专利名称：细菌聚集表面的处理的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用丝光绿蝇的幼虫的分泌物处理聚集了能产生生物薄膜的细菌的表面的方法以及可用于此方法的组合物。
生物薄膜是在表面生长并且持续存在的生物膜。它们可存在于运输或处理流体的工业设备的表面上、管道系统中以及在与这些设备或系统邻近的表面上。它们通常存在于医用植入物或插入到体内的装置的表面上。它们也可形成于暴露于空气的身体的区域；尤其是它们可存在于伤口中以及在肺的内层上。生物薄膜可被描述成包围在粘附于表面的多糖基质内的细菌群落。
生物薄膜通常为稳定的形式，通过传统方法很难对其进行处理。这取决于其中包埋了微生物的多糖生物薄膜基质的保护特性。
常规的药物，诸如抗生素受生物薄膜中微生物的扩散壁垒或改变的新陈代谢状态的影响而效果较小。
生物薄膜的形成被认为与微生物通过被称为密度感受的过程进行的可扩散的信号分子的产生相关。这些分子被认为通过微生物启动外多糖、外蛋白质及其它次级代谢产物的产生。干扰这些分子作用的化合物可抑制生物薄膜的形成和/或削弱已经形成的生物薄膜。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种最普通和最成问题的传染性细菌。尤其是其形成的生物薄膜很难用常规的抗生素处理。铜绿假单胞菌形成的生物薄膜对于具有囊状纤维化的患者是非常严重的问题，其中铜绿假单胞菌在所述患者的肺中繁殖会引起很难治疗且最终常常致死的感染。
有效的伤口愈合是一个复杂的生理过程，其涉及许多的机制包括细胞迁移、生长因子的分泌、血管生成、组织n lelling以及有助于以协调以及以明显分阶段的方式来促进受控的组织再生的伤口的固有蛋白酶/抗蛋白酶平衡。
伤口护理产品在现代医疗实践中是必要的，尤其是用于慢性创伤或烧伤患者的治疗。许多不同的物质以前被认为具有有助于伤口愈合的活性。这些以前所讨论的物质包括链激酶、胶原酶以及链道酶(全部获自细菌来源)、菠罗蛋白酶(来自菠萝)、纤溶酶和胰蛋白酶(获自牛)以及磷虾酶(获自甲壳纲动物)。临床试验的数据显示这些物质仅对促进伤口愈合部分地有效。
已知作为活生物体的丽蝇(green bottle fly)、丝光绿蝇的幼虫(蛆)具有显著的伤口愈合特性。利用丝光绿蝇幼虫进行的清创术治疗已成为被广泛接受的临床应用。然而，在文献中很少有关于此方式的报道，其中这些幼虫能够将伤口净化到通常非妥协性的伤口愈合的程度。愈合可以是机械的、生化的或两者相结合的方式。我们的工作表明了可以利用体外分泌物来模仿这些幼虫的作用。
尽管是有效的，然而活幼虫对许多来说是使人厌恶的，并且通过在伤口上利用活幼虫以及当使用幼虫时不可避免地将它们的天然分泌物导入到伤口中，对于许多病人和对许多医疗工作者来说是无法接受的。使用活的生物体也增加了患者发生过敏性反应的危险。
已知丝光绿蝇幼虫的排泄物/分泌物(ES)含有一种显示出胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶活性的酶。本发明是基于发现了体外的ES也具有破坏细菌产生的低分子量信号分子的能力来测定细菌群落的密度，并且因此破坏生物薄膜所赖以形成的细菌信息网络。
本发明的第一个方面提供了一种处理聚集了能产生生物薄膜的细菌的表面的方法，其包括用获自丝光绿蝇分泌物/排泄物的具有N-酰基高丝氨酸内酯降解活性的物质接触表面。典型地，所述的能产生生物薄膜的细菌为铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌。
目前通常比较接受的对生物薄膜的研究是更接近于细菌存在的自然模式而不是更广泛地研究浮游生物的系统。Thomas S.等，J.TissueViability，1999 Vol 9 No.4 p127-132报道了丝光绿蝇幼虫的分泌物针对浮游细菌细胞的抗微生物活性。我们尚不能重复这些结果。然而，在我们的实验中，我们已经发现在实验室的条件下，丝光绿蝇幼虫的分泌物具有阻止或减少细菌性的生物薄膜形成的活性。去除伤口中的细菌性的生物薄膜在与感染进行的斗争中将是有利的。
