborg B5(mB5)培养基，且生产培养基是添加1-2ppm NAA的MS或mB5培养基。
7.根据权利要求5的方法，其中生产培养基含有作为诱发剂的得自存在于紫杉中之真菌的碳水化合物部分提取物、紫杉的雌性配子母细胞的提取物、苯丙氨酸或赤霉酸，用以提高紫杉酚生产能力。
8.根据权利要求7的方法，其中真菌是pestalotiopsis sp.。
9.根据权利要求3的方法，其中步骤(d)是经在含有1.0-4.0ppm NAA和0.5-2.0ppm激动素的固体培养基中培养步骤(b)中的胚胎或步骤(c)中的体细胞胚以由之诱生愈伤组织、在含有1-5ppm细胞分裂素、苄胺嘌呤、N-异戊烯基氨基嘌呤、激动素或玉米素的同样培养基中培养愈伤细胞以在愈伤组织表面上形成胚状体，并在含有2-10ppm、2，4-D的同样培养基中培养胚状体以产生胚发生的愈伤组织。
10.根据权利要求3的方法，其中提取步骤(c)中的体细胞胚以产生紫杉酚或其衍生物。
11.根据权利要求3的方法，其中提取步骤(d)中的胚发生的愈伤组织以产生紫杉酚或其衍生物。
12.根据权利要求2的方法，其中紫杉种是东北紫杉。
13.来自紫杉种之合子胚分离块的体细胞胚培养物，其为在权利要求3的步骤(c)中得到的。
14.来自紫杉种之合子胚分离块的胚发生的愈伤组织培养物，其为在权利要求3的步骤(d)中得到的。
全文摘要
本发明公开了通过提取紫杉的组织或其细胞培养物生产紫杉酚和塔三烷的方法。经提取紫杉的组织和/或培养基生产紫杉酚及其衍生物的方法特征在于所说的组织是合子胚。可经诱导体细胞胚或胚发生的愈伤组织来进行紫杉合子胚的细胞培养。
文档编号C12R1/91GK1111911SQ94190464
公开日1995年11月15日 申请日期1994年7月6日 优先权日1993年7月6日
发明者李辅植, 孙圣镐 申请人:大韩民国山林厅林木育种研究所