我们的实验显示作为细菌性的生物薄膜的一部分而形成的外多糖被通过丝光绿蝇分泌物的作用去除。这些作用有说服力地表明了在分泌物中存在糖苷酶活性。
慢性伤口的愈合已被证明由于细菌感染的存在而削弱。感染的水平影响愈合和恶化之间的平衡。导致伤口组织缺氧和病变作用的细菌是有效愈合的阻碍。
众所周知，可扩散的低分子量的信号分子允许单独的细菌来测定群体密度，并且因此当集聚“密度”时以一种协调的方式进行作用。这些作用，通常被称为“密度感受”，现在已知它调控病原体中毒性决定因子的产生，因此确保感染危险期的巩固的攻击。已知低分子量的信号分子(密度感受分子)包括N-酰基高丝氨酸内酯，例如，来自铜绿假单胞菌(参见
图1)的N-丁酰基L-高丝氨酸内酯(BHL)和N-(3-氧代十二烷基)-L-高丝氨酸内酯(OdDHL)。内酯也引起真核生物组织中的细胞程序性死亡，因此在抵抗伤口愈合所需的组织再生中起作用。显然破坏这些信号分子将减少细菌对宿主组织的有效攻击的能力。我们通过实验表明，丝光绿蝇幼虫的分泌物具有降解BHL和较小程度的降解OdDHL的活性。一旦细菌形成一种生物薄膜，BHL被认为是更有活性的。我们已发现这些活性为热稳定的，然而对苯基甲磺酰氟(PMSF)和4-氨基苯基-甲磺酰氟(APMSF)是敏感的，已知其中所述的苯基甲磺酰氟(PMSF)和4-氨基苯基-甲磺酰氟(APMSF)抑制丝氨酸蛋白酶和酯酶的活性。
来自丝光绿蝇幼虫的分泌物可以通过用磷酸盐缓冲液洗涤无菌的幼虫，然后在无菌的条件下过滤来收集。
我们令人惊讶地发现，当幼虫的分泌物与常规的抗生素诸如四环素结合使用时，具有大于幼虫分泌物和抗生素分别单独地使用时各自的作用。因此，当组合使用时这些单独的物质之间具有某些协同作用。因此，根据进一步的方面，本发明提供了包括丝光绿蝇幼虫的分泌物和一种或多种抗生素化合物的抗微生物组合物。在一个优选的实施方案中，所述的抗生素化合物为四环素。
在我们研究的过程中，我们意识到幼虫分泌物的很多重要组分可能被忽略了，如它们可以是在血淋巴或其它组织中通过暴露于细菌就可诱导的(如Hoffmann等在Drosophila melanogaster中描述的(1999))而不是组成型表达的。因此，我们测试了在体外暴露于用于在血淋巴中产生抗微生物化合物的细菌之后表型改变的丝光绿蝇幼虫。
可利用任意已知的皮肤传递系统或输入到无菌载体诸如膏药中以敷料的形式将添加或者没有添加常规抗生素的无菌分泌物输送到伤口区域上，来用于伤口区域。
实验用于制备丝光绿蝇(L.sericata)分泌物的方法1日龄的(1St龄虫)叉叶绿蝇丝光绿蝇的幼虫购自SurgicalMaterials Testing Laboratory(SMTL)Bridgend。
在无菌条件下饲养且利用无菌设备以及在层流橱柜中收集所有这些丝光绿蝇幼虫的分泌物。在向每一通用样品(含有大约200个幼虫)中添加200μl磷酸的缓冲盐水溶液(PBS)后，收集分泌物。在移取(无菌移液管)、离心(13,000xg 10分钟)和冷冻(-20℃)分泌物之前用PBS洗涤幼虫。在第二次洗涤之前，让幼虫休息40分钟，然后重复进行第三次洗涤。
测定所收集的分泌物的蛋白质含量(BioRad蛋白测定试验)和蛋白酶活性(异硫氰胺荧光素标记的(FITC)酪蛋白)。无菌过滤分泌物(22μm过滤)并等分备用且在-20℃储藏。
1.丝光绿蝇ES与常规抗生素的协同作用利用最小抑菌浓度试验在96孔平皿中测定抑制浮游细菌生长的ES的浓度-通过在492nm处吸光率的增加来测定生长。
与Thomas等(1999)的观察进行比较的结果表明，由丝光绿蝇在无菌条件下生长产生的ES对革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌(分别为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)的生长没有抗生作用(图2)。
类似地，在492nm处进行24h的吸收之后，比较ES和加热变性(沸腾10分钟)的ES以及常规抗生素四环素对铜绿假单胞菌生长的影响(图3)。10μg/ml四环素完全破坏生长。相比之下，活性的ES显示通过此方法测定的生长的微弱增强(可能取决于生物薄膜剥离-参见下面的图4)。然而，利用亚致命水平的四环素与ES结合，发现在降低细菌生长的这两者之间具有协同效应(图4)。这也通过用24小时后的菌落数来证实，其中发现四环素和活性ES的组合将活菌数减少了三分之一。
结论是，单独的丝光绿蝇分泌物对浮游条件下的细菌生长不具有抗生作用，然而与常规的抗生素四环素一起具有协同效应。
2.在存在丝光绿蝇ES的条件下减少生物薄膜的形成目前通常比较接受的是，对生物薄膜的研究是更接近于细菌存在的自然模式，而不是更广泛使用的但是不适当的浮游生物系统。去除伤口中的细菌性生物薄膜在与感染进行的斗争中将是有利的。
利用O′Toole和Kolter(1999)的结晶紫法测定在存在丝光绿蝇ES时生物薄膜形成的减少。
在96孔平皿中培养生长24h，然后在去除浮游细菌之后测定附着的细菌(参见第3部分)。在溶解和在540nm处测定染色的吸光率之前用结晶紫染料染色所附着的细菌。在丝光绿蝇ES的存在下，测定金黄色葡萄球菌生物薄膜在生物薄膜形成中的剂量反应减少达24之久(图5a)。在ES存在时温育盖玻片的培养生长中，在铜绿假单胞菌生物薄膜形成中发现类似的减少。利用Baclight染色来显像微菌落(图5b和5c)。
结论是，在实验室的条件下丝光绿蝇分泌物对于阻止细菌膜的形成是有活性的。
3.丝光绿蝇ES产物的糖苷酶活性当培养物在存在丝光绿蝇ES产物的条件下生长时，在产生生物薄膜的条件下生长的培养物中回收的细胞显示出了差异。培养物在96孔微滴定板中的100μL等分试样中生长。与烧瓶生长培养相比，这样具有增加液体与塑料孔表面接触的表面面积的作用，由此促进了生物薄膜的增长。从过夜的培养物接种铜绿假单胞菌并生长到早期的指数生长期，然后稀释(1/2000)来得到～103个细胞/孔。培养物然后在存在ES、灭活ES(沸腾10min)或磷酸盐缓冲液(对照)的条件下生长。37℃过夜培养培养物，然后收集每一种等分试样并离心(13,000xg 10分钟)回收细胞。结果表明(图6)，在对照和灭活ES样本中存在的“粘液层”，而在活性ES存在时却不存在。加入活性ES的等分试样到样本D(变性ES)中，然后在37℃温育过夜导致最初形成的粘液层被除去。我们认为粘液层可能包括作为生物薄膜的一部分的外多糖，并且通过丝光绿蝇ES中的糖苷酶可使其去除。就铜绿假单胞菌而言，人们认为其外多糖是藻酸盐(一种由古洛糖醛酸和甘露糖醛酸构成的聚合物)。
结论是酶催化除去外多糖将降低细菌形成有效的生物薄膜并且因此在伤口中形成一种有效的感染的能力。
4.通过来自丝光绿蝇排泄/分泌产物(ES)的热稳定的PMSF/APMSF-敏感的活性(内酯酶)使铜绿假单胞菌的密度感受信号分子失活可利用薄层色谱法(TLC)测定BHL和OdDHL(分别为RP18F245S或RP2UV254板)。在色谱层析之后，信号分子的位置和量可以通过它们对生物传感器生物的影响来显示。当和BHL或HL接触时，所使用的特定生物会发光。因此，如果将TLC板用含有生物传感器生物的软琼脂覆盖，则温育一段时期后，通过光线的发射显示了信号分子的位置。通过转换成假的颜色显示了发射光的强度，其中最强烈的光显示为黄色并且渐变为最弱的-深蓝色(附图7-侧面的条棒)。
通过下列的温育测试丝光绿蝇分泌物对BHL的作用1.100μl ES(120μg/ml蛋白)+100μM BHL2.100μl沸腾的ES(120μg/ml蛋白)+100μM BHL3.100μl ES(120μg/ml蛋白)+100μM BHL4.用APMSF(2mM)预温育的100μl ES(120μg/ml蛋白)+100μM BHL5.在缓冲液(磷酸盐缓冲液)中的100μMBHL温育6小时后，每一温育的1μl被用于RP18F254STLC板并在如上所述利用生物传感器覆盖来显示BHL之前用60％(v/v)甲醇/水进行分离。
结果(图7)证实了幼虫ES对降低BHL的作用。阳性对照(泳道5)表明光产生来自单独的BHL。在幼虫ES(泳道1)存在下与BHL一起温育时光产生降低(泳道1)，表明了信号分子的降解。通过将ES与苯基甲磺酰氟(PMSF)(泳道4)一起预温育阻止了此降解以及通过将ES与4-氨基苯基-甲磺酰氟(APMSF)一起预温育在较低的程度上阻止了此降解(泳道3)(丝氨酸蛋白酶活性的抑制剂)。煮沸的ES(泳道2)没有阻止降低，由此表明了活性的热稳定性。
此外，实验证实了ES对在6小时的温育开始时和结束时采集的OdDHL(附图8和9)比较样品有类似的作用。
这一次，在RP2/UV254板上利用45％(v/v)甲醇/水进行色谱层析。降解导致了第二种物质的出现，确信它为OdDHL分子的开环。这有待于通过柱层析(通过C18柱进行高效液相色谱)来证实。同样，该降解对煮沸是稳定的但其受PMSF抑制和在较少程度上受APMSF抑制。
结论是，丝光绿蝇幼虫ES具有对能降解BHL和OdDHL的PMSF和APMSF敏感的热稳定活性，其中的BHL和OdDHL是两种涉及铜绿假单胞菌的生物薄膜形成和感染并且由此与伤口愈合有关的信号分子。
5.丝光绿蝇中抗微生物活性的诱导丝光绿蝇的无菌幼虫获自Surgical Materials TestingLaboratory SMTL(Princess of Wales Hospital，Bridgend CF311RQ)。
将幼虫培养在Sherman(1995)所描述的培养基上，该培养基包括分解的猪肝和细菌培养用琼脂，用在密闭容器中的高压灭菌器进行杀菌，其中的密闭容器允许气体和湿气在容器的内部和外部之间交换但其阻止细菌进入到容器中。在容器的基体中提供用于幼虫的培养基的薄膜层。
将无菌的第一龄幼虫(200个)悬浮在200μl的无菌磷酸盐缓冲液中并转入到容器中。在保湿室中在28℃的无菌条件下培养48个小时，来允许幼虫的产生。将铜绿假单胞菌的突变体PAO P47接种到10mlLuria Bertani(LB)培养基中并在37℃振荡培养过夜。给容器接种1ml(～108活菌数)的培养物并且允许幼虫在细菌的存在下培养。在另一48h之后，处死幼虫并在脊前部切口收集血淋巴。微离心(13,000xg持续10分钟)血淋巴以除去细胞。
通过在含有大肠杆菌D31的细菌菌苔中的2μl血淋巴的微孔周围无菌噬菌斑的形成来评估抗微生物的活性。接种1μl的培养物到7ml的熔化(50℃)的含有10μg/ml链霉素和5mg....yso酶的1％LB琼脂中来制备平板。这些在无菌皮式培养皿中形成。利用模板以距离平板边缘等间距的规则模式来形成微孔(8)。通过与用2μl分别为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的天蚕素B(Sigma)产生的噬菌斑进行比较来评估抗微生物活性(附图10)。通过铜绿假单胞菌诱导48h之后获得的血淋巴产生的5mm直径的抗微生物噬菌斑大于那些用10μg/ml标准的天蚕素产生的抗微生物噬菌斑(4.25mm)但小于用100μg/ml标准的天蚕素产生的抗微生物噬菌斑(8mm)。
结论是，通过在培养过程中暴露于铜绿假单胞菌诱导后，在丝光绿蝇的血淋巴中发现了抗细菌活性。
参考文献OT′oole，G.A.和Kolter，R.(1999)，通过多重的、收敛的信号途径引发荧光假单胞菌WCS365中生物薄膜的形成一种遗传分析，Molecular Microbiology 28449-461.
Sherman，R.A.和Tran，J.M.(1995)，用于饲养丝光绿蝇(Diptera；Calliphoridae)幼虫的简单的无菌食物来源，Medical andVeterinary Entomology 9393-398.
Thomas，S.，Andrews，A.M.，Hay，N.P.和Bourgoise，S.(1999)蛆分泌物的抗微生物活性初步研究的结果，J.Tissue Viability 9127-132.
Hoffmann，J.A.，Kefatos，F.C.，Janeway，C.A.和Ezekowitz，R.A.B.(1999)，先天免疫中的系统发育前景，Science 2841313-1318.
权利要求
1.一种处理聚集了能产生生物薄膜的细菌的表面的方法，其包括使获自丝光绿蝇分泌物/排泄物的具有N-酰基高丝氨酸内酯降解活性的物质与表面接触。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的表面选自金属表面、玻璃表面和塑料材料的表面。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述的表面为医疗装置或植入物的表面。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的表面为伤口表面。
5.根据权利要求1到4中任意一项的方法，其中所述的能够产生生物薄膜的细菌为铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌。
6.根据权利要求1到5中任意一项的方法，其中在包括另外一或多种抗生素化合物的组合物中提供所述的物质。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的抗生素化合物为四环素。
8.一种包括分离自丝光绿蝇的分泌物/排泄物或其类似物以及一种或多种抗生素化合物的抗微生物的组合物。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述的抗生素化合物为四环素。
10.一种抗微生物的组合物，它包括作为活性成分的分离自丝光绿蝇的分泌物/排泄物的具有N-酰基高丝氨酸内酯-降解活性的物质或其类似物以及载体。
11.一种抗微生物的组合物，它包括作为活性成分的分离自丝光绿蝇的分泌物/排泄物的丝氨酸蛋白酶或其类似物以及载体。
12.一种抗微生物的组合物，其包括作为活性成分的分离自丝光绿蝇的分泌物/排泄物的糖苷酶或其类似物以及载体。
13.一种抗微生物的组合物，其包括作为活性成分的分离自丝光绿蝇的分泌物/排泄物的具有无蚕素类活性的物质或其类似物以及载体。
14.根据权利要求10到13中任意一项的组合物，它还含有一种或多种抗生素化合物。
15.根据权利要求14的组合物，其中所述的抗生素化合物为四环素。
16.一种含有获自丝光绿蝇幼虫的无细胞血淋巴的抗微生物组合物，其中让丝光绿蝇幼虫生长在存在铜绿假单胞菌或所述血淋巴的一种或多种活性组分或该组分的合成类似物的条件下。
17.一种含有权利要求8到16中任意一项的组合物以及载体的伤口敷料。
全文摘要
本发明提供了通过与具有N－酰基高丝氨酸内酯降解活性的物质接触来处理聚集了能产生生物薄膜的细菌的表面，其中所述的具有N－酰基高丝氨酸内酯降解活性的物质获自丽蝇、丝光绿蝇(Luciliasericata)幼虫的分泌物和/或排泄物。此外，当所述的幼虫分泌物/排泄物与抗生素，例如四环素结合使用时可获得协同作用。这些获自丝光绿蝇幼虫分泌物和/或排泄物的具有N－酰基高丝氨酸内酯降解活性的物质也构成了本发明的一部分。
文档编号A61L15/44GK1649606SQ03809944
公开日2005年8月3日 申请日期2003年3月6日 优先权日2002年3月9日
发明者D·I·普里查德 申请人:英国国防